專利名稱：一種用基因工程方法培養(yǎng)的抗病香料煙草的制作方法
本技術(shù)屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的植物基因工程學(xué)科。該成果在克隆TMV外殼蛋白基因，并獲得高效表達(dá)的抗TMV煙草工程植株方面達(dá)到國(guó)際同類研究的先進(jìn)水平。
現(xiàn)有技術(shù)本項(xiàng)目所采用的植物基因工程技術(shù)屬新興的高科技學(xué)科。以往經(jīng)典的煙草育種技術(shù)都無(wú)法在同一水平上與之比較。目前植物基因工程的抗病毒育種方法可有幾種，本項(xiàng)目采用的是一種已為國(guó)際承認(rèn)的最有效而安全的方法;即將病毒的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入植物基因組中去的技術(shù)。
植物的病毒危害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上損失最大的病害之一，到目前為止還沒(méi)有很有效的方法來(lái)防治，通常采用的是用農(nóng)藥來(lái)殺死、控制傳染病毒的昆蟲(chóng)，保護(hù)植物免受病毒侵染。這種方法的缺點(diǎn)是不但化學(xué)藥品的價(jià)格較高，而且往往造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。另一種方法是組織脫毒法，用于無(wú)性繁殖的一些植物。取這類植物的莖尖、芽尖等病毒尚未入侵到的組織，通過(guò)組培的方法，育出大量的無(wú)毒苗，用于田間生產(chǎn)。目前在馬鈴薯、草莓等上已經(jīng)應(yīng)用。這種方法的缺點(diǎn)是，組培脫毒育苗不但成本高，工作量大，而且由于病毒的田間再侵染，能維持無(wú)毒的有效期不長(zhǎng)，兩三年后產(chǎn)量又會(huì)嚴(yán)重下降。還有一種防病毒的方法叫交叉保護(hù)(croosprotection)法，當(dāng)把一種病毒的弱株接種到植物上，同種的強(qiáng)病毒再侵染這些植物時(shí)，表現(xiàn)出植株受到保護(hù)的現(xiàn)象，此時(shí)強(qiáng)病毒的侵染能力和致病能力都大大降低。我國(guó)從70年代開(kāi)始，主要將此法用于防止蕃茄上的病毒病。80年代在抗木瓜環(huán)斑病毒上也曾使用此法。這個(gè)經(jīng)典的利用病毒的交叉保護(hù)特點(diǎn)建立的方法也存在著一些問(wèn)題。首先，需要找到一株弱病毒，找到一株適用的這樣的病毒，往往需要幾年時(shí)間;其次，雖然選用的是弱病毒，但仍能在一定程度上降低此種作物的產(chǎn)量;再者，弱病毒株只能與和它相類似的病毒有交叉免疫作用，而對(duì)相距較大的病毒種類沒(méi)有什么作用，有時(shí)甚至還能和這些不相關(guān)的病毒相互影響，加重病害，使作物遭到更大的損失。加之工作量大，成本高，此法比較難以廣泛使用。利用植物基因工程解決病毒防治，現(xiàn)有5種方法。
第一種方法是向植物轉(zhuǎn)入病毒的外殼蛋白基因。1986年，在美國(guó)通過(guò)植物基因工程成功地獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株。他們首次將煙草花葉病毒(TMV)的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)移到了煙草和蕃茄的細(xì)胞里去，并培育成株。在這種蕃茄和煙草的葉片里都測(cè)到了煙草花葉病毒的外殼蛋白，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)用煙草花葉病毒侵染這些植物時(shí)，這些植株能在一定程度上有抵抗作用。TMV外殼蛋白基因在細(xì)胞中的存在，能抑制TMV在寄主細(xì)胞中的復(fù)制，并能阻止或降低TMV在植株體內(nèi)的傳遞。1986年的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在溫室里得到的，后經(jīng)美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，這種轉(zhuǎn)基因蕃茄已在美國(guó)的幾個(gè)不同的地區(qū)進(jìn)行了大田實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，它們?cè)诖筇锢锉憩F(xiàn)和在溫室里的表現(xiàn)一致。大田實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)說(shuō)明有TMV外殼蛋白的蕃茄，在接種TMV后，只有5%左右的植株得病，而對(duì)照植株的發(fā)病率是99%。在產(chǎn)量上與無(wú)病株相比，含TMV外殼蛋白的蕃茄幾乎不減產(chǎn)，而對(duì)照組的產(chǎn)量損失達(dá)26-35%。從此提供了一條通過(guò)基因工程來(lái)抗病毒的十分誘人的途徑。繼抗煙草花病毒的外殼蛋白基因工程成功之后，現(xiàn)在已經(jīng)完成的還有黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、苜?；ㄈ~病毒(AIMV)和最近即將報(bào)導(dǎo)的大豆花葉病毒(SMV)等的外殼蛋白基因工程。應(yīng)該說(shuō)，使用轉(zhuǎn)病毒的外殼蛋白基因方法培育出來(lái)的抗病毒植物比較安全。因?yàn)橥鈿さ鞍妆旧聿](méi)有毒性，我們平日吃的蕃茄和馬鈴薯里就有這些病毒，只是到目前為止我們還沒(méi)有足夠的證據(jù)證明這個(gè)方法能夠解決所有種類的病毒危害。也許這種辦法有一定的限度，但是直到目前為止我們還未曾發(fā)現(xiàn)它有什么副作用。另一個(gè)問(wèn)題是，如果某種病毒的外殼蛋白能夠裝配由昆蟲(chóng)傳染的它種病毒的RNA的話，也許會(huì)發(fā)生危險(xiǎn)。但是，直到目前為止并沒(méi)有提出任何有這種危險(xiǎn)存在的跡象和實(shí)際根據(jù)。
