專利名稱：α-hordothionin的高甲硫氨酸衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及飼料制劑的改善，本發(fā)明尤其涉及能夠在植物中提供較高百分含量的甲硫氨酸的α-hordothionin衍生物。發(fā)明背景使用飼料制劑為動物提供對其生長起關(guān)鍵作用的必需營養(yǎng)物質(zhì)是必要的。然而，農(nóng)作物植物一般說來是低營養(yǎng)質(zhì)量的食物來源，因為它們含有低比例的某些氨基酸，而這些氨基酸對動物來說是必不可少的，但又無法自身合成。
多年以來研究者們曾經(jīng)試圖通過雜交計劃來改善重要的農(nóng)作物蛋白質(zhì)中必需氨基酸的平衡。隨著更多地有關(guān)貯藏蛋白質(zhì)和編碼這些蛋白質(zhì)的基因表達的知識得到了解，以及隨著適用于更多種類植物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展，利用分子途徑改善種子蛋白質(zhì)營養(yǎng)質(zhì)量為比較傳統(tǒng)的途徑提供了另外的選擇。因此，在某一給定的農(nóng)作物中的特殊氨基酸水平可以通過生物工程學(xué)方法得到增加。
一種可供選擇的方法是在大量的足以免除食物或飼料添加劑的水平上來表達一種含有想要的氨基酸組合物的異源蛋白質(zhì)。例如，許多富含含硫氨基酸的種子蛋白質(zhì)已經(jīng)得到鑒定。這些蛋白質(zhì)很好地表達的關(guān)鍵涉及具有種子特異性啟動子的有效的表達盒。不僅基因控制區(qū)域必須指導(dǎo)高水平的信使RNA的合成，而且信使RNA必須被翻譯成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。
在動物營養(yǎng)必需的氨基酸中，農(nóng)作物經(jīng)常缺乏的是甲硫氨酸，蘇氨酸和賴氨酸。通過育種，突變篩選和/或改變農(nóng)作物中積累的貯藏蛋白質(zhì)的組成來增加這些自由氨基酸的水平的努力很少曾取得成功。通常轉(zhuǎn)基因貯藏蛋白質(zhì)的表達水平太低。菜豆蛋白啟動的巴西堅果2S表達盒是一個有效的嵌合種子特異性基因的例子，然而，雖然巴西堅果蛋白質(zhì)中增加了總的甲硫氨酸和結(jié)合甲硫氨酸的數(shù)量，由此改善了營養(yǎng)價值，但是對于積累在種子中的甲硫氨酸總量似乎有一個閾值限制。其種子作為甲硫氨酸的來源仍然是不充足的。
另一種通過改變含有希望得到的氨基酸的蛋白質(zhì)水平來增加特殊氨基酸水平的可供選擇的方法是對氨基酸的生物合成進行修飾。重組DNA和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)已被用于改變氨基酸生物合成途徑中催化關(guān)鍵步驟的酶的活性。Glassman，美國專利申請?zhí)朜O.5,258,300；Galili等，歐洲專利申請?zhí)朜O.485970；(1992)；在此全文引入作為參考。然而，種子中氨基酸水平的修飾并不總是與結(jié)合這些氨基酸的蛋白質(zhì)水平的變化有關(guān)。Burrow等，Mol.Gen.Genet.Vol.241；pp.431-439；(1993)；在此全文引入作為參考。雖然通過選擇DHDPS突變體或者將大腸桿菌(E.Coli)DHDPS在植物中進行表達能夠使葉子中游離氨基酸的水平得到顯著增加，但仍顯示出這些改變只能增加代表著占氨基酸總量大約90％左右的靶結(jié)合氨基酸，對種子的營養(yǎng)價值只有極小的影響。
基于前述的原因，有必要尋找方法增加植物種子中甲硫氨酸、賴氨酸和蘇氨酸等必需氨基酸的水平。
因此，本發(fā)明的目的之一正是為通過植物遺傳修飾來增加植物中必需氨基酸甲硫氨酸的水平提供方法。
