專利名稱：用黃青霉支頂孢菌生產(chǎn)頭孢菌素c的方法
含有抗菌素的培養(yǎng)液的后處理通常在達到最大含量后進行。多數(shù)情況下，第一步是通過過濾或離心分離除去細胞和固體。此后可通過萃取或吸附進行活性物質(zhì)富集。純化后的產(chǎn)物一般隨后結晶，并可進而加工成半合成的抗菌素。
在這種逐步法中，可不利地看到許多抗菌素分子如頭孢菌素C(CPC)的不穩(wěn)定性。在發(fā)酵期間已有CPC的分解。這不僅可以純化學地由水浸蝕β-內(nèi)酰胺環(huán)進行，而且可以酶學方式進行，例如通過酯酶(Konecny等人，1973，抗菌素雜志，26，3，135-141)。另外，發(fā)酵時還出現(xiàn)一系列付產(chǎn)物，如脫醋酸頭孢菌素C(DOCPC)和脫乙酰頭孢菌素C(DCPC)，在CPC凈化時必須將其除去。從而造成了明顯的產(chǎn)率損失。
帶有聚合膜或陶瓷膜的交叉流過濾系統(tǒng)已經(jīng)用于處理培養(yǎng)液(Harris等，J.Chem.Techn.Biotechnol.，1988，42，19-30)。至今未看到這種方法可減少頭孢菌素C分解的報導。
本發(fā)明的任務是找到一種可減少頭孢菌素C分解和付產(chǎn)物形成的方法，并可提高單位基質(zhì)上的產(chǎn)量。
現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在黃青霉支頂孢菌發(fā)酵期間使用交叉流過濾組件，可以提高CPC產(chǎn)率，減少DCPC形成，并可延長生產(chǎn)時間。另外，通過過濾和減少DCPC形成，可大大簡化頭孢菌素C的處理。
因此，本發(fā)明涉及一種CPC的制備方法，其特征是，在發(fā)酵過程中用一交叉流過濾系統(tǒng)過濾發(fā)酵溶液，并可補充發(fā)酵器中取出的濾液量。
黃青霉支頂孢菌(Acremoniumchrysogenum)(支頂孢頭孢菌(Cephalosporiumacremonium)及突變體和分辨體(Selektanten)，只要它們產(chǎn)生CPC-衍生物，即適用于本發(fā)明的方法。
營養(yǎng)溶液含有碳源如蔗糖、玉米淀粉、葡萄糖或蜜糖和氮源如大豆粉、花生粉、麥芽提取物或醋酸銨。
營養(yǎng)介質(zhì)還含有無機鹽如磷酸氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、硫酸鎂或磷酸氯鉀。還可向營養(yǎng)介質(zhì)添加脂肪如油酸甲酯或豆油。此外還可添加微量元素如鐵、錳、銅、鋅、鈷或其金屬鹽。
黃青霉支頂孢菌(支頂孢頭孢菌)，優(yōu)選ATCC14615，其培養(yǎng)在20至30℃溫度下，優(yōu)選25℃，PH值為5-8，優(yōu)選7的條件下進行。先在搖瓶中后在發(fā)酵器中于攪拌和通入空氣或純氧條件下需氧培養(yǎng)。在發(fā)酵器中對該微生物培養(yǎng)120至240小時，優(yōu)選130至170小時。
作為交叉流過濾系統(tǒng)，可以使用分離極限為超濾至消毒過濾范圍的、由聚合物、塑料或陶瓷制成的板型、管型、毛細管、卷繞或空心纖維膜組件。優(yōu)先使用孔經(jīng)為0.2μm或4nm的過濾組件。膜材料可用聚砜、聚酰胺、乙酸纖維素、氧化鋁、或氧化鋯。過濾可連續(xù)或間斷地進行。過濾從發(fā)酵器孕育后2-3天開始，可持續(xù)到發(fā)酵結束為止。發(fā)酵溶液通過過濾面的穿流速度為0.5至20m/s，優(yōu)選1-10m/s。