第二種方法是通過(guò)病毒的衛(wèi)星RNA的植物基因工程來(lái)防治病毒。不少種類的病毒有衛(wèi)星RNA。黃瓜花葉病毒(CMV)的衛(wèi)星RNA是利用植物基因工程方面最早獲得成功的一個(gè)例子。但是人們普遍地認(rèn)為，因?yàn)椴《镜男l(wèi)星RNA存在著不能徹底地抑制它的互補(bǔ)病毒的復(fù)制，本身具有很高的突變率，以及與它種病毒互補(bǔ)后會(huì)加強(qiáng)被補(bǔ)病毒的為害等幾個(gè)問(wèn)題，如果在生產(chǎn)上使用會(huì)有一定的潛在危險(xiǎn)。因此，目前這方面的研究存在著一些困難，需要設(shè)計(jì)一些新的實(shí)驗(yàn)。如對(duì)衛(wèi)星RNA的cDNA搞些點(diǎn)突變，作些改造，也許能在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用。
第三種方法是利用病毒的反義RNA。這個(gè)方法最早用在動(dòng)物病毒上，的作法是將病毒的基因組反向地結(jié)合在啟動(dòng)子后，這樣就能在轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞里編碼出反義基因。當(dāng)外源的病毒RNA侵染進(jìn)入植物細(xì)胞之后，和這些細(xì)胞里編碼出來(lái)反義RNA形成互補(bǔ)，構(gòu)成雙鏈的RNA，使得病毒無(wú)法復(fù)制，減輕了病毒的為害。利用植物基因工程的技術(shù)，已經(jīng)成功地將植物的一些病毒基因組反過(guò)來(lái)接在植物的啟動(dòng)子后面，轉(zhuǎn)到植物細(xì)胞里去，出現(xiàn)了抵抗這些病毒侵染的結(jié)果。但是，這個(gè)方法也還有一些缺點(diǎn)，主要問(wèn)題是需要比較大量的反義RNA才能徹底抵抗外源病毒的入侵。它的產(chǎn)量起碼還要提高50倍，而目前的植物啟動(dòng)子都還達(dá)不到這個(gè)水平。所以，這個(gè)方法可以抵抗不太嚴(yán)重的病毒侵染;當(dāng)入侵病毒的數(shù)量大時(shí)，它所起的作用就很小了。
第四個(gè)方法是利用植物自己編碼的抗病基因。有些植物在受病毒侵染時(shí)，表現(xiàn)出一定的抵抗能力，最明顯的例子是有的蕃茄品種能抗煙草花葉病毒。育種家們有許多帶抗原的材料。我們可以通過(guò)克隆這類抗原基因，得到抗某種病毒的轉(zhuǎn)基因植物。這方面的工作的困難在于分離到能被利用的基因。但是如果這種方法成功，這種轉(zhuǎn)基因植物的危險(xiǎn)應(yīng)該最小。
第五，利用病毒上的其他基因。前面說(shuō)到過(guò)的是利用病毒中的一個(gè)外殼蛋白基因。在病毒基因組中除了外殼蛋白基因外，還有其他一些基因、復(fù)制酶基因等等，我們有可能用改造基因組的辦法得到抗病毒的基因。這個(gè)辦法目前尚處于探索階段。
在上述五種方法中，比較成功的還是前三種，在國(guó)外都已達(dá)到得到轉(zhuǎn)基因植物的階段，有的甚至已經(jīng)進(jìn)入大田實(shí)驗(yàn)。我國(guó)已經(jīng)開(kāi)展這方面的工作，并且已得到了不少成果。針對(duì)一些國(guó)家廣泛流行嚴(yán)重的作物病毒，我們實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了它們的外殼蛋白基因分離和轉(zhuǎn)化的工作?，F(xiàn)已成功地分離并合成了編碼煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒和另外幾種常見(jiàn)的作物病毒的外殼蛋白基因，并對(duì)這些基因作了序列等方面的分析;同時(shí)還得到了其中一些病毒外殼蛋白基因?qū)ξ覈?guó)現(xiàn)生產(chǎn)用的煙草、蕃茄優(yōu)良品種的基因轉(zhuǎn)化植物。全世界每年由植物病毒為害造成的作物減產(chǎn)，至少以10%計(jì)。我們這么大的農(nóng)業(yè)國(guó)家，其損失難以計(jì)數(shù)。植物基因工程這一方面的工作對(duì)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)會(huì)有立竿見(jiàn)影的好處，我國(guó)需要大力開(kāi)展這方面的工作。
發(fā)明的目的我國(guó)煙草行業(yè)所需的東方型香料(Oriental aromaticus tobacco)煙草需要量很大，國(guó)內(nèi)目前的種植品種病毒病害嚴(yán)重，品質(zhì)不高，產(chǎn)量亦不足，而進(jìn)口不但耗費(fèi)大量外匯，且常因口岸檢疫不合格無(wú)法運(yùn)進(jìn)，因而嚴(yán)重制約我國(guó)香煙的質(zhì)量與產(chǎn)量。本項(xiàng)目即以解決以上問(wèn)題為目的而設(shè)計(jì)，因?yàn)橛绊懴懔掀焚|(zhì)和產(chǎn)量的主要原因就是病毒病。通過(guò)基因工程技術(shù)育成的抗病香料煙“PK-873”解決了TMV對(duì)這種煙的危害，并與丹東農(nóng)科所煙草室合作，在我國(guó)丹東地區(qū)作了幾年的大田試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行了成份分析和評(píng)吸，其結(jié)果表明，“PK-873”的大田性狀及內(nèi)在品質(zhì)優(yōu)于國(guó)產(chǎn)同種用途的香料煙，及我國(guó)引種的泰國(guó)香料煙。達(dá)到我國(guó)直接購(gòu)進(jìn)，用量最大的泰國(guó)香料煙水平。
