專利名稱：一種n－乙?；腚装彼嵫苌锱c應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及N-乙?；腚装彼嵫苌锱c應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)藥物如胰島素、干擾素具有作用專一、高效等特點(diǎn)，在人類疾病治療中發(fā)揮重要的作用。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的全面展開，將會(huì)有越來越多的蛋白質(zhì)藥物用于疾病治療。然而蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性差，易于產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)和蛋白酶降解，腎臟排除速度快，血漿清除率高，體內(nèi)半衰期較短，因此限制了蛋白質(zhì)藥物的臨床應(yīng)用。
二十世紀(jì)90年代末，國外醫(yī)藥研究人員開始利用一名為“聚乙二醇化”的新技術(shù)來改造蛋白質(zhì)藥物。聚乙二醇[Poly(ethylene glycol)，PEG]具有很強(qiáng)的親水性和柔韌性，在水溶液中具有較大的排水體積，通常是無毒性、無免疫原性的。“聚乙二醇化”技術(shù)是將聚乙二醇分子連接到蛋白質(zhì)分子表面上，從而可以保護(hù)蛋白質(zhì)不受免疫系統(tǒng)和酶類的進(jìn)攻。與蛋白質(zhì)相比較，PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物的免疫原性和抗原性降低，同時(shí)血漿清除率降低，體內(nèi)半衰期延長。
Davis等人在美國專利4,179,337中公開了將聚乙二醇(PEG)與蛋白質(zhì)如胰島素和酶結(jié)合以得到結(jié)合物，其中的蛋白質(zhì)免疫原性較小并保留了大部分的生理活性。Nakagawa等人在美國專利4,791,192中公開了將PEG與胰島活化蛋白質(zhì)結(jié)合以降低其副作用和免疫原性。Abuchowski等人在″Enzymes as Drugs″(1981)中闡述了PEG修飾的多肽能夠顯著降低了免疫原性和抗原性，延長體內(nèi)半衰期，修飾后的多肽如酶類產(chǎn)品將會(huì)在多種治療領(lǐng)域中發(fā)揮作用。將PEG和其它聚合物與重組蛋白質(zhì)結(jié)合可降低免疫原性，增大半衰期。參見Nitecki等人的美國專利4,902,502；Enzon，Inc的國際申請(qǐng)PCT/US 90/02133；Nishimura等人的歐洲專利申請(qǐng)154,316以及Tomasi的國際申請(qǐng)PCT/US 85/02572。Veronese等人在文獻(xiàn)(Applied Biochem andBiotech，11，141-152(1985))中公開了用氯甲酸苯酯類化合物活化聚乙二醇以修飾核糖核酸酶和過氧化物歧化酶。King等人在文獻(xiàn)(Int.Archs.Allsrgy Appl.Immun.66，439-446(1981))描述了一種用O-(RO-PEG)-S-甲酰氨基甲基-二硫代碳酸酯中間體使蛋白質(zhì)與PEG鍵合的方法。
Alipsky等人在US5,122,614中強(qiáng)調(diào)PEG修飾蛋白質(zhì)的過程中，PEG的活性基團(tuán)應(yīng)滿足如下條件1)活性基團(tuán)的活性要高，可以在溫和的條件下使PEG與蛋白質(zhì)快速發(fā)生結(jié)合反應(yīng)；2)修飾反應(yīng)后，活性部位釋放出來的副產(chǎn)物應(yīng)是無毒性性的，或可以很容易從產(chǎn)品中分離出去。
此外，修飾反應(yīng)應(yīng)有較高的專一性，避免產(chǎn)生低活性或無活性的PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物；修飾步驟應(yīng)盡量簡單，純化步驟應(yīng)盡可能的少。
在PEG與蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)中，常用的活性基團(tuán)包括琥珀酰亞胺的酯基(N-hydroxysuccinimide，NHS)、醛基、三氟磺酸酯基、對(duì)硝基苯碳酸酯基及苯肼三唑碳酸酯基等。其中，對(duì)硝基苯碳酸酯基的主要缺點(diǎn)是反應(yīng)副產(chǎn)物毒性高；苯肼三唑碳酸酯基的活性低、修飾反應(yīng)時(shí)間長(48-72hr pH8.5)，而且價(jià)格昂貴(Beauchamp，et al.Analyt.Biochem.131，25-33(1983))；醛基主要用于多肽氨基末端的修飾，專一性高，但通常需要進(jìn)行兩步反應(yīng)即修飾反應(yīng)和還原反應(yīng)；琥珀酰亞胺的酯基活性高、反應(yīng)條件溫和，是目前應(yīng)用最廣的活性基團(tuán)，其不足之處是盡管以修飾多肽上的氨基為主，但還可以修飾組氨酸上咪唑基、絡(luò)氨酸上的羥基等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種N-乙?；腚装彼嵫苌?。
本發(fā)明所提供的N-乙?；腚装彼嵫苌?，具有式I結(jié)構(gòu)， 式I其中，POLY為分子量范圍在1000Da～500,000Da之間的聚烷基二醇，及其二元共聚物、三元共聚物、混合共聚物，包括聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇丙二醇的二元共聚物。
優(yōu)選的所述N-乙?；腚装彼嵫苌锝Y(jié)構(gòu)式為式II， (式II)
其中，n為25-4000之間的正整數(shù)；R為氫、碳原子數(shù)為1-10的烷基、芐基、CH2＝CH2-CH2-、CH2＝CH-CO-、或(CH3)3-O-CONH-CH2-CH2-；Y為-O-、-S-、-NHCO-、-CONH-、-COO-、-OCO-、-NHCO2-、或-O2CNH-；R1為H或甲基；R2為H或甲基；m為0-5之間的正整數(shù)。
式II中n優(yōu)選為113-1500之間的正整數(shù)；R1優(yōu)選為H，R2優(yōu)選為H；R優(yōu)選為甲基；Y優(yōu)選為-O-；m為0-5之間的正整數(shù)，m更優(yōu)選為1-5之間的正整數(shù)，更有效地，m為2。
本發(fā)明的N-乙酰基半胱氨酸衍生物還可以為結(jié)構(gòu)式為式III的化合物， (式III)其中，n1、n2分別為25-4000之間的正整數(shù)，優(yōu)選為113-1500的正整數(shù)；m1、m2分別為0-5的正整數(shù)，優(yōu)選為1-5之間的正整數(shù)，更優(yōu)選地，m為2。
本發(fā)明N-乙?；腚装彼嵫苌锞梢杂帽绢I(lǐng)域的常規(guī)方法合成，例如，mPEG類的N-乙?；腚装彼嵫苌?R為甲基，R1、R2為H)制備過程主要包括1)mPEG-OH的活化，例如用甲磺酰氯與mPEG-OH反應(yīng)，將其活化生成mPEG-甲磺酰酯；2)將所得mPEG-甲磺酰酯與羥基(巰基)酸酯反應(yīng)生成mPEG-酸酯，mPEG-酸酯經(jīng)水解反應(yīng)生成mPEG-酸；3)mPEG-酸在甲苯、二氯甲烷等有機(jī)溶劑中與亞硫酰氯反應(yīng)生成mPEG-酰氯；4)mPEG-酰氯與N-乙酰半胱氨酸(NAC)反應(yīng)即可以得到mPEG-NAC。
或者，也可以采用另外一條合成途徑1)mPEG-OH或mPEG-NH2三光氣、丙烯酰氯、雙酰氯化合物等反應(yīng)，直接得到mPEG-酰氯；2)mPEG-酰氯與N-乙酰半胱氨酸(NAC)反應(yīng)即可以得到mPEG-NAC。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明N-乙?；腚装彼嵫苌锏挠猛尽?br> 本發(fā)明所提供的N-乙?；腚装彼嵫苌镏饕糜谛揎椀鞍踪|(zhì)或多肽中的氨基，修飾產(chǎn)物穩(wěn)定，有利于蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)品的長期保存，可以作為蛋白質(zhì)或多肽的修飾劑。