本發(fā)明更深入的目的是提供與同類種子的野生型相比，具有更高水平必需氨基酸甲硫氨酸的種子作為食物和/或飼料。發(fā)明內(nèi)容已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一類化合物，α-hordothionins，可被修飾以增加它們的甲硫氨酸含量。α-hordothionin是一種已經(jīng)得到充分認識的45個氨基酸的蛋白質(zhì)，它可以從大麥(Hordeum vulgare)種子中分離得到。其分子由于8個半胱氨酸殘基形成的4個二硫鍵而保持穩(wěn)定，序列I.D.NO.1提供了其氨基酸序列。在天然形式下，些蛋白質(zhì)尤其富含精氨酸和賴氨酸殘基，分別含有5個殘基(10％)，但它缺乏必需氨基酸甲硫氨酸。
此蛋白質(zhì)已被人工合成，并且其三維結(jié)構(gòu)已通過計算機模型得到確定。蛋白質(zhì)模型表明10個帶電荷的殘基(位置5，10，17，19和30上的精氨酸及位置1，23，32，38和45上的賴氨酸)都出現(xiàn)在分子的表面。極性氨基酸(位置11上的天冬酰胺，位置22上的谷氨酰胺和位置41上的蘇氨酸)的側(cè)鏈也出現(xiàn)在分子的表面上，再者，疏水氨基酸(例如位置8，15，24和33上的亮氨酸及位置18上的纈氨酸的側(cè)鏈)也是靠近溶劑的。
蛋白質(zhì)的三維模型顯示出位置10上的精氨酸殘基對于保持合適的三維結(jié)構(gòu)和通過其與蛋白質(zhì)C-末端殘基的氫鍵作用進行合理的折疊是非常關(guān)鍵的。在這一位點上替換成甲硫氨酸會打破涉及位置10上的精氨酸，位置2上的絲氨酸和位置45上的賴氨酸的氫鍵，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的破壞。具有這種替換的合成多肽無法正確折疊，更加支持了這一分析。位置10上的精氨酸殘基的保留提供了正確折疊的蛋白質(zhì)。
由于甲硫氨酸是一個疏水氨基酸，位置8，15，和33上的亮氨酸及位置18上的纈氨酸等表面疏水氨基酸可被甲硫氨酸替換。位置11上的天冬酰胺，位置22上的谷氨酰胺及位置41上的蘇氨酸等表面極性氨基酸也可被甲硫氨酸替換。形成的化合物具備序列I.D.NO.2中顯示的序列，其分子通過固相多肽合成法進行合成并折疊成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。它含有7個甲硫氨酸殘基(15.5％)，并且包括8個半胱氨酸，被修飾后的蛋白質(zhì)含有33％的含硫氨基酸。
雖然序列I.D.NO.2在本發(fā)明中進行了繪圖說明，但并不打算就此為止。甲硫氨酸的替換還可以在含有帶電荷的氨基酸的位置上進行，只有位置10上的精氨酸對于通過其與位置2上的絲氨酸及位置45上的賴氨酸形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)來保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是極關(guān)鍵的。因而，我們可以把位置1，23，32和/或38上的賴氨酸及位置5，17，19和/或30上的精氨酸替換為甲硫氨酸，最后形成的化合物具有序列I.D.NO.3中顯示的序列。
化合物的合成按照本領(lǐng)域中熟知的多肽合成方法進行，因而不構(gòu)成本發(fā)明的一部分。正如Rao等于Int.J.Pep.Prot.Res.；Vol.40；pp508-515；(1992)上發(fā)表的那樣，在體外，化合物利用包含hbtu[2-(1h-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate的fastmocTM化學(xué)，在應(yīng)用生物系統(tǒng)431a型多肽合成儀上進行合成，在此全文引入作為參考。多肽按照標準規(guī)程進行切割，通過反相色譜利用標準方法進行純化。每個多肽的氨基酸順序利用自動Edman降解在應(yīng)用生物系統(tǒng)477a蛋白質(zhì)順序儀/120a pth分析儀上進行測定。