本項(xiàng)目的主要內(nèi)容是構(gòu)建cDNA庫(kù)，從中獲取外殼蛋白基因，通過(guò)土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入煙草，獲得抗病煙草。

發(fā)明內(nèi)容
及方案a.成功地克隆了抗TMV的外殼蛋白基因，用它建立了對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化的有效載體系統(tǒng)。
b.在國(guó)內(nèi)首次利用植物基因工程技術(shù)獲得了抗TMV的生產(chǎn)用香料煙草；并通過(guò)組織培養(yǎng)等方法選出了具有優(yōu)良性狀的工程植株。
c.至1994年已進(jìn)行了累計(jì)3萬(wàn)余畝的大田試驗(yàn)，植株總數(shù)達(dá)到了億株。
d.對(duì)基因工程香料煙進(jìn)行了多項(xiàng)指標(biāo)的品質(zhì)鑒定。
e.對(duì)我國(guó)東北地區(qū)及山東提供了一個(gè)已經(jīng)完成大田中試的抗病優(yōu)質(zhì)香料煙草命名為“PK-873”。
實(shí)施例材料與方法病毒實(shí)驗(yàn)所用的TMV是從天津甜椒上分離出的一個(gè)株系。
煙草用來(lái)接種病毒的煙草是TMV能夠進(jìn)行系統(tǒng)侵染的品種，拉丁名是Nciotiana tobacum L.Var.Samsum，接種結(jié)果見(jiàn)明顯花斑、葉皺縮、葉片呈耳狀突起出現(xiàn)厥葉，簇頂?shù)取?br> 酶合成cDNA用Promega的cDNA Syuthesis kit。
序列測(cè)定用Promega的K/RTTMSeguencing system中的T7Primer和Klenow。
同位素cDNA和序列測(cè)定均使用Amersham的α-32P-αATP。
接種通過(guò)機(jī)械摩擦接種病毒，摘取被侵染TMV的葉片5克，按3∶1(V/M)加入0.1M硼酸緩沖液pH7.0(0.1M硼酸，0.5mM EDTA，5mM 2-Me pH7.0)，研磨成勻漿，1000克離心30分鐘，取上清液加入PEG(600)和NaCl使終濃度分別是4%和1%，在4℃-6℃下攪拌3-4小時(shí)，10，000克下離心30分鐘，將沉淀懸浮在1/4原體積1/15M的磷酸緩沖液中(pH7.0)7，000克下離心10-15分鐘，取上清液重復(fù)PEG沉淀及差速離心，取上清液加到預(yù)鋪好的CsCl上(預(yù)鋪CsCl梯度10%，20%，30%，40%的CsCl，等體積依次加入)，RP-55T rotor，30，000rpm3小時(shí)，用注射器吸出TMV帶，用無(wú)菌水稀釋，再用35，000rpm離心1小時(shí)，沉淀溶于水中。純的TMV紫外掃描結(jié)果A280/260＝0.82濃度1.103/3.1×1000/30＝12mg/ml。
TMV RNA的提取TMV(2mg/ml)加入2X蛋白酶K緩沖液，再加蛋白酶K使其終濃度達(dá)50μg/ml，37℃下保溫30～40分鐘，兩次等體積苯酚-氯仿，除去乙醚，加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，在-70℃放置20-25分鐘，取出13，000～14，000rpm離心20-25分鐘，沉淀用1ml70%冷乙醇洗一次，13，000～14，000rpm離心10-12分鐘，傾去液體，將沉淀抽干，然后加ddH2O50μl溶解。
(1)TMV RNA的紫外掃描結(jié)果A260/280＝2.2濃度＝0.22/25×100＝0.88mg/ml。
(2)RNA電泳，結(jié)果TMV RNA6.4KpcDNA的合成A.合成PrimerTMV RNA上無(wú)polyA，因而逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的引物(Primer)需要人工合成，根據(jù)前人對(duì)TMV tomato stain的序列分析，設(shè)計(jì)合成了一般與已知序列3′端141-160堿基互補(bǔ)的序列。具體如下160 141tomato stain RNA-ACGUGGUACGUACGAUAACG-Primer TGCACCATGCATGCTATAGC其中第143號(hào)堿基的改變?cè)斐闪艘粋€(gè)EcoRV的酶切位點(diǎn)。
B.cDNA的合成a.第一鏈的合成RNA 1μg 0.38μg/μl 5μlPrimer 0.5μg 0.3μg/μl 2μlddH2O 22μl煮沸1分鐘，馬上放在冰上Rnasin fou/μl 1μllst buffer 10x 5μl
DTT 100mM 5μldNTDs 10mM 5μlα-32P-dATP 10μg/μl(1.5μl釋4μl) 2μlAMV RTase 9.5μ/μl 2μl44℃保溫1小時(shí)，追加AMV RTase 9.5μ/μl，44℃保溫1小時(shí)。
b.第二鏈的合成dd氫 125μl2nd strand buffer 10x 23μlDTT 100mM 23μlNTDs 1mM 7μlα-32P-dATP 10μci/μ1(1.5μl釋4μl) 2μlE.Coli DNA ligase 1μ/μl 1μl16℃保溫30分鐘，加RNase H1.9μ/μl，16℃保溫2小時(shí)。