本發(fā)明的功能化PEG(N-乙酰基半胱氨酸衍生物)的優(yōu)點(diǎn)可以體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面其一，主要修飾蛋白質(zhì)或多肽中的氨基，從而具有較高的選擇性和專一性；其二，具有較高的反應(yīng)活性，可以在溫和的條件下與蛋白質(zhì)或多肽發(fā)生修飾反應(yīng)，修飾過程操作簡便；其三，反應(yīng)后生成的主要副產(chǎn)物是NAC，沒有任何毒副作用；其四，PEG一般與多肽間形成穩(wěn)定的連接物，有利于產(chǎn)品的長期保存，可以廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽等藥物的修飾。


圖1為mPEG20k-(CH2)2-CO-NAC修飾干擾素α-2a的電泳圖。
圖2為mPEG5k-(CH2)2-CO-NAC修飾牛血紅蛋白的電泳圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例對(duì)于本專業(yè)技術(shù)人員而言，很容易從中推出式II中R為其他的低級(jí)烷基如乙基、丙基、異丙基等的N-乙?；腚装彼嵫苌锏闹苽涔に嚒?br> 實(shí)施例1、制備mPEG5k-O-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為氧原子；m為0；n為113)取5.0g的mPEG5k溶于30ml二氯甲烷和15ml甲苯的混合液中，加入三光氣1.53克，混合均勻，加入無水三乙氨0.8ml，攪拌反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液減壓抽真空，濃縮至干后加入150ml冷乙醚沉淀。將沉淀溶解到10ml甲苯和15ml二氯甲烷的混合液中，加入N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)0.33克，滴加三乙胺0.3ml，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干，加50ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到mPEG5k-O-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ4.35(t，2H，-O-CH2-CH2-O-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)；證明所得化合物正確。
實(shí)施例2、制備mPEG10k-O-CH2-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為氧原子；m為1；n為227)a)甲氧基聚乙二醇10000-乙酸(mPEG10k-O-CH2-COOH)的合成取mPEG10k10.0克溶于150ml甲苯，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱共沸蒸餾至剩余體積約為100ml時(shí)停止加熱，溶液冷卻到室溫。將溶液加入到含有叔丁醇鉀0.3克的20ml叔丁醇和20ml甲苯的混合液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下向內(nèi)加入2.1mmol的2-溴代乙酸叔丁酯，反應(yīng)在室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)液過濾，抽真空濃縮至干。
將殘?jiān)谷?00ml的稀鹽酸中攪拌過夜，溶液反應(yīng)后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到3左右。用二氯甲烷進(jìn)行抽提，每次120ml，抽提3次，合并二氯甲烷抽提液，過濾后減壓濃縮至干，得到mPEG10k-O-CH2-COOH。
b)mPEG10k-O-CH2-CO-NAC的合成將mPEG10k-O-CH2-COOH溶解到150ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出50ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol無水吡啶和1.5mmol亞硫酰氯，回流4小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液抽真空，濃縮至干后加入220ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入100ml二氯甲烷溶解，先后加入0.5克NAC和0.45ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入80ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到mPEG10k-O-H2-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ4.21(s，2H，-O-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)；證明所得化合物正確。
實(shí)施例3、制備mPEG20k-O-CH2-CH2-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為氧原子；m為2；n為454)a)mPEG20k-O-(CH2)2-CN的合成取20.0g的mPEG20k溶于30ml 0.5N氫氧化鈉的水溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)。溶液冷卻到4℃后，加入丙烯氰10ml，攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性。溶液用二氯甲烷分三次抽提，每次50ml。合并抽提液，用硫酸鈉干燥。過濾后，真空減壓濃縮至干，得到mPEG20k-O-(CH2)2-CN。
b)甲氧基聚乙二醇20000-丙酸(mPEG20k-O-(CH2)2-COOH)的合成將上步制備得到的mPEG20k-O-(CH2)2-CN溶解到80ml濃鹽酸中，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。向溶液中加入5N氫氧化鉀溶液250ml，室溫?cái)嚢?4小時(shí)。用鹽酸將pH調(diào)節(jié)到3.0，用二氯甲烷分三次抽提，每次360ml。合并抽提液，用硫酸鈉干燥。過濾后，真空減壓濃縮至干，得到mPEG20k-O-(CH2)2-COOH。
C)mPEG20k-O-(CH2)2-CO-NAC的合成將上步制備的mPEG20k-O-(CH2)2-COOH溶解到320ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出110ml甲苯。向回流液中加入3.0mmol無水吡啶和3.0mmol亞硫酰氯，回流6小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液減壓抽真空，濃縮后加入360ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入180ml二氯甲烷溶解，先后加入1.1克NAC和0.8ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入180ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到mPEG20k-O-(CH2)2-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.9(t，2H，-O-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例4、制備mPEG40K-O-(CH2)3-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為氧原子；m為3；n為909)a)甲氧基聚乙二醇40000-甲磺酰酯(mPEG40K-O-SO2-CH3)的合成取40.0g的mPEG40k溶于500ml甲苯，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱共沸蒸餾至剩余體積約為350ml時(shí)停止加熱，溶液冷卻到室溫。溶液中先后加入二氯甲烷40ml、無水三乙基氨1.5mmol和無水甲磺酰氯1.5mmol混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢柽^夜，加入無水乙醇終止反應(yīng)?；旌先芤哼^濾，真空減壓濃縮后加入600ml乙醚進(jìn)行沉淀。產(chǎn)品過濾后真空濃縮至干，得到mPEG40K-O-SO2-CH3。