然而，更優(yōu)選的是本發(fā)明的化合物在細菌或植物細胞內(nèi)進行合成，這些細胞已經(jīng)被轉(zhuǎn)化插入了含有合成基因的表達盒，此合成基因在被轉(zhuǎn)錄和翻譯時將產(chǎn)生出所希望的化合物。這種空的表達盒是為人熟知的，它為植物或細菌表達所希望的序列提供了合適的調(diào)控序列，同時合成基因，RNA或DNA，的核苷酸序列可以方便地利用標準的參照系統(tǒng)從蛋白質(zhì)的氨基酸順序推導(dǎo)出來。此合成基因?qū)?yōu)選地使用植物優(yōu)先的密碼子的增強所希望的蛋白質(zhì)的表達。工業(yè)應(yīng)用性以下的描述進一步舉例說明了本發(fā)明的組合物以及制造和使用它們的方法。然而，應(yīng)當知道的是被本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所了解的相當?shù)钠渌椒ㄒ部梢允褂?。植物編碼這些化合物的基因可以插入到合適的表達盒中，并被引入到植物細胞中。如此，本方法特別優(yōu)選的實施方案涉及將一段DNA序列以及在植物中具有活性的轉(zhuǎn)錄起始因子和啟動子順序插入到植物的基因組中，此DNA序列在適當?shù)拈喿x框架下，可以編碼本發(fā)明中的化合物。在此調(diào)控順序控制下的DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯導(dǎo)致了此蛋白質(zhì)序列在植物組織中的高效表達，從而產(chǎn)生出超量的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選的轉(zhuǎn)化植物是谷類作物，包括玉米、黑麥、大麥、小麥、高梁、燕麥、小米、大米、黑小麥、向日葵、紫苜蓿、油菜籽和大豆。
此時可以制備編碼適當氨基酸順序的合成DNA序列，并且此合成DNA序列可以被插入到合適的植物表達盒中。
同樣地，許多植物表達盒和載體在本領(lǐng)域中是人所共知的?！氨磉_盒”這個術(shù)語的意思是指一個包括起始、啟動子和終止子序列的一整套的控制序列，當它們插入到一個具有適當?shù)拈喿x框架的結(jié)構(gòu)基因之側(cè)翼時，就會在植物的細胞中起作用。表達盒通常并且優(yōu)選地含有各種可供選擇的適合于切開和插入任何希望的結(jié)構(gòu)基因的限制性位點。重要的是克隆的基因必須有一個在正確閱讀框架內(nèi)的結(jié)構(gòu)序列的起始密碼子。
另外，植物表達盒優(yōu)選地應(yīng)在某一末端包含一個強組成型啟動子序列，使基因得以高頻率地轉(zhuǎn)錄，在另一末端含有一個多聚腺核苷酸識別序列，以使信使RNA得到恰當?shù)募庸ず娃D(zhuǎn)運。Pioneer Hi-BredInternational，Inc.Johnston，IA的Beach等人開發(fā)的pPHI 414質(zhì)粒就是這樣一個優(yōu)選的(空的)表達盒的例子，本發(fā)明的cDNA可被插入到此表達盒中，pPHI 414質(zhì)粒公開于美國專利申請?zhí)朜O.07/785,648，(1991)上，在此全文引入作為參考。高度優(yōu)選的植物表達盒將被設(shè)計包含有一個或多個選擇標記基因，例如卡那霉素抗性或除草劑耐受性的基因。
術(shù)語“載體”的意思在此是指一段DNA序列，它可以在宿主細胞內(nèi)復(fù)制并表達一個外來的基因。載體通常含有一個或者多個內(nèi)切酶識別位點，這些位點可以用合適的酶以一種可預(yù)測的方式進行切割，這種載體優(yōu)選地被構(gòu)建成含有附加的帶有抗生素或除草劑抗性的結(jié)構(gòu)基因序列，作為鑒定和分離轉(zhuǎn)化后的細胞的標記物。優(yōu)選的標記物/篩選劑包括卡那霉素、chlorosulfuron、phosphonothricin，潮霉素和氨甲蝶呤。細胞中載體的外來遺傳物質(zhì)被功能性地表達后，此細胞即已被載體轉(zhuǎn)化并且被稱為“轉(zhuǎn)化株”。