c.將CDNA補(bǔ)成平末端70℃加熱10分鐘，離心一下，放置在冰上。加入T4DNApolymerase 9μ/μl 0.5μ/μgRNA，37℃保溫30分鐘，加入20μl0.25M EDTA 1/2Vol 7.5M NH4AC 3倍體積乙醇，冰浴5～10分鐘，離心13，000rpm離心30分鐘，干燥沉淀，沉淀溶到20μl ddH2O中。
d.對(duì)一鏈、二鏈處理5μl一鏈，30μl二鏈，分別進(jìn)行，加入1/10體積0.25M EDTA，1/10體積2N NaOH，65℃保溫1小時(shí)，加入1/2體積7.5M NH4AC3倍體積乙醇，冰浴5～10分鐘，離心13，000rpm離心30分鐘，用80%冷乙醇洗，13，000rpm離心5分鐘，干燥沉淀，溶于20μl堿性膠載樣緩沖液中，點(diǎn)樣前煮5～10分鐘變性。
C.堿性膠電泳，常規(guī)方法。
D.cDNA連入BLUESCRIPT-smaⅠ位點(diǎn)。
E.將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E，ColiDH5株感受態(tài)細(xì)胞中。
cDNA克隆的鑒定
1、從經(jīng)轉(zhuǎn)化處理后的諸菌株中篩選cDNA插入克隆約100個(gè)，定名為pLcsN，并提取質(zhì)粒。從cDNA克隆到Bluescript質(zhì)粒中篩選，篩選獲得不同大小的克隆分別編號(hào)為plcs23，plcs24，plcs72，plcs65，plcs64，plcs73，plcs26，plcs66，plcs44。
cDNA序列的測(cè)定克隆中任意選了一株，名字是plcs72，其插入cDNA大小為1.8Kp左右。用kleuow方法對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定。
A.質(zhì)粒的小量提取采用分子克隆上小量提質(zhì)粒的方法，為適應(yīng)測(cè)序要求的高純度而略有變化，其一，第九步重復(fù)一次，以盡可能除去白色沉淀，其二，在苯酚-氯仿抽提前加入無(wú)DNA酶的RNA酶，終濃度為20μg/μl，37℃保溫40～60分鐘，其三，苯酚-氯仿以后，再用1倍體積氯仿∶異戌醇(24∶1)洗二次，其四，干燥后的沉淀溶于50μl TE(PH8.0)后，加入30μl120%PEG(6000，8000)-2.5MNaCl倒置混勻水浴60分鐘(-70℃5-10分鐘)12，000克離心15分鐘，吸去上清，用1μl 70%冷乙醇洗沉淀離心抽干。將沉淀溶解在50μl TE PH8.0中。
B.質(zhì)粒的堿變性加5.5μl 2N NaOH，在室溫下放置5分鐘，再加20μl 50M NH4Ac混勻，加入27的無(wú)水乙醇，冰上保溫60分鐘(-70℃5μl)取出在12，000克下離心10分鐘，用200μl，70%乙醇洗，離心后，抽干沉淀，沉淀溶于ddH2O中，使其濃度是0.5μg/μl左右。
C.引物與模板的結(jié)合取6μl模板(～3μg)，加1.5μl 10×klenow buffer 3μl T7 prmer 10μg/μg混勻，把Ependorf管漂在一個(gè)250μl裝滿水的燒杯中，放入微波爐加熱，待水開(kāi)始沸騰，取出燒簿，使其在室溫下自然降溫，降到室溫后，室溫下離心進(jìn)行下一步。
D.Klenow測(cè)定DNA序列再加入4μlα-32P-dATP(或5μl-α35與-dATP及1.0～1.5μlKlenow(7μ/μl)混勻。
再注有A、C、G、T四個(gè)硅化的Eppendorf管中加入3μl的dNTP 5ddNTP混合物，迅速加入剛混好的模板和酶的混合物3μl，37℃-40℃再保溫30分鐘，取出，分別加入1μl追加溶液37℃-40℃再保溫30分鐘，加入5μl反應(yīng)停止液。
E.序列膠采用8%聚丙烯胺膠，0.4mm厚，成份丙烯胺甲叉丙烯胺膠尿素 10×TBE ddH2O 10%APT EMED7.6g 0.4g 48g 10ml 40ml 500μl 50μl放射自顯影。序列測(cè)定結(jié)果如下(1)用plcs 72質(zhì)粒，模板準(zhǔn)備。
依次λdⅢ plcs72ds plcs72ds plcs72ds上樣量4μl 6μl 6μl 6μl(2)以自顯影進(jìn)行序列分析對(duì)plcs72的初步測(cè)定，獲得如下結(jié)果，從膠上讀出TATCG，ATAAG，CTTGG，ATATC，ATCGG，AATTC，CTGCA，GCCCG，TAATA，CATCA，CGACA，GAGGA，TGCAT，TGTGT，ATTAC，GATCC，CCTAA，AGTTG，ATCTC，GAAAC，TTGGT，(G)CTAAA，CACCA，TCAAG，GATTG，GGAAC，ACTTG，G，共136bp，其中polylinker39個(gè)，cDNA97bp。
TMV外殼蛋白基因(CP基因)的獲得根據(jù)前人工作，已經(jīng)確定TMV CP基因在3′端。CP基因長(zhǎng)為500bp左右，cDNA合成由3′一端開(kāi)始，所以只要約800bp的cDNA就有可能取得需要的基因。經(jīng)過(guò)酶切篩選，選出plcs70和plcs26，它們片段大小分別是900bp及1.1Kp，其中包括了CP基因。
將CP基因轉(zhuǎn)到土壤農(nóng)桿菌Co24質(zhì)粒。
轉(zhuǎn)入的方法有兩種1、用雙酶切出，定向連入Co24。
用Bam H Ⅰ和EcoR Ⅰ切出cDNA，用Bg1Ⅱ，EcoR Ⅰ切Co24，BamH Ⅰ與Bg1Ⅱ同尾，很容易把含CP基因的片投定向轉(zhuǎn)入Co24。
2、用酶切出cDNA，用酶切開(kāi)Co24后，用Klenow把所有片段補(bǔ)成平末端，連接篩選。由這種方法可以獲得兩個(gè)方向的插入。
