專利名稱：有機酸的生物生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于利用生物技術(shù)生產(chǎn)有機酸的發(fā)明，特別是，本發(fā)明涉及利用微生物的作用將腈化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的有機酸或羧酸。
有機酸或羧酸被用作生產(chǎn)各種化學(xué)藥品的原料，特別是已知的丙烯酸和甲基丙烯酸是例如聚合產(chǎn)物的重要原料，并且煙酸在醫(yī)學(xué)上有重要的應(yīng)用。
將腈化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸的已知技術(shù)有化學(xué)合成技術(shù)和生物技術(shù)?；瘜W(xué)合成法存在著在用強無機酸水解腈的合成中處理廢物的問題，另一方面，生物技術(shù)的優(yōu)點在于用微生物固有的酶作催化劑由此可在溫和條件下獲得酸。
生物技術(shù)的實例可包括如美國專利3，940，316中公開的芽胞桿菌屬、無芽胞桿菌屬(Bacteridium)、細球菌屬和短頸細菌屬的微生物，如日本專利公開2596/1988中提出的Acinetobacter的微生物，如日本專利公開56800/1988中提出的棒狀桿菌屬微生物和如日本專利對外公開(Japanese Patent Laid-Open Publication)132392/1989中提出的產(chǎn)堿桿菌屬的微生物在其中的應(yīng)用。
在美國專利3，940，316中公開的第一組微生物并非明顯地具有高活性以至于此方法不能應(yīng)用于實踐。
鑒于這一點，在例如日本專利公開2596/1988中已經(jīng)提出了改進，從而增強了上述引文中微生物的催化活性，其包括在加入的作為水解酶誘導(dǎo)劑的腈化合物存在下培養(yǎng)微生物菌株。不過此改進存在著培養(yǎng)過程中微生物利用加入到培養(yǎng)基中的腈化合物和要求補充腈的消耗的問題，由此，當(dāng)反應(yīng)在商業(yè)規(guī)模進行時，維持微生物在可能的最高活性水平是困難的。另外一個問題是獲得的活性并不十分滿意。
現(xiàn)在我們發(fā)現(xiàn)在其中加有內(nèi)酰胺化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的屬于紅球菌屬的微生物菌株可容易地產(chǎn)生能夠大量產(chǎn)生腈水解酶的細胞，在商業(yè)規(guī)模此酶作為催化劑可以被用于將腈化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸。
因此本發(fā)明描述了一種生產(chǎn)有機酸方法中的改進方法，其包括通過微生物中固有的腈水解酶的作用將腈化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的有機酸，其改進的方法包括將在內(nèi)酰胺存在下培養(yǎng)紅球菌屬的微生物菌株所獲得的酶用作催化劑。
根據(jù)本發(fā)明，通過在已經(jīng)加入內(nèi)酰胺化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于紅球菌屬的微生物菌株誘導(dǎo)腈水解酶的活性。培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中的內(nèi)酰胺化合物幾乎很少被微生物利用，其在培養(yǎng)基中保持給定的濃度水平，其中腈水解酶誘導(dǎo)穩(wěn)定地發(fā)生，結(jié)果在于容易生成具有很強作用的腈水解酶的微生物細胞。
<腈水解酶的介紹>
在本發(fā)明中用作腈水解酶來源的微生物是那些屬于紅球菌屬的微生物，這種微生物的實例包括紅球菌屬rhodochrous ATCC 33278、紅球菌屬SP.NCIB 11215、紅球菌屬SP.NCIB 11216和紅球菌屬rhodochrous J-1，F(xiàn)ERM BP-1478。