b)甲氧基聚乙二醇40000-丁酸叔丁酯(mPEG40K-O-(CH2)3-CO2-C4H9)的合成取4-羥基丁酸叔丁酯1.86克溶解到80ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱共沸蒸餾至剩余體積約為50ml時(shí)停止加熱，溶液冷卻到室溫后倒入溶解0.25克氫化鈉的20ml甲苯溶液中，混合均勻。溶液放置37℃水浴中攪拌5小時(shí)后，過濾，并冷卻到室溫。
將溶液與溶解有mPEG40K-O-SO2-CH3的200ml無水甲苯溶液進(jìn)行混合，125℃下，攪拌反應(yīng)25小時(shí)。反應(yīng)液真空濃縮后加入550ml冷乙醚沉淀，沉淀過濾，得到mPEG40K-O-(CH2)3-CO2-C4H9，真空保存。
c)甲氧基聚乙二醇40000-丁酸(mPEG40K-O-(CH2)3-COOH)的合成將上步所得到的mPEG40K-O-(CH2)3-CO2-C4H9倒入320ml稀鹽酸中攪拌過夜，溶液反應(yīng)后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到3左右。用二氯甲烷進(jìn)行抽提，每次300ml，抽提3次，合并二氯甲烷抽提液，過濾后減壓濃縮至干，得到mPEG40K-O-(CH2)3-COOH。
d)mPEG40K-O-(CH2)3-CO-NAC的合成將上步所制備得到的mPEG40K-O-(CH2)3-COOH解到700ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出250ml甲苯。向回流液中加入6.5mmol無水吡啶和6.5mmol亞硫酰氯，回流10小時(shí)后攪拌過夜。反應(yīng)液真空濃縮后加入550ml冷乙醚沉淀，沉淀過濾后加入380ml二氯甲烷溶解，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入350ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到mPEG40K-O-(CH2)3-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ1.9(m，2H，-O-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.57(t，2H，-O-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例5、制備mPEG5K-O-(CH2)5-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為氧原子；m為5；n為113)a)甲氧基聚乙二醇5000-甲磺酰酯(mPEG5K-O-SO2-CH3)的合成取5.0g的mPEG5k溶于80ml甲苯，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱共沸蒸餾至剩余體積約為50ml時(shí)停止加熱，溶液冷卻到室溫。溶液中先后加入二氯甲烷20ml、無水三乙氨1.5mmol和無水甲磺酰氯1.5mmol混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢柽^夜，加入無水乙醇終止反應(yīng)?；旌先芤哼^濾，真空減壓濃縮后加入90ml冷乙醚進(jìn)行沉淀。產(chǎn)品過濾后真空濃縮至干，得到mPEG5K-O-SO2-CH3。
b)甲氧基聚乙二醇5000-己酸叔丁酯(mPEG5K-O-(CH2)5-CO2-C4H9)的合成取6-羥基己酸叔丁酯2.1克溶解到80ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱共沸蒸餾至剩余體積約為50ml時(shí)停止加熱，溶液冷卻到室溫后倒入溶解0.25克氫化鈉的20ml甲苯溶液中，混合均勻。溶液放置37℃水浴中攪拌5小時(shí)后，過濾，并冷卻到室溫。
將溶液與溶解上步所制備的化合物mPEG5K-O-SO2-CH3的80ml無水甲苯溶液進(jìn)行混合，125度下，攪拌反應(yīng)25小時(shí)。將反應(yīng)液減壓抽真空，濃縮后加入100ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，晾干，得到mPEG5K-O-(CH2)5-CO2-C4H9。
c)甲氧基聚乙二醇5000-己酸(mPEG5K-O-(CH2)5-COOH)的合成將上步制備得到的mPEG5K-O-(CH2)5-CO2-C2H5倒入100ml稀鹽酸中攪拌過夜，溶液反應(yīng)后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到3左右。用二氯甲烷進(jìn)行抽提，每次100ml，抽提3次，合并二氯甲烷抽提液，過濾后減壓濃縮至干，得到mPEG5K-O-(CH2)5-COOH。
d)甲氧基聚乙二醇5000-己酸-NAC(mPEG5K-O-(CH2)5-CO-NAC)的合成將上步制備的mPEG5K-O-(CH2)5-COOH溶解到150ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出70ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol無水吡啶和1.5mmol亞硫酰氯，回流4小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液抽真空濃縮后加入120ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入50ml二氯甲烷溶解，先后加入0.33克NAC和0.3ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入45ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到mPEG5K-O-(CH2)5-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.24(m，5H，-OCH3，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ1.58(m，6H，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.55(t，2H，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例6、制備mPEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為硫原子；m為2；n為227)a)甲氧基聚乙二醇10000-甲磺酰酯(mPEG10K-O-SO2-OCH3)的合成取10.0g的mPEG10k溶于150ml甲苯，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱共沸蒸餾至剩余體積約為90ml時(shí)停止加熱，溶液冷卻到室溫。溶液中先后加入二氯甲烷25ml、無水三乙氨1.5mmol和無水甲磺酰氯1.5mmol混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢柽^夜，加入無水乙醇終止反應(yīng)。混合溶液過濾，真空減壓濃縮后加入250ml冷乙醚進(jìn)行沉淀。產(chǎn)品過濾后真空干燥保存，得到mPEG10K-O-SO2-OCH3。
b)甲氧基聚乙二醇10000-S-丙酸(mPEG10K-S-(CH2)2-COOH)的合成將上步制備的mPEG10K-O-SO2-OCH3溶解到40ml甲苯和60ml無水乙醇混合液中。將氫氧化鈉0.13克溶于10ml無水乙醇中，隨后加入到PEG溶液中。3-巰基丙酸乙酯3.0mmol加入到反應(yīng)液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，60℃加熱4小時(shí)，反應(yīng)后冷卻到室溫。過濾除不溶性鹽，減壓濃縮后加入180ml冷乙醚沉淀。沉淀過濾后溶解到100ml去離子水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至12，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入1N鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，溶液用二氯甲烷抽提3次，每次100ml。抽提液用硫酸鈉/硫酸鎂干燥，過濾。減壓濃縮后，加入400ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，真空干燥保存，得到mPEG10K-S-(CH2)2-COOH。