(1)plcs70用定向連接轉(zhuǎn)入Co24會(huì)產(chǎn)生不同大小等級(jí)的質(zhì)粒。從獲得的16個(gè)克隆中選出第15號(hào)，定名為plcs70-15，是含coat protein基因的Ti質(zhì)粒。
(2)plcs26轉(zhuǎn)入Co24plcs26用Bam H Ⅰ和EcoRⅠ切出cDNA，由Klenow變?yōu)槠侥┒诉B入Co24，從69個(gè)克隆中酶切鑒定，第32號(hào)含有CP基因、定名為plcs26-3。
轉(zhuǎn)化煙草材料及方法(一)材料1、菌株及菌液制備選用土壤農(nóng)桿菌GV3111-SE(PTiH40)。挑取單菌落，在LB+Km50mg/l+Cm25mg/l+SPC100mg/l液體培養(yǎng)基中，200rpm，28℃培養(yǎng)24-36小時(shí)，至細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，3000rpm離心10分鐘，棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍。稀釋好的菌液用于轉(zhuǎn)化。
2、煙草材料取溫室中新鮮的巴什馬型香料煙(Oriental tobocco)的煙草葉片，清水洗凈。先放入75%乙醇中消毒30秒，再入10%次氯酸鈉溶液中消毒8-10分鐘，無(wú)菌水清洗三次。將表面消毒好的葉片剪成1平方米的葉塊，用于轉(zhuǎn)化。
3、哺育細(xì)胞選用生產(chǎn)迅速的胡羅卜懸浮細(xì)胞系。
4、植物培養(yǎng)基(1)T1，(用于細(xì)胞和葉片共培養(yǎng))，MS培養(yǎng)基，3%蔗糖，1mg/l6-BA，0.1mg/lNAA，瓊脂粉0.9%，PH＝5.6-5.8，高壓滅菌。
(2)T2，(用于預(yù)培養(yǎng))，T1培養(yǎng)基，500mg/l，芐青霉素(carb)。
(3)T3，(用于篩選培養(yǎng))，T1培養(yǎng)基，100mg/lkm，500mg/lcarb。
(4)T4，(用于生根)，MS培養(yǎng)基，100mg/l，500mg/lcarb。
5、哺育細(xì)胞培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基。
6、細(xì)菌培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，附加不同種類和濃度的抗生素。
(二)轉(zhuǎn)化步驟(全部在無(wú)菌條件下進(jìn)行)1、將葉片放入制備好的菌液中，浸泡3-5分鐘取出，在無(wú)菌濾紙上吸干表面菌液。
2、T1培養(yǎng)基表面鋪一層哺育細(xì)胞，其上覆蓋一無(wú)菌濾紙，將1中已浸菌的葉塊擺放在濾塊上。28℃，黑暗中共培養(yǎng)48小時(shí)。
3、將葉塊轉(zhuǎn)入T2培養(yǎng)基中，放置光下，25-28℃培養(yǎng)24小時(shí)。
4、將葉塊轉(zhuǎn)放T3培養(yǎng)基中，光下25-28℃培養(yǎng)，約15天后葉塊切口處有愈傷組織形成和芽點(diǎn)的分化。
5、葉塊繼續(xù)在T3上培養(yǎng)基，每20天左右換一次新鮮培養(yǎng)基。約2-3個(gè)月后，芽可長(zhǎng)成高3-5cm的小植株。
6、切下較大的小植株，轉(zhuǎn)T4培養(yǎng)基中，20天左右開(kāi)始有根生成。繼續(xù)培養(yǎng)40天左右，形成發(fā)達(dá)根系。
7、從培養(yǎng)瓶中取出根系發(fā)達(dá)的植株，無(wú)菌水洗凈瓊脂，移入土壤中。開(kāi)始2-3周將植株用罩子罩住，待植株健壯后，取下罩子，在溫室中培養(yǎng)(這步不需在無(wú)菌條件)。
由此獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，取名PK-873香料煙。
本項(xiàng)目的優(yōu)點(diǎn)可分兩個(gè)方面1、在大田種植方面a.抗TMV病毒感染率只有5%，且病勢(shì)輕微，對(duì)照組感染率在99%以上。
b.生長(zhǎng)方面和大田管理有關(guān)，且不在專利申請(qǐng)范圍內(nèi)，從略。
2、在品質(zhì)方面抗病毒TMV香料煙草“PK-873”經(jīng)過(guò)兩次評(píng)定。
第一次評(píng)定，沈陽(yáng)卷煙廠結(jié)論意見(jiàn)為香料煙“PK-873”可以用于混合型卷煙，大有開(kāi)發(fā)擴(kuò)種價(jià)值，從品質(zhì)上講，“PK-873”接近泰國(guó)香料煙的水平持平或略高。
根據(jù)第一次評(píng)定結(jié)果，為進(jìn)一步確定“PK-873”的品質(zhì)，由中國(guó)煙草總公司有關(guān)專家提議，由國(guó)家煙草總公司國(guó)家級(jí)評(píng)委遲桂香主持在天津召開(kāi)的全國(guó)鄭煙降低焦油討論會(huì)上，由煙草總公司和15家煙廠20名專家采取封名編號(hào)打分的形式、評(píng)吸比較國(guó)內(nèi)主要栽培品種“沙姆遜”、“泰國(guó)1號(hào)”、進(jìn)口泰國(guó)香料煙AG(醇化兩年以上)和“PK-873”評(píng)吸結(jié)果、“PK-873”得總分第一名至今為止，事實(shí)證明了基因工程香料煙“PK-873”可投入大田生產(chǎn)，在工業(yè)上使用也是可行的。
權(quán)利要求