一種特別優(yōu)選的載體是質(zhì)粒，質(zhì)粒是一個存在于細胞染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子。
如上所述，無論編碼興趣基因的是基因組基因還是cDNA都可用于本發(fā)明中。感興趣的載體也可以由部分cDNA克隆和部分基因組基因構(gòu)建而成。當興趣基因被分離出來后，對基因進行遺傳構(gòu)建使之含有必需的調(diào)控順序，從而使基因在宿主細胞內(nèi)能夠有效地表達。根據(jù)本發(fā)明，遺傳構(gòu)建物將含有(a)一段首要的編碼感興趣的蛋白質(zhì)或特征的遺傳序列，(b)可操作地連接在感興趣的結(jié)構(gòu)基因任何一端的一個或多個調(diào)控順序。通常調(diào)控順序?qū)⑦x自啟動子種終止子之一。調(diào)控順序可以來源于同種或異種。
可以用在遺傳序列中的啟動子包括NOS，OCS和CaMV啟動子。
可使用的有效的植物啟動子是高產(chǎn)植物啟動子。在本發(fā)明中可使用的高產(chǎn)植物啟動子包括葉綠素α-β結(jié)合蛋白啟動子和大豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ss)的啟動子，參看例如Berry-Lowe等，J.Molecular and App.Gen.，Vol.1；pp.483-498；(1982)，在此全文引入作為參考。據(jù)悉這兩個啟動子在植物細胞中是光誘導(dǎo)的。參看例如An Agricultural Perspective，A.Cashmore，Pelham，New York；1983，pp29-38，G.Coruzzi等，J.Biol.Chem.，Vol.258；p.1399；(1983)；以及P.Dunsmuir等，J.Molecular and App.Gen.；Vol 2；p.285；(1983)；都在此全文引入作為參考。
包含被可操作地連接在所希望的控制順序上的本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的表達盒可以被連接入適當?shù)目寺≥d體中。一般使用源自與宿主細胞相容的物種的含有復(fù)制和控制順序的質(zhì)?；虿《?噬菌體)載體。克隆載體通常將帶有一個復(fù)制起點，以及能夠在轉(zhuǎn)化后的宿主細胞中提供表型選擇標記的特殊基因，通常使用能賦予抗生素或挑選的除草劑抗性的基因。遺傳物質(zhì)被引入靶細胞后，成功地被轉(zhuǎn)化的細胞和/或細胞克隆可以通過這些標記進行篩選從而得到分離。
通常為了增加克隆載體的拷貝數(shù)量，在本發(fā)明的實踐中將使用一個中間宿主細胞。有了增加的拷貝數(shù)量，含有興趣基因的載體就可以被大量地分離以便于引入到所希望的植物細胞中?？捎糜诒景l(fā)明實踐中的宿主細胞包括原核生物，包括細菌宿主例如大腸桿菌(E.Coli)，鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)，和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)。真核宿主例如酵母或絲狀真菌也可以用于本發(fā)明中。由于這些宿主也是微生物，必須保證在載體中使用無法引起細菌本身蛋白質(zhì)表達的植物啟動子。
然后，分離的克隆載體將利用適當?shù)募夹g(shù)引入到植物細胞中，這些技術(shù)包括電穿孔(在原生質(zhì)體中)，逆病毒、粒子輻射、和顯微注射到單子葉或雙子葉植物的細胞或組織培養(yǎng)物中以提供轉(zhuǎn)化的植物細胞，這些細胞含有作為外來DNA的至少一個拷貝的植物表達盒DNA序列。優(yōu)選地，單子葉的品種將選自玉米、高梁、小麥或大米，而雙子葉的品種將選自大豆、紫苜蓿、油菜籽、向日葵或蕃茄。利用已知的技術(shù)，原生質(zhì)體可以被再生，細胞和組織培養(yǎng)物也可被再生從而生成完整的可繁殖的植物，此種植物攜帶并且表達本發(fā)明中蛋白質(zhì)的基因。因此，本發(fā)明高度優(yōu)選的實施方案是一種轉(zhuǎn)化后的玉米植物，其細胞中含有作為外來DNA的至少一個拷貝的本發(fā)明的表達盒的DNA序列。