優(yōu)選的微生物是紅球菌屬rhodochrous J-1，F(xiàn)ERM BP-1478，其根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約作為國際保藏保藏于Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Sciences and Technology，Japan，其細菌學(xué)性質(zhì)于歐洲專利公開0307926中公開。
根據(jù)本發(fā)明，這些微生物在加有內(nèi)酰胺化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后才被使用，所用培養(yǎng)基以在加入的內(nèi)酰胺化合物存在下，微生物能在其上生長為條件。例如，培養(yǎng)基含有作為碳源的葡萄糖、蔗糖和甘油;作為氮源的胨、肉膏、酵母膏、氨基酸或各種有機或無機銨鹽;和其它任意的成分如很少量的無機鹽、金屬鹽、維生素等等和內(nèi)酰胺化合物。
可以使用的內(nèi)酰胺化合物的條件是在環(huán)上具有結(jié)構(gòu)-CONH-的有機環(huán)狀化合物，即環(huán)酰胺。較優(yōu)選的內(nèi)酰胺的實例包括4至6個碳原子的ω-氨基酸的分子內(nèi)酰胺，進一步優(yōu)選的實例包括γ-丁內(nèi)酰胺、δ-戊內(nèi)酰胺和ε-己內(nèi)酰胺。這些內(nèi)酰胺化合物可以混合物形式使用。
加入到培養(yǎng)基中的內(nèi)酰胺的量可以由0.05至2.0(W/V)%，較優(yōu)選的是0.1至1.0(W/V)%。
培養(yǎng)可以在有氧條件下，介質(zhì)的pH6至10，較優(yōu)選的是7至9，在15至37℃溫度下，較優(yōu)選的是在25至30℃進行1至7天。
根據(jù)本發(fā)明，有機酸的生物生產(chǎn)方法包括通過紅球菌屬微生物中固有的腈水解酶的作用將腈化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸(-CN→-COOH)。此處所用的“通過微生物中固有的腈水解酶的作用”的語句包括任何類型的酶和酶對它們的底物即腈的任何作用方式，條件是酶是那些通過微生物產(chǎn)生的，并且此酶能夠?qū)㈦娴牡孜镛D(zhuǎn)變成相應(yīng)的有機酸。例如包括在本發(fā)明中的方法是如上述的微生物生長于其中的培養(yǎng)液或通過過濾培養(yǎng)液獲得的細胞懸浮液中加入作為酶的底物的腈化合物;細胞衍生物如壓榨的細胞，或由其產(chǎn)生的粗的或純化的酶或固相細胞或細胞衍生物的懸浮液中加入作為酶的底物的腈化合物的方法;和在內(nèi)酰胺化合物的存在下微生物菌株的培養(yǎng)在有腈化合物存在下進行，其中酶的誘導(dǎo)作用和酶對腈化合物的作用過程就地進行的方法。
反應(yīng)溶液中底物的濃度不受任何限制，但較優(yōu)選的范圍是0.1至10(W/V)%。底物可以一次全部或分批加入到反應(yīng)溶液中。
水解反應(yīng)的溫度和pH分別可以是5至50℃和pH4至10。依賴于所用底物的濃度，所用細胞濃度或所用的其它反應(yīng)條件，反應(yīng)時間可以是1分鐘至48小時。
根據(jù)本發(fā)明可被水解的腈化合物的實例包括脂肪族的和芳香族的一腈化物和二腈化物。脂肪族腈較優(yōu)選的是2至6個碳原子的腈化合物，并且包括未飽和腈如丙烯腈、甲基丙烯腈和丁烯腈;飽和腈如乙腈、丙腈、丁腈和戊腈;和二腈如丁二腈和己二腈。
芳香腈的實例包括具有4至10個碳原子的芳環(huán)的腈化合物，并且芳香腈的幾個典型的實例是如下列通式[Ⅰ]-[Ⅶ]所表示的化合物
其中典型的是4、3-和2-氰基吡啶。
其中R1和R2分別表示H、CH3、OH、OCH3、OC2H5、Cl、F、CN、NH2或NO2。
其中典型的是苯基腈、2-、3-和4-氯苯基腈、2-、3-和4-氟苯基腈、3-和4-溴苯基腈、3-和4-硝基苯基腈、3-或4-氨基苯基腈、3-和4-羥基苯基腈、2-、3-和4-甲苯基腈、2-、3-和4-甲氧基苯基腈、3-和4-乙氧基苯基腈、鄰苯二甲腈、間苯二腈、對苯二腈，2，6-二氯苯基腈，2，4-二氯苯基腈，3，5-二氯苯基腈，2，6二氟苯基腈和3，4-二氟苯基腈。
其中典型的α和β-萘甲腈。
其中X表示S或O。
其中典型的是2-噻吩甲腈和2-呋喃甲腈。
其中典型的實例是5-氰基吲哚。
其中典型的實例是氰基吡嗪。