c)甲氧基聚乙二醇10000-S-丙酸-NAC(mPEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC)的合成將上步制備的mPEG10K-S-(CH2)2-COOH溶解到250ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出120ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol無水吡啶和1.5mmol亞硫酰氯，回流4小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液抽真空，濃縮至干后加入220ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入100ml二氯甲烷溶解，先后加入0.5克NAC和0.45ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入90ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到mPEG10K-S-(CH2)2-COOH。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例7、制備mPEG20K-NHCO-(CH2)2-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為-NHCO-；m為2；n為454)取20.0g的mPEG20k胺(SHEARWATER.CO)溶于180ml二氯甲烷中，加入丁二酰氯10.0mmol和1.4ml三乙胺，室溫下攪拌2小時(shí)，反應(yīng)液過濾，將濾液濃縮后用360ml乙酸乙酯沉淀。收集沉淀，加入180ml二氯甲烷溶解，先后加入2.0克NAC和1.5ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干；隨后，加150ml異丙醇，加熱至溶液透明；最后，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到mPEG20K-NHCO-(CH2)2-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.53(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CO-)，δ2.77(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例8、制備CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為-NHCO2-；m為4；n為909)a)CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-COOH的制備取40.0g的mPEG40k胺溶于350ml二氯甲烷中，加入2.58克三光氣和1.41ml三乙胺，攪拌反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液抽真空，濃縮后加入600ml冷乙醚沉淀。將所得沉淀溶解到80ml甲苯和120ml二氯甲烷的混合液中，加入5-羥基戊酸2.1克，滴加三乙胺1.45ml，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾，將濾液濃縮后溶解到150ml稀鹽酸中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至3.0，隨后用二氯甲烷分三次抽提，每次150ml，合并抽提液，減壓濃縮至干，得到CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-COOH。
b)CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-CO-NAC的制備將上步制備的CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-COOH溶解到650ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出200ml甲苯。向回流液中加入6.0mmol無水吡啶和6.0mmol亞硫酰氯，回流10小時(shí)后攪拌過夜。反應(yīng)液真空濃縮后加入550ml冷乙醚沉淀，沉淀過濾后加入380ml二氯甲烷溶解，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入360ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到CH3O-PEG40K-NHCO2-(CH2)4-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ3.98(t，2H，-NHCO2-CH2)，δ1.64(m，4H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.55(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例9、制備CH3O-PEG5K-OCO-(CH2)3-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為-OCO-；m為3；n為113)取5.0g的mPEG5k溶于50ml二氯甲烷中，加入戊二酰氯2.0g，無水三乙氨1.62ml攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)液減壓濃縮后倒入100ml冷乙醚中沉淀。收集沉淀，溶解到50ml二氯甲烷中，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至于；隨后，加50ml異丙醇，加熱至溶液透明；最后，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到CH3O-PEG5K-OCO-(CH2)3-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ4.35(t，2H，-O-CH2-CH2-OCO-)，δ2.32(t，2H，-OCO-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.62(t，2H，-OCO-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-COS-CH2-CH-)，δ2.02(m，5H，-NHCOCH3；-OCO-CH2-CH2-CH2-CO-)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例10、制備CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為-CONH-；m為2；n為227)a)CH3O-PEG10K-(CH2)2-COOH的制備依據(jù)實(shí)施例3的方法，制備mPEG10K-丙酸，即CH3O-PEG10K-(CH2)2-COOH。
b)CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-COOH的制備將上步制備的CH3O-PEG10K-(CH2)2-COOH溶解到250ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出120ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol無水吡啶和1.5mmol亞硫酰氯，回流4小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液抽真空，濃縮至干后加入220ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入100ml二氯甲烷溶解，先后加入3.0mmol 3-氨基丙酸和0.6mmol三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾，將濾液濃縮后倒入250ml乙酸乙酯中沉淀，收集沉淀，真空干燥保存，得到CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-COOH。