普通技術(shù)人員將會欣賞的是這里提供的植物載體可被引入到根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中，然后利用其將載體轉(zhuǎn)入到易感植物細胞中，這些植物細胞主要來自雙子葉的物種。至此，本發(fā)明提供了增加根癌土壤桿菌一易感的雙子葉植物中甲硫氨酸水平的一個方法，其中通過利用其質(zhì)粒已經(jīng)過修飾因而包含有一個本發(fā)明中的植物表達盒的根癌土壤桿菌來感染細胞，從而將表達盒引入到細胞中去。
序列表(1)一般資料(i)申請人Pioneer Hi-Bred International.Inc.
(ii)發(fā)明名稱Alpha-Hordothionin的高甲硫氨酸衍生物(iii)序列數(shù)目3(iv)通訊地址(A)稱呼Pioneer Hi-Bred International.Inc.
(B)街道700Capital Square，400 Locust Street.
(C)城市Des Moines(D)州Iowa.
(E)國家United States of America.
(F)郵編(ZIP)50309.(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，Version#1.25(vi)通用申請資料(A)申請?zhí)朠CT(B)存檔日期(C)分類(viii)律師/事務(wù)所資料(A)姓名Simon，Soma G.
(B)注冊號37,444(C)參考文獻/摘要號355-US(ix)電信資料(A)電話515-248-4896(B)電傳515-248-4844(2)SEQ ID NO.1的資料(i)序列特征(A)長度45個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO.1Lys Ser Cys Cys Arg Ser Thr Leu Gly Arg Asn Cys Tyr Asn LeuCys1 5 10 15Arg Val Arg Gly Ala Gln Lys Leu Cys Ala Gly Val Cys Arg CysCys20 25 30Leu Thr Ser Ser Gly Lys Cys Pro Thr Gly Phe Pro Lys35 40 45(2)SEQ ID.NO.2的資料(i)序列特征(A)長度45個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO.2Lys Ser Cys Cys Arg Ser Thr Met Gly Arg Met Cys Tyr ASn MetCys1 5 10 15Arg Met Arg Gly Ala Met Lys Leu Cys Ala Gly Val Cys Arg CysLys20 25 30Met Thr Ser Ser Gly Lys Cys Pro Met Gly Phe Pro Lys35 40 45(2)SEQ ID NO.3的資料(i)序列特征(A)長度45個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO.3Met Ser Cys Cys Met Ser Thr Met Gly Arg Met Cys Tyr Asn MetCys1 5 10 15Met Met Met Gly Ala Met Met Met Cys Ala Gly Val Cys Met CysMet20 25 30Met Thr Ser Ser Gly Met Cys Pro Met Gly Phe Pro Lys35 40 4權(quán)利要求