1.一種用基因工程方法培養(yǎng)的抗病香料煙草，其特征是所述方法包括TMV純化、TMV RNA提取、cDNA合成、TMV cDNA測(cè)序、TMV外殼蛋白基因(CP基因)的獲得，用TMV外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞的培養(yǎng)及選育；1).病毒TMV的提取純化摘取被侵染TMV的葉片5g，按3∶1(V/M)加入0.1M硼酸緩沖液pH7.0(0.1M硼酸，0.5mM EDTA，5mM 2-Me PH7.0)，研磨成勻漿，1000克離心20-30分鐘，取上清液加入PEG(6000)和NaCl使終濃度分別是4%和1%，在4℃-6℃下攪拌3-4小時(shí)，10，000克下離心30分鐘，將沉淀懸浮在1/4原體積1/15M的磷酸緩沖液中(PH7.0)7，000克下離心10-15分鐘，取上清液重復(fù)PEG沉淀及差速離心，取上清液加到預(yù)鋪好的CsCl上(預(yù)鋪CsCl梯度10%，20%，30%，40%的CsCl，等體積依次加入)，RP-55T rotor，30，000rpm3小時(shí)，用注射器吸出TMV帶，用無(wú)菌水稀釋，再用35，000rpm離心1小時(shí)，沉淀溶于水中；2).TMV RNA的提取TMV(2mg/ml)加入2X蛋白酶K緩沖液，再加蛋白酶K使其終濃度達(dá)50μg/ml，37℃下保溫30～40分鐘，兩次等體積苯酚-氯仿，除去乙醚，加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，在-70℃放置20-25分鐘，取出13，000～14，000rpm離心20-25分鐘，沉淀用1ml70%冷乙醇洗一次，13，000～14，000rpm離心10-12分鐘，傾去液體，將沉淀抽干，然后加ddH2O50μl溶解；3).cDNA的合成A.合成PrimerTMV RNA上無(wú)polyA，因而逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的引物(Primer)需要人工合成，根據(jù)前人對(duì)TMV tomato stain的序列分析，設(shè)計(jì)合成了一般與已知序列3′端141-160堿基互補(bǔ)的序列；具體如下160141tomato stain RNA-ACGUGGUACGUACGAUAACG-Primer TGCACCATGCATGCTATAGC其中第143號(hào)堿基的改變?cè)斐闪艘粋€(gè)EcoRV的酶切位點(diǎn)；B.cDNA的合成a.第一鏈的合成RNA 1μg0.38μg/μl 5μlPrimer 0.5μg 0.3μg/μl 2μlddH2O 22μl煮沸1分鐘，馬上放在冰上Rnasin fou/μl 1μllst buffer 10x 5μlDTT 100mM 5μldNTDs 10mM5μlα-32P-dATP 10μg/μl(1.5μl釋4μl) 2μlAMV RTase 9.5μ/μl 2μl44℃保溫1小時(shí)，追加AMV RTase 9.5μ/μl，44℃保溫1小時(shí)。b.第二鏈的合成dd氫 125μl2nd strand buffer 10x 23μlDTT100mM 23μlNTDs 1mM 7μlα-32P-dATP 10μci/μl(1.5μl釋4μl) 2μlE.Coli DNA ligsae 1μ/μl 1μl16℃保溫30分鐘，加RNase H1.9μ/μl，16℃保溫2小時(shí)；c.將CDNA補(bǔ)成平末端70℃加熱10分鐘，離心一下，放置在冰上；加入T2DNA poly-merase 9μ/μl 0.5μ/μgRNA，37℃保溫30分鐘，加入20μl 0.25MEDTA 1/2Vol 7.5M NH4AC 3倍體積乙醇，冰浴5～10分鐘，離心13，000rpm離心30分鐘，干燥沉淀，沉淀溶到20μl ddH2O中；d.對(duì)一鏈、二鏈處理5μl一鏈，30μl二鏈，分別進(jìn)行，加入1/10體積0.25M EDTA，1/10體積2N NaOH，65℃保溫1小時(shí)，加入1/2體積7.5M NH4AC 3倍體積乙醇，冰浴5～10分鐘，離心13，000rpm離心30分鐘，用80%冷乙醇洗，13，000rpm離心5分鐘，干燥沉淀，溶于20μl堿性膠載樣緩沖液中，點(diǎn)樣前煮5～10分鐘變性；C.堿性膠電泳，常規(guī)方法；D.cDNA連入BLUESCRIPT--sma I位點(diǎn)；E.將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E，ColiDH5株感受態(tài)細(xì)胞中；cDNA克隆的鑒定從經(jīng)轉(zhuǎn)化處理后的諸菌株中篩選cDNA插入克隆約100個(gè)，定名為pLcsN，并提取質(zhì)粒。從cDNA克隆到Bluescript質(zhì)粒中篩選獲得不同大小的克隆分別編號(hào)為plcs23，plcs24，plcs72，plcs65，plcs64，plcs73，plcs26，plcs66，plcs44；4).病毒TMVcDNA序列的測(cè)定克隆中任意選了一株，名字是plcs72，其插入cDNA大小為1.8Kb左右。用kleuow方法對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定；A.質(zhì)粒的小量提取采用分子克隆上小量提質(zhì)粒的方法，為適應(yīng)測(cè)序要求的高純度而略有變化，其一，第九步重復(fù)一次，以盡可能除去白色沉淀，其二，在苯酚-氯仿抽提前加入無(wú)DNA酶的RNA酶，終濃度為20μg/μl，37℃保溫40～60分鐘，其三，苯酚-氯仿以后，再用1倍體積氯仿∶異戌醇(24∶1)洗二次，其四，干燥后的沉淀溶于50μl TE(PH8.0)后，加入30μl120%PEG(6000，8000)-2.5MNaCl倒置混勻水浴60分鐘(-70℃5--10分鐘)12，000克離心15分鐘，吸去上清，用1μl 70%冷乙醇洗沉淀離心抽干，將沉淀溶解在50μl TEPH8.0中；B.