C)CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-CO-NAC的制備將上步制備的CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-COOH溶解到250ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出130ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol無水吡啶和1.5mmol亞硫酰氯，回流4小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液抽真空，濃縮至干后加入250ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入110ml二氯甲烷溶解，先后加入0.5克NAC和0.45ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。加入90ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到CH3O-PEG10K-(CH2)2-CONH-(CH2)2-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.49(t，2H，-CONH-CH2-CH2-CO-)，δ2.86(t，2H，-CONH-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-COS-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例11、制備CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為-COO-；m為5；n為454)a)CH3O-PEG20K-(CH2)2-COOH的制備依據(jù)實(shí)施例3，制備mPEG20K-丙酸，即CH3O-PEG20K-(CH2)5-COOH。
b)CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-COOH的制備將上步制備的CH3O-PEG20K-(CH2)5-COOH溶解到360ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出140ml甲苯。向回流液中加入1.5mmol無水吡啶和1.5mmol亞硫酰氯，回流4小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液抽真空濃縮至干，加入110ml二氯甲烷溶解，先后加入3.0mmol 6-羥基己酸和0.43ml三乙胺，室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)液過濾，將濾液濃縮后倒入冷乙醚中。收集沉淀，晾干，得到CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-COOH。
c)CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-CO-NAC的制備將上步制備的CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-COOH溶解到380ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出160ml甲苯。向回流液中加入3.0mmol無水吡啶和3.0mmol亞硫酰氯，回流6小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液減壓抽真空，濃縮后加入380ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入190ml二氯甲烷溶解，先后加入1.15克NAC和0.82ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入160ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到CH3O-PEG20K-(CH2)2-COO-(CH2)5-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.57(t，2H，-O-CH2-CH2-COO-)，δ3.98(t，2H，-COO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ1.58(m，6H，-COO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.55(t，2H，-COO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-COS-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例12、制備CH3O-PEG40K-(CH2)2-O2CNH-(CH2)2-CO-NAC(式II中R為甲基；R1、R2為氫原子；Y為-O2CNH-；m為2；n為909)取40.0g的mPEG40k溶于230ml二氯甲烷和110ml甲苯的混合液中，加入三光氣2.65g，混合均勻，加入無水三乙氨1.35ml，攪拌反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液減壓抽真空，濃縮至干。將所得殘?jiān)芙獾?00ml甲苯和160ml 1，4-二氧六環(huán)的混合液中，加入β-氨基丙酸5.0mmol，滴加三乙胺0.7ml，室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)液過濾，將濾液濃縮后用600ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，晾干。
將沉淀溶解到600ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出190ml甲苯。向回流液中加入6.0mmol無水吡啶和6.0mmol亞硫酰氯，回流10小時(shí)后攪拌過夜。反應(yīng)液真空濃縮后加入550ml冷乙醚沉淀，沉淀過濾后加入380ml二氯甲烷溶解，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液減壓濃縮后加350ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.21(s，3H，-OCH3)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ4.35(t，2H，-O-CH2-CH2-O2CNH-)，δ2.86(t，2H，-O2CNH-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-COS-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例13、制備HO-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R為H；R1、R2為氫原子；Y為-S-；m為2；n為113)a)C6H5-CH2-O-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC的制備參照實(shí)施例6制備mPEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的方法，以5克C6H5-CH2-O-PEG5K-OH和3.0mmol 3-巰基丙酸叔丁酯為主要原料制備C6H5-CH2-O-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC。