其中典型的實例是pyperonylonitrile。
應(yīng)用以上涉及的腈水解酶處理這些作為其底物的腈化合物將會產(chǎn)生相應(yīng)的酸，幾乎沒有相應(yīng)的酰胺化合物生成，并且產(chǎn)率幾乎是100%mole。生成的有機酸在反應(yīng)溶液/介質(zhì)中富集，并可通過合適的方法由其中獲得有機酸。例如通過例如離心分離由微生物細胞中分離出反應(yīng)溶液，再將其通過例如用酸處理除去氨，然后通過例如萃取或蒸餾得到有機酸。
參考下列僅作說明作用的實施例，將更加詳細地描述本發(fā)明。
實施例1制備含有1.5%的葡萄糖、0.75%的谷氨酸鈉、0.05%的磷酸二氫鉀、0.05%的磷酸氫鉀、0.05%的七水硫酸鎂、0.1%的酵母膏和0.5%的ε-己內(nèi)酰胺，pH7.2的培養(yǎng)基，將其以60ml一份倒入500ml的Sakaguchi燒瓶中，于高壓滅菌器中120℃滅菌20分鐘。
將于表1中列舉的每種微生物菌株接種于培養(yǎng)基上，于28℃振蕩培養(yǎng)48小時。
通過離心由每種培養(yǎng)物中獲得每種微生物細胞，將其用0.85%的氯化鈉水溶液洗滌，然后懸浮于與培養(yǎng)物相同量的0.85%的氯化鈉水溶液中。
將0.1ml的每種細胞懸浮液加到含有50mM丙烯腈或1.0ml的3-氰基吡啶、0.5ml100mM的pH7.8的磷酸鉀緩沖液和0.4ml蒸餾水的反應(yīng)溶液中，反應(yīng)于20℃進行20分鐘。通過加入0.2ml的1N HCl終止反應(yīng)，并通過HPLC測定生成的丙烯酸或煙酸的量，其中使用日本MS Kiki，Inc.產(chǎn)生的M & S Pack C18柱獲得的結(jié)果列于表1。
表1
所有可能的水解中間體中未檢測到丙烯酰胺和煙酰胺。
作為對照，除了不使用ε-己內(nèi)酰胺外，按這4種相同的情況進行實驗，未檢測到如表1所顯示的腈水解酶的活性。
實施例5-6除了所用內(nèi)酰胺，用γ-丁內(nèi)酰胺或δ-戊內(nèi)酰胺代替δ-己內(nèi)酰胺，和培養(yǎng)時間，用96小時代替48小時外，按實施例1的步驟進行。
獲得的結(jié)果列于表2。
表2
實施例7-13將紅球菌屬rhodochrous J-1于與實施例1所用的相同培養(yǎng)基上在28℃培養(yǎng)96小時。將獲得的細胞碾碎，并將碾碎細胞經(jīng)離心后的上層清液相對于含有30(V/V)%甘油、pH7.0、10mM磷酸鉀緩沖液進行滲析，然后用經(jīng)相同緩沖液平衡過的DEAE-Sephacel柱(Pharmacia)處理。經(jīng)在相同緩沖液中的KCl(0-0.6M)線性梯度洗脫蛋白質(zhì)，收集具有腈水解酶活性的組份。
所獲得的粗腈水解酶溶液被測定了其對表3列舉的腈化合物的活性。
通過于20℃用蒸餾水稀釋的(有必要的話)0.5ml的粗酶溶液與含有1.0ml 20mM表3列舉的每種腈化合物和0.5ml 100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.8)的反應(yīng)溶液的作用，進行了活性檢測。
通過加入0.2ml的1N HCl終止反應(yīng)。
生成的有機酸的量通過HPLC檢測，其中使用日本M & S Kiki Inc.生產(chǎn)的M & S Pack C18柱。
獲得的結(jié)果列于表3，共中“1計數(shù)單位(U)”定義為以1μmole/min的速率由腈生成有機酸的速度。
實施例14將紅球菌屬rhodochrous J-1，F(xiàn)ERM BP-1478在與實施例1中所使用的相同培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)96小時。通過離心由培養(yǎng)基中得到細胞，并用50mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.8)洗滌，然后以相同的量將細胞懸浮于相同的緩沖液中。
維持20℃，攪拌下將丙烯腈分批加入50ml的細胞懸浮液中，以使其濃度保持低于200mM的水平。幾乎等量地生成丙烯酸并富集在反應(yīng)溶液中，作為付產(chǎn)物的丙烯酰胺的產(chǎn)量不高于0.5%(摩爾比)。