質(zhì)粒的堿變性加5.5μl 2N NaOH，在室溫下放置5分鐘，再加20μl 50M NH4Ac混勻，加入27的無(wú)水乙醇，冰上保溫60分鐘(-70℃5μl)取出在12，000克下離心10分鐘，用200μl，70%乙醇洗，離心后，抽干沉淀，沉淀溶于ddH2O中，使其濃度是0.5μg/μl左右；C.引物與模板的結(jié)合取6μl模板(～3μg)，加1.5μl 10×klenow buffer 3μl T7prmer 10μg/μg混勻，把Ependorf 管漂在一個(gè)250μl裝滿水的燒杯中，放入微波爐加熱，待水開(kāi)始膠，取出燒簿，使其在室溫下自然降溫，降到室溫后，室溫下離心進(jìn)行下一步；D.Klenow測(cè)定DNA序列再加入4μlα-32P-dATP(或5μl-α35與-dATP及1.0～1.5μlKlenow(7μ/μl)混勻；再注有A、C、G、T四個(gè)硅化的Eppendorf管中加入3μl的dNTP 5ddNTP混合物，迅速加入剛混好的模板和酶的混合物3μl，37℃-40℃再保溫30分鐘，取出，分別加入1μl追加溶液37℃-40℃再保溫30分鐘，加入5μl反應(yīng)停止液；E.序列膠采用8%聚丙烯 胺膠，0.4mm厚，成份丙烯胺 甲叉丙烯胺膠 尿素 10×TBE ddH2O 10%APT EMED7.6g0.4g 48g 10ml40ml 500μl 50μl放射自顯影，序列測(cè)定結(jié)果如下(1)用plcs 72質(zhì)粒，模板準(zhǔn)備；依次 λdⅢ plcs72ds plcs72ds plcs72ds上樣量 4μl 6μl 6μl 6μl(2)以自顯影進(jìn)行序列分析對(duì)plcs72的初步測(cè)定，獲得如下結(jié)果，從膠上讀出TATCG，ATAAG，CTTGG，ATATC，ATCGG，AATTC，CTGCA，GCCCG，TAATA，CATCA，CGACA，GAGGA，TGCAT，TGTGT，ATTAC，GATCC，CCTAA，AGTTG，ATCTC，GAAAC，TTGGT，(G)CTAAA，CACCA，TCAAG，GATTG，GGAAC，ACTTG，G，共136bp，其中polylinker39個(gè)，cDNA97bp；5).TMV外殼蛋白基因(CP基因)的獲得已經(jīng)確定TMVCP基因在3′端，CP基因長(zhǎng)為500bp左右，cDNA合成由3′端開(kāi)始，所以只要約800bp的cDNA就有可能取得需要的基因，經(jīng)過(guò)酶切鑒定，選出plcs70和plcs26兩個(gè)質(zhì)粒，它們片段大小分別是900bp及1.1Kp，其中包括了CP基因；將CP基因轉(zhuǎn)到土壤農(nóng)桿菌Co24質(zhì)粒；轉(zhuǎn)入的方法有兩種a.用雙酶切出，定向連入Co24；用Bam HI和EcoR I切出cDNA，用Bg1 Ⅱ，EcoR I 切Co24，Bam H I與Bg1 Ⅱ同尾，很容易把含CP基因的片投定向轉(zhuǎn)入Co24；b.用酶切出cDNA，用酶切開(kāi)Co24后，用Klenow把所有片段補(bǔ)成平末端，連接篩選。由這種方法可以獲得兩個(gè)方向的插入；對(duì)plcs70使用方法a，對(duì)plcs26使用方法b；6).用上述5)中的TMV外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞的培養(yǎng)及選育出抗病毒TMV煙草菌株及菌液制備選用土壤農(nóng)桿菌GV3111-SE(PTiH40)；挑取單菌落，在LB+Km50mg/l+Cm25mg/l+SPC100mg/l液體培養(yǎng)基中，200rpm，28℃培養(yǎng)24-36小時(shí)，至細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，3000rpm離心10分鐘，棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍；稀釋好的菌液用于轉(zhuǎn)化；煙草材料取溫室中新鮮的巴什馬型香料煙(Oeiental tobocco)的煙草葉片，清水洗凈；先放入75%乙醇中消毒30秒，再入10%次氯酸鈉溶液中消毒8-10分鐘，無(wú)菌水清洗三次；將表面消毒好的葉片剪成1平方米的葉塊，用于轉(zhuǎn)化；哺育細(xì)胞選用生產(chǎn)迅速的胡羅卜懸浮細(xì)胞系；植物培養(yǎng)基(1)T1，(用于細(xì)胞和葉片其培養(yǎng))，MS培養(yǎng)基，3%蔗糖，1mg/l6-BA，0.1mg/l NAA，瓊脂粉0.9%，PH=5.6-5.8，高壓滅菌；(2)T2，(用于預(yù)培養(yǎng))，T1培養(yǎng)基，500mg/l，芐青霉素(carb)；(3)T3，(用于篩選培養(yǎng))，T1培養(yǎng)基，100mg/l km，500mg/lcarb；(4)T4，(用于生根)，MS培養(yǎng)基，100mg/l，500mg/l， carb；哺育細(xì)胞培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基；細(xì)菌培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，附加不同種類和濃度的抗生素；轉(zhuǎn)化步驟(全部在無(wú)菌條件下進(jìn)行)將葉片放入制備好的菌液中，浸泡3-5分鐘取出，在無(wú)菌濾紙上吸干表面菌液；T1培養(yǎng)基表面鋪一層哺育細(xì)胞，其上覆蓋一無(wú)菌濾紙，將1中已浸菌的葉塊擺放在濾塊上；28℃，黑暗中共培養(yǎng)48小時(shí)；將葉塊轉(zhuǎn)入T2培養(yǎng)基中，放置光下，25-28℃培養(yǎng)24小時(shí)；將葉塊轉(zhuǎn)入T3培養(yǎng)基中，光下25-28℃培養(yǎng