b)HO-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC的制備將上步制備的C6H5-CH2-O-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC溶解50ml二氧雜環(huán)乙烷中，加入2克10％的鈀碳化物，通入氫氣震蕩過夜。溶液過濾，減壓濃縮后加50ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到HO-PEG5K-S-(CH2)2-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，-S-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例14、制備CH2＝CH-CO-O-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R為CH2＝CH-CO；R1、R2為氫原子；Y為-S-；m為2；n為227)a)C6H5-CH2-O-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的制備參照實(shí)施例6制備mPEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的方法，以10克C6H5-CH2-O-PEG10K-OH為原料制備C6H5-CH2-O-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC。
b)HO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的制備將上步制備的樣品C6H5-CH2-O-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC溶解50ml二氧雜環(huán)乙烷中，加入2克10％的鈀碳化物，通入氫氣震蕩過夜。溶液過濾，減壓濃縮后用200ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，晾干，得到HO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC。
c)CH2＝CH-CO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC的制備將上步制備的樣品HO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC溶解到45ml二氯甲烷中，先后加入三乙胺1.5mmol，丙烯酰氯1.5mmol，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)過夜。溶液過濾，減壓濃縮后加95ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到CH2＝CH-CO-PEG10K-S-(CH2)2-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ5.81-6.45(m，3H，CH2＝CH-CO-)，δ4.21(s，2H，CH2＝CH-COO-CH2-CH2-O-)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，-S-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例15、制備CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R為CH2＝CH-CH2；R1、R2為氫原子；Y為-S-；m為2；n為454)a)C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制備參照實(shí)施例6制備mPEG10K-S-(CH2)2-COOH的方法，以20克C6H5-CH2-O-PEG20K-OH為原料制備C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH。
b)HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制備將上步制備的樣品C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC溶解95ml二氧雜環(huán)乙烷中，加入2.5克10％的鈀碳化物，通入氫氣震蕩過夜。溶液過濾，減壓濃縮后用冷乙醚沉淀，收集沉淀，晾干，得到HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOH。
c)CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制備將上步制備的樣品HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解到350ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出110ml甲苯。溶液中加入含有2.1mmol乙醇鈉的乙醇溶液3ml，反應(yīng)加熱回流至蒸餾出約6ml溶液。反應(yīng)液冷卻到室溫，加入烯丙基氯2.0mmol，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)過夜。溶液用稀酸調(diào)節(jié)pH至中性，溶液過濾，減壓濃縮后溶解到100ml稀鹽酸中，攪拌2小時(shí)。隨后用二氯甲烷抽提三次，每次100ml。合并抽提液，用硫酸鈉干燥。溶液過濾后，真空減壓濃縮至干，得到CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH。
d)CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC的制備將上步制備的CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解到360ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出120ml甲苯。向回流液中加入3.0mmol無水吡啶和3.0mmol亞硫酰氯，回流6小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液減壓抽真空，濃縮后加入360ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入180ml二氯甲烷溶解，先后加入1.1克NAC和0.8ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入165ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到CH2＝CH-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ5.13(dd，1H，CHaHb＝CHc-CH2-O-)，δ5.24(dd，1H，CHaHb＝CHc-CH2-CO-)，δ5.24(dd，1H，CHaHb＝CHc-CH2-CO-)，δ3.95(dd，2H，CHaHb＝CHc-CH2-O-)，δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，-S-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例16、制備HO-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC(式II中R為H；R1、R2為氫原子；Y為-NHCO-；m為4；n為227)a)C6H5-CH2-O-PEG10K-O-SO2-CH3的合成取10g的C6H5-CH2-O-PEG10K-OH溶于350ml氯仿中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱共沸蒸餾至剩余體積約為200ml時(shí)停止加熱，溶液冷卻到室溫。溶液中先后加入無水三乙基氨1.5mmol和無水甲磺酰氯1.5mmol混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢柽^夜，加入無水乙醇終止反應(yīng)?；旌先芤哼^濾，真空減壓濃縮后加入300ml乙醚進(jìn)行沉淀。沉淀過濾后，得到C6H5-CH2-O-PEG10K-O-SO2-CH3，真空干燥保存。