1.一種具有序列I.D.NO.3之序列的蛋白質(zhì)，其中位置1，5，8，11，15，17，18，19，22，23，24，30，32，33，38和41上的一個或多個位置上的氨基酸殘基是甲硫氨酸，并且這些位置上的余留殘基為序列I.D.NO.1中相應(yīng)位置上的殘基。
2.權(quán)利要求1中的蛋白質(zhì)，其中位置8，11，15，18，22，33和41上的一個或多個氨基酸殘基是甲硫氨酸。
3.權(quán)利要求2中的蛋白質(zhì)，其中位置8，11，15，18，22，33和41上至少有3個氨基酸殘基是甲硫氨酸。
4.權(quán)利要求3中的蛋白質(zhì)，其中位置8，11，15，18，22，33和41上至少有5個氨基酸殘基是甲硫氨酸。
5.一段編碼具有序列I.D.NO.2之序列的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中位置1，5，8，11，15，17，18，19，22，23，24，30，32，33，38和41上的一個或多個位置上的氨基酸殘基是甲硫氨酸，并且這些位置上的余留殘基為序列I.D.NO.1中相應(yīng)位置上的殘基。
6.一段編碼具有序列I.D.NO.2之序列的蛋白質(zhì)的RNA序列，其中位置1，5，8，11，15，17，18，19，22，23，24，30，32，33，38和41上的一個或多個位置上的氨基酸殘基是甲硫氨酸，并且這些位置上的余留殘基為序列I.D.NO.1中相應(yīng)位置上的殘基。
7.一段編碼具有序列I.D.NO.3之序列的蛋白質(zhì)的DNA序列，其中位置1，5，8，11，15，17，18，19，22，23，24，30，32，33，38和41上的一個或多個位置上的氨基酸殘基是甲硫氨酸，并且這些位置上的余留殘基為序列I.D.NO.1中相應(yīng)位置上的殘基。
8.一種含有權(quán)利要求7中的DNA序列的表達盒，被可操作地連接到植物調(diào)控順序上，從而引起DNA序列在植物細胞中的表達。
9.一種含有一個權(quán)利要求8中表達盒的細菌轉(zhuǎn)化載體，被可操作地連接到細菌表達調(diào)控順序上，從而引起此表達盒在細菌中的復(fù)制。
10.細菌細胞，含有作為外來質(zhì)粒的至少一個拷貝的權(quán)利要求9中的細菌轉(zhuǎn)化載體。
11.轉(zhuǎn)化的植物細胞，含有至少一個拷貝的權(quán)利要求8中的表達盒。
12.權(quán)利要求11中的轉(zhuǎn)化植物細胞，其中細胞屬于單子葉的物種。
13.權(quán)利要求12中的轉(zhuǎn)化植物細胞，其中細胞選自玉米、高梁、小麥和大米細胞之一。
14.權(quán)利要求11中的轉(zhuǎn)化細胞，其中細胞屬于雙子葉的物種。
15.權(quán)利要求14中的轉(zhuǎn)化細胞，其中細胞選自大豆、紫苜蓿、油菜籽、向日葵、煙草和蕃茄細胞之一。
16.一種包括權(quán)利要求13中細胞的玉米細胞或組織培養(yǎng)物。
17.一種增加植物細胞或種子中甲硫氨酸含量的方法，包括在細胞或種子中表達權(quán)利要求1中蛋白質(zhì)的步驟。
18.一種權(quán)利要求17中的方法，其中植物是雙子葉的植物。
19.一種權(quán)利要求17中的方法，其中植物是單子葉的植物。
20.一種權(quán)利要求19中的方法，其中植物種子中的甲硫氨酸含量得到增加。
全文摘要
通過利用甲硫氨酸殘基進行位置特異性替換產(chǎn)生α－Hordothionin的衍生物,在植物中提供豐富的蘇氨酸。
文檔編號C12R1/91GK1192239SQ96195938
公開日1998年9月2日 申請日期1996年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月2日
發(fā)明者G·A·拉奧 申請人:先鋒高級育種國際公司