可用相應數(shù)量的液體補充發(fā)酵期間由發(fā)酵器抽出的濾液，或者也可在例如通過吸收分離出有用物質(zhì)后，將濾液送回發(fā)酵器。為此，可用泵打入富含相應鹽類或其它營養(yǎng)介質(zhì)成分的水。
沒有通過膜滲透過去的流體再循環(huán)回發(fā)酵器。
發(fā)酵器和交叉流過濾系統(tǒng)由相應的管或軟管相連通，并在發(fā)酵前消毒。對于100l的發(fā)酵器，約需0.2m2過濾面積。也可用更大和更小的過濾面。
例1黃青霉支頂孢菌ATCC14615的發(fā)酵發(fā)酵在下述營養(yǎng)液中進行預培養(yǎng)介質(zhì)g/l浸泡谷粒11.75乙酸銨4.5蔗糖20.0CaSO4·2H2O 0.5MgSO4·7H2O 0.5PH7.0(用15%(W)NaOH調(diào)節(jié))發(fā)酵介質(zhì)g/l脫脂花生粉100.0醋酸銨6.0葡萄糖→水合物5.0油酸甲酯5.0D，L-蛋氨酸3.0CaSO4·2H2O 5.0MgSO4·7H2O 5.0
CaCO35.0抑泡劑0.5分批返回溶液葡萄糖→水合物500.0D，L-蛋氨酸24.75用偏斜地置于試管中的凝固了的洋菜培養(yǎng)基給100ml預培養(yǎng)介質(zhì)接種(有4個隔板的500ml搖瓶中)。使燒瓶在25至28℃下以每分鐘150轉(zhuǎn)(upm)的轉(zhuǎn)速孵化48小時。用該培養(yǎng)基為另一預培養(yǎng)物接種(1000ml介質(zhì)，5000ml燒瓶，25至28℃，120 upm，58至60小時)。用第二預培養(yǎng)物為一個攪拌發(fā)酵器中的601發(fā)酵介質(zhì)接種。發(fā)酵在25℃下進行。控制通氣，使發(fā)酵營養(yǎng)液中的PO2過量20%。
發(fā)酵74小時后，開始用過濾面積為0.2m2和孔徑為0.2μm的交叉流陶瓷組件(公司Membraflow，a-Al2O3)過濾。遵循下列工藝參數(shù)穿流速度2m/s循環(huán)原輸送速度1500l/h過濾容量2l/h過濾時間68小時下表列出了不用(A)和用交叉流過濾(B)情況下發(fā)酵142小時后的試驗結果
例2像例1那樣進行發(fā)酵。表2列出了用交叉流過濾(B)進行發(fā)酵167小時后和無過濾的平行發(fā)酵進行142小時后中斷的結果比較
權利要求
1.發(fā)酵制備頭孢菌素C的方法，其特征是，在發(fā)酵時用一交叉流過濾系統(tǒng)過濾發(fā)酵溶液，并可補充發(fā)酵器中的濾液量。
2.按權利要求1的方法，其特征是用黃青霉支頂孢菌(Acremonium chrysogenum)。
3.按權利要求1或2的方法，其特征是，用一臺聚合物或陶瓷過濾器作交叉流過濾系統(tǒng)。
4.按權利要求1-3中一或多項的方法，其特征是，過濾器孔徑為4至200nm。
5.按權利要求1-4中一或多項的方法，其特征是，通過過濾器表面的穿流速度為1-10m/s。
6.按權利要求1-5中一或多項的方法，其特征是，用水在發(fā)酵器中補充濾液溶液。
7.按權利要求6的方法，其特征是，用營養(yǎng)液補充濾液溶液。
8.按權利要求6的方法，其特征是，將除去有用產(chǎn)物后的濾液溶液送回發(fā)酵器。
全文摘要
描述了一種發(fā)酵制備頭孢菌素C的方法，其中在發(fā)酵期間用一交叉流過濾系統(tǒng)過濾發(fā)酵溶液?？裳a充由發(fā)酵器抽出的濾液量。
文檔編號C12P37/00GK1071953SQ9211065
公開日1993年5月12日 申請日期1992年8月21日 優(yōu)先權日1991年8月21日
發(fā)明者T·拜爾, W·施拉姆, W·拉斯謝克 申請人:赫徹斯特股份公司