順便地說，通過氣相色譜的手段對培養(yǎng)后培養(yǎng)基中ε-己內(nèi)酰胺的分析表明ε-己內(nèi)酰胺的含量為4.8g/liter，相當(dāng)于收率為96%。
對比實施例1-4制備含有1.0%的甘油、0.5%的胨、0.3%的酵母膏和0.3%的肉膏pH7.2的培養(yǎng)基，將其以每份100ml倒入500ml的Sakaguchi燒瓶中，在高壓滅菌器中于120°滅菌20分鐘。無菌條件下每個燒瓶中加入100μl的異戊腈。
將表4中列舉的每種微生物菌株接種于每個培養(yǎng)基中，并于28℃振蕩培養(yǎng)48小時。
培養(yǎng)后，按實施例1-4制得細胞懸浮液并測定腈水解酶的活性。獲得的結(jié)果列于表4。
權(quán)利要求
1.制備有機酸的方法，其包括通過微生物固有的腈水解酶的作用將腈化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的有機酸，改進方法包括在內(nèi)酰胺化合物存在下通過培養(yǎng)紅球菌屬微生物菌株得到的酶用作酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中紅球菌屬微生物菌株選自一組紅球菌屬rhodochrous。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中紅球菌屬rhodochrous選自RH.rhodochrous J-1、FERM BP-1478和Rh.rhodochrous ATCC 33278。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中紅球菌屬rhodochrous是Rh.rhodochrous J-1、FERM BP-1478。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中紅球菌屬選自紅球菌屬SP.NCIB 11215和紅球菌屬SP.NCIB 11216。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中內(nèi)酰胺化合物選自4至6個碳原子的環(huán)狀分子內(nèi)酰胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中內(nèi)酰胺的量相對于培養(yǎng)紅球菌屬微生物菌株的培養(yǎng)基在0.05至2.0W/V百分比的范圍內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中腈化合物選自脂肪族和芳香族的一腈化物和二腈化物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中腈化合物選自含有2至6個碳原子的脂肪族一腈化物和二腈化物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中腈化合物是丙烯腈。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中腈化合物選自芳香母核上含有4至10個碳原子的芳香族-腈化物和二腈化物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中腈化合物選自下列一組的芳香腈
其中R1和R2分別表示H、CH3、OH、OCH3、OC2H5、Cl、F、CN、NH2或NO2;
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中芳香腈是式[Ⅰ]的氰基吡啶。
全文摘要
通過腈水解酶作用于腈將腈如丙烯腈或氰基吡啶轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的羧酸如丙烯酸或煙酸的一種改進的生物方法，改進之處在于在內(nèi)酰胺化合物存在下培養(yǎng)如Rhodchrous J-1 FERM BP-1478的紅球菌屬微生物，它們用作酶的來源。
文檔編號C12P17/12GK1055954SQ9110134
公開日1991年11月6日 申請日期1991年2月28日 優(yōu)先權(quán)日1990年2月28日
發(fā)明者山田秀明, 長沢透, 中村哲二 申請人:山田秀明, 日東化學(xué)工業(yè)株式會社