b)C6H5-CH2-O-PEG10K-NH2的合成將上步制備的C6H5-CH2-O-PEG10K-O-SO2-CH3用60ml蒸餾水溶解，隨后倒入含有20克氯化銨的200ml濃氨水中，室溫?cái)嚢柽^夜。溶液用二氯甲烷提取三次，每次220ml。合并提取液用硫酸鈉干燥，過濾。溶液減壓濃縮后加入300ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，得到C6H5-CH2-O-PEG10K-NH2，真空干燥保存。
c)C6H5-CH2-O-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC的合成將上步制備的C6H5-CH2-O-PEG10K-NH2溶于90ml二氯甲烷中，加入己二酰氯10.0mmol和1.4ml三乙胺，室溫下攪拌2小時(shí)，反應(yīng)液過濾，真空濃縮后用300ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入100ml二氯甲烷溶解，先后加入2.0克NAC和1.5ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾、濃縮后用300ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，得到C6H5-CH2-O-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC，真空干燥保存。
d)HO-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC的合成將上步制備的樣品C6H5-CH2-O-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC溶解110ml二氧雜環(huán)乙烷中，加入3.5克10％的鈀碳化物，通入氫氣震蕩過夜。溶液過濾，減壓濃縮后加150ml異丙醇，加熱至溶液透明，溶液倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到HO-PEG10K-NHCO-(CH2)4-CO-NAC。
產(chǎn)物1H MR(DMSO-d6)δ3.5(br m，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.19(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ1.78(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ2.55(t，2H，-NHCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例17、制備(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC(式II中R為(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2；R1、R2為氫原子；Y為-S-；m為2；n為454)a)C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制備參照實(shí)施例6制備mPEG10K-S-(CH2)2-COOH的方法，以20克C6H5-CH2-O-PEG20K-OH為原料制備C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH。
b)HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOCH3的制備將上步制備的樣品C6H5-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解100ml二氧雜環(huán)乙烷中，加入2.5克10％的鈀碳化物，通入氫氣震蕩過夜。溶液過濾，減壓濃縮后用冷乙醚沉淀，沉淀過濾后溶解到200ml的甲醇溶液中，滴加1ml濃硫酸后攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)。溶液用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到7左右，溶液過濾，減壓濃縮后用冷乙醚沉淀，收集沉淀，得到HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOCH3，真空干燥保存。
c)NH2-PEG20K-S-(CH2)2-COOH的制備將上步制備的樣品HO-PEG20K-S-(CH2)2-COOCH3溶解到150ml氯仿中，先后加入無水三乙基氨1.5mmol和無水甲磺酰氯1.5mmol混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢柽^夜，加入無水乙醇終止反應(yīng)。溶液過濾，真空減壓濃縮后加入300ml乙醚進(jìn)行沉淀。沉淀過濾后用150ml蒸餾水溶解，隨后倒入含有25克氯化銨的250ml濃氨水中，室溫?cái)嚢柽^夜。溶液用二氯甲烷提取三次，每次200ml。合并提取液用硫酸鈉干燥。溶液過濾，減壓濃縮后加入600ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，得到NH2-PEG20K-S-(CH2)2-COOH，真空干燥保存。
d)(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH將上步制備的樣品NH2-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解到100ml二氯甲烷中，先后加入無水三乙氨3.0mmol和碳酸二叔丁酯1.2mmol混合均勻，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫反應(yīng)過夜。溶液減壓濃縮后溶解到200ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3左右。溶液用二氯甲烷抽提三次，每次200ml。合并提取液用硫酸鈉干燥。溶液過濾，減壓濃縮后加入600ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，得到(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH，真空干燥保存。
e)(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC將上步制備的樣品(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-COOH溶解到400ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出160ml甲苯。向回流液中加入3.0mmol無水吡啶和3.0mmol亞硫酰氯，回流6小時(shí)后攪拌過夜。將反應(yīng)液減壓抽真空，濃縮后加入400ml冷乙醚沉淀。收集沉淀，加入180ml二氯甲烷溶解，先后加入1.1克NAC和0.8ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入200ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干，得到(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-O-PEG20K-S-(CH2)2-CO-NAC。
產(chǎn)物1H NMR(DMSO-d6)δ1.36(s，9H，(CH3)3C-O-CONH-CH2-CH2-)，δ3.5(brm，-O-CH2-CH2-O-)，δ2.7(m，4H，-O-CH2-CH2-S-CH2-CH2-CO-)，δ3.0(t，2H，)，δ4.71(m，1H，-CO-S-CH2-CH-)，δ2.0(s，3H，-NHCOCH3)。證明所得化合物正確。
實(shí)施例18、制備式III中(n1為113、n2為454，m1為0、m2為5)的化合物，即 取20.0克按照實(shí)施例5方法合成的mPEG20k-(CH2)5-CO-NAC溶解到含有10mmol賴氨酸的80ml水溶液中，向內(nèi)加入0.25mol pH11.6的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液20ml，室溫反應(yīng)1小時(shí)。溶液用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH到3.0，隨后用二氯甲烷抽提三次，每次100ml。合并提取液，先后用30ml 1N鹽酸、30ml蒸餾水反抽提，溶液用硫酸鈉干燥。溶液過濾、減壓濃縮后加入600ml冷乙醚沉淀，收集沉淀、真空干燥保存。