)，約15天后葉塊切口處有愈傷組織形成和芽點(diǎn)的分化；葉塊繼續(xù)在T3上培養(yǎng)基，每20天左右換一次新鮮培養(yǎng)基，約2-3個(gè)月后，芽可長(zhǎng)成高3-5cm的小植株；切下較大的小植株，轉(zhuǎn)T4培養(yǎng)基中，20天左右開(kāi)始有根生成；繼續(xù)培養(yǎng)40天左右，形成發(fā)達(dá)根系；從培養(yǎng)瓶中取出根系發(fā)達(dá)的植株，無(wú)菌水洗凈瓊脂，移入土壤中；開(kāi)始2-3周將植株用罩子罩住，待植株健壯后，取下罩子，在溫室中培養(yǎng)(這步不需在無(wú)菌條件)；至此，已獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1、1)中所述的方法，其特征是純化病毒TMV紫外掃描的結(jié)果是A280/260＝0.82濃度1.103/3.1×1000/30＝12mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2)中所述的方法，其特征是病毒TMV RNA提取的紫外掃描結(jié)果是A260/280＝2.2濃度＝0.22/25×100＝0.88mg/ml，RNA電泳結(jié)果6.4Kp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、3)中所述的方法，其特征是cDNA堿性膠放射自顯影結(jié)果PA4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、4)中所述的方法，其特征是cDNA克隆到Bluescript質(zhì)粒中篩選，篩選獲得不同大小的克隆分別編號(hào)為plcs23，plcs24，plcs72，plcs65，plcs64，plcs73，plcs26，plcs66，plcs44。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、5)中所述的方法，其特征是TMV cDNA測(cè)序1)用plcs72質(zhì)粒，模板準(zhǔn)備依次λdⅢ plcs72ds plcs72ds plcs72ds上樣量4μl 6μl 6μl 6μl2)以自顯影進(jìn)行序列分析，對(duì)plcs72的初步測(cè)定，獲得如下結(jié)果，從膠上讀出TATCG，ATAAG，CTTGG，ATATC，ATCGG，AATTC，CTGCA，GCCCG，TAATA，CATCA，CGACA，GAGGA，TGCAT，TGTGT，ATTAC，GATCC，CCTAA，AGTTG，ATCTC，GAAAC，TTGGT，(G)CTAAA，CACCA，TCAAG，GATTG，GGAAC，ACTTG，G；
7.根據(jù)權(quán)利要求1、5)中所述的，其特征是經(jīng)過(guò)酶切篩選，選出plcs70和plcs26，它們片段大小分別是900bp及1.1Kp，其中包括了CP基因;將CP基因轉(zhuǎn)到土壤農(nóng)桿菌Co24質(zhì)粒，用單切點(diǎn)酶切方法從獲得的16個(gè)克隆中選出第15號(hào)定名為plcs70-15，是含coat protein基因的Ti質(zhì)粒;plcs26轉(zhuǎn)入到土壤農(nóng)桿菌Co24，plcs26用Bam H I和EcoR I切出cDNA，由Klenow變?yōu)槠侥┒诉B入Co24，從獲得69個(gè)克隆中，酶切鑒定，第32號(hào)含有CP基因定名為plcs26-3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、6)中所述的用TMV外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞的培養(yǎng)及選育出抗病毒TMV煙草的方法，其特征是用帶有TMV-CP基因的土壤農(nóng)桿菌Co24質(zhì)粒轉(zhuǎn)化香料煙草葉片經(jīng)誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)再生苗等步驟，獲得基因組中帶有TMV-CP基因的煙草再生植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、1)中所述的方法，其特征是轉(zhuǎn)TMV還適用于對(duì)大葉煙、蕃茄、甜椒等作物。
全文摘要
一種用基因工程方法培養(yǎng)的抗病香料煙草是從感染煙草花葉病毒的葉片中提取TMV經(jīng)CsCl梯度提純，提取TMV RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)一個(gè)cDNA克隆plcs72的序列測(cè)定進(jìn)一步由cDNA庫(kù)中獲得含外殼蛋白基因(coat protein genc，簡(jiǎn)寫(xiě)cp gene)片段并轉(zhuǎn)入Ti質(zhì)粒，獲得特制Ti質(zhì)粒，用特制Ti質(zhì)粒浸染煙草葉片，用這些葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)，育成完全的基因工程抗TMV工程植株，經(jīng)大田中試，化驗(yàn)評(píng)吸，確定為有生產(chǎn)前途的抗病毒基因工程香料煙草。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1112605SQ95102130
公開(kāi)日1995年11月29日 申請(qǐng)日期1995年3月9日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月9日
發(fā)明者陳章良, 孫寶俊 申請(qǐng)人:北京大學(xué)