將沉淀溶于180ml二氯甲烷中，先后加入6克按照實(shí)施例1合成的mPEG5k-CO-NAC，0.25ml三乙胺混合均勻，室溫反應(yīng)過夜。溶液中加入過量乙胺終止反應(yīng)，減壓濃縮后用少量蒸餾水溶解。產(chǎn)物用Sephadex-200分子篩層析(φ2.6cm×100cm)，緩沖液為20mmol/L pH7.0磷酸鈉(含有200mmol/L NaCl)，收集雙鏈PEG水溶液30ml。
用鹽酸調(diào)節(jié)雙鏈PEG水溶液pH至3.0，溶液用二氯甲烷提取三次，每次100ml。合并提取液用硫酸鈉干燥。溶液過濾，減壓濃縮后加入300ml冷乙醚沉淀。收集沉淀溶解到400ml甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，蒸餾出100ml甲苯。向回流液中加入6.0mmol無水吡啶和6.0mmol亞硫酰氯，回流10小時(shí)后攪拌過夜。反應(yīng)液真空濃縮后加入500ml冷乙醚沉淀，沉淀過濾后加入380ml二氯甲烷溶解，先后加入1.7克NAC和1.4ml三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液過濾后，將濾液濃縮至干。加入290ml異丙醇，加熱至溶液透明，倒入燒杯中攪拌冷卻析晶。濾出晶體，用異丙醇洗滌兩遍，涼干。產(chǎn)物用水溶解后，經(jīng)高效液項(xiàng)色譜-質(zhì)譜(液質(zhì)聯(lián)機(jī))分析，分子量25kD占95％以上。
實(shí)施例19、mPEG20k-(CH2)2-CO-NAC修飾干擾素α-2a。
取3ml(1.2mg)干擾素加入6.0mg實(shí)施例3所制備得到的mPEG20k-(CH2)2-CO-NAC混勻，加入0.75ml硼酸鈉(pH9.2)啟動(dòng)反應(yīng)，4℃反應(yīng)2小時(shí)。加入2M甘氨酸0.1ml，室溫作用10分鐘后加入0.5ml 1M乙酸鈉(pH5.0)。反應(yīng)后樣品進(jìn)行透析，透析液為20mM pH5.0乙酸鈉。透析后樣品直接上Sepharose-CM，流速為1.5ml/min。淋洗后分別用100mM NaCl、200mM NaCl、400mM NaCl的20mM乙酸鈉pH4.5溶液洗脫。
收集修飾、純化后的樣品用SDS-PAGE進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示，圖1中道M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，道1為修飾后樣品，道2為離子交換后淋洗液，道3、4為100mM洗脫樣品，道5為200mM洗脫樣品，道6、7為400mM洗脫樣品。其中單PEG干擾素表觀分子量約為60kd，而干擾素分子量為15kd。結(jié)果表明，PEG-NAC可以在比較溫和的條件下進(jìn)行干擾素的修飾，而且產(chǎn)物穩(wěn)定，易于分離純化。
實(shí)施例20、mPEG5k-(CH2)2-CO-NAC修飾牛血紅蛋白。
按照實(shí)施例3的過程制備mPEG5k-(CH2)2-CO-NAC。
取3ml(60mg)血紅蛋白加入70mg mPEG5k-(CH2)2-CO-NAC混勻，加入0.75ml硼酸鈉(pH9.0)啟動(dòng)反應(yīng)，10℃反應(yīng)2小時(shí)。加入1M甘氨酸0.2ml，室溫作用10分鐘終止反應(yīng)。反應(yīng)后樣品用5kD膜進(jìn)行超濾，收集超濾后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳圖如圖2所示，圖中道1為血紅蛋白，道2為修飾后血紅蛋白，道3為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。其中，血紅蛋白亞基的分子量約15kD，PEG單修飾血紅蛋白亞基表觀分子量約為26kD。結(jié)果表明，PEG-NAC可以在比較溫和的條件下進(jìn)行血紅蛋白的修飾。
權(quán)利要求
1.具有式I結(jié)構(gòu)的N-乙?；腚装彼嵫苌铮?(式I)其中，POLY為分子量范圍在1000Da～500,000Da之間的聚烷基二醇，及其二元共聚物、三元共聚物、混合共聚物，包括聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇丙二醇的二元共聚物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述N-乙?；腚装彼嵫苌锝Y(jié)構(gòu)式為式II， (式II)其中，n為25-4000之間的正整數(shù)；R為氫、碳原子數(shù)為1-10的烷基、芐基、CH2＝CH2-CH2-、CH2＝CH-CO-、或(CH3)3-O-CONH-CH2-CH2-；Y為-O-、-S-、-NHCO-、-CONH-、-COO-、-OCO-、-NHCO2-、或-O2CNH-；R1為H或甲基；R2為H或甲基；m為0-5之間的正整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的N-乙?；腚装彼嵫苌?，其特征在于所述n為113-1500之間的正整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的N-乙?；腚装彼嵫苌?，其特征在于所述R1為H；R2為H。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的N-乙?；腚装彼嵫苌?，其特征在于所述R為甲基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的N-乙?；腚装彼嵫苌铮涮卣髟谟谒鯵為-O-。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一所述的N-乙酰基半胱氨酸衍生物，其特征在于所述m為1-5之間的正整數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的N-乙?；腚装彼嵫苌?，其特征在于所述m為2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-乙?；腚装彼嵫苌?，其特征在于所述N-乙?；腚装彼嵫苌锝Y(jié)構(gòu)式為式III， (式III)其中，n1、n2分別為25-4000之間的正整數(shù)，優(yōu)選為113-1500的正整數(shù)；m1、m2分別為0-5的正整數(shù)，優(yōu)選為1-5之間的正整數(shù)，更優(yōu)選為2。
10.權(quán)利要求1-9任一所述的N-乙?；腚装彼嵫苌镌谛揎椀鞍踪|(zhì)和多肽上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種N－乙酰基半胱氨酸衍生物與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的N－乙?；腚装彼嵫苌铮哂惺絀結(jié)構(gòu)，其中，POLY為分子量范圍在1000Da～500,000Da之間的聚烷基二醇，及其二元共聚物、三元共聚物、混合共聚物，包括聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇丙二醇的二元共聚物。本發(fā)明化合物主要修飾蛋白質(zhì)或多肽中的氨基，具有較高的選擇性、專一性和修飾反應(yīng)活性，反應(yīng)后生成的N－乙?；腚装彼釠]有毒副作用，修飾過程操作簡便，修飾后產(chǎn)物穩(wěn)定，可以廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽類等藥物的修飾。
文檔編號(hào)C08G65/00GK1837191SQ20051005645
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2005年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月23日
發(fā)明者于勇海 申請(qǐng)人:于勇海