專利名稱：：新的多肽、能表達(dá)它們的dna序列、制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有對映選擇酰胺酶活性的多肽。還涉及表達(dá)這些多肽需要的遺傳物質(zhì)，以及制備它們的微生物方法。最后，本發(fā)明涉及這些多肽的用途，以及從外消旋酰胺對映選擇性合成酸類的轉(zhuǎn)化微生物的應(yīng)用。具體說來，涉及丙酸類，特別是(S)-2-芳基-丙酸和(R)-2-芳氧基-丙酸。由于具有不對稱碳原子，許多分子存在兩個不同的立體異構(gòu)形式、R和S，一個是另一個的鏡象。2-芳基-丙酸就是這種情況。絕大多數(shù)時候，這些分子作為對映混合物存在，兩個對映體具大致相同比例。在某些情況下，只需一種特定的異構(gòu)體，因此就需要一種實際的手段分離這兩種異構(gòu)體，或者采用立體選擇性合成來得到需要的異構(gòu)體。本發(fā)明屬能夠以對映選擇的方式水解酰胺的多肽范疇。特別是關(guān)于水解外消旋2-芳基-丙酰胺類為(S)-2-芳基-丙酸類，以及水解外消旋2-芳氧基-丙酰胺類為(R)-2-芳氧基-丙酸類。已證明微生物中有酶活性，短桿細(xì)菌屬(Brevibacterium)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)菌株很顯著(歐洲專利No.89400197.3)，特別是短桿細(xì)菌菌株R312(CBS717.73)。此外，如紅球菌(Rhodococcus)菌株也具有酶活性。本發(fā)明包括表征和提純這些對映選擇性酰胺酶活性物，以及克隆和序列分析負(fù)責(zé)表達(dá)它們的遺傳物質(zhì)。下述術(shù)語“Amd”表示所有對映選擇酰胺酶活性物，術(shù)語“AmdSequence”表示能編碼所說的酰胺酶活性物的核苷酸序列。具體說來，本發(fā)明的目的是采用DNA重組技術(shù)，在不同宿主生物中，使這些對映選擇性酰胺酶獲得高水平表達(dá)。因此，本發(fā)明的目的之一涉及能編碼具有對映選擇性酰胺酶活性的多肽的DNA序列。特別關(guān)系到外消旋的2-芳基-丙酰胺類。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及能編碼短桿細(xì)菌R312(示于圖8)或紅球菌(示于圖13)的對映選擇性酰胺酶的核苷酸序列。以及編碼相同多肽的任何簡并序列。本發(fā)明還涉及能編碼具對映選擇性酰胺酶活性多肽的這些DNA序列或其片斷的雜交序列。本發(fā)明還涉及含這些DNA序列的基因。研究這些酰胺酶多肽序列之間的同源性，揭示出一個對觀察到的活性起作用的高守恒區(qū)。該區(qū)域相應(yīng)于表示在圖13(核苷酸618至788)中的肽序列的氨基酸137至193及相應(yīng)于上述短桿細(xì)菌R312的酰胺酶肽序列的氨基酸159至215，由于具有這樣一個守恒區(qū)，使其具嚴(yán)格同源性(67%)。因此，本發(fā)明的目的之一是涉及如前所述的DNA序列，其特征是它至少含有編碼圖13中氨基酸137至193或圖8中的氨基酸159至215的序列或者與之至少有50%同源性的肽序列。特別是，本發(fā)明的目的之一是涉及DNA序列，其特征是它含有示于圖8和13中的所有或部份Amd序列或其變種。在本發(fā)明中，“變種”意味著保存起始序列性質(zhì)的所有序列，甚至包括各種因素引起的變化結(jié)果，例如遺傳密碼的突變、缺失、插入或簡并。更確切地說，該DNA序列含有圖8或圖13所示的序列。通過多種方法可獲得該DNA序列。一般方法是，借助從純化多肽獲得的核苷酸探針，克隆能編碼所需多肽的染色體DNA片斷。采用不同方法，包括引物延伸、限制性內(nèi)切酶、連結(jié)物插入、或連接子寡核苷酸配位，可構(gòu)成含所需DNA序列的核苷酸插入物。然后采用文獻(xiàn)中已知方法制圖和定序。同時也可采用其它方法，包括應(yīng)用DNA和/或部份或全部的化學(xué)合成。這些技術(shù)都是公知的，描述在圖8和13中的結(jié)構(gòu)提供了在任何微生物中，采用經(jīng)典的方法對等同序列的分離。由于已證明在不同對映選擇酰胺酶之間的同源性，本發(fā)明提供了可于任何基因庫中識別雜種基因(具有足夠同源性的基因)的探針生產(chǎn)。很容易證實這些對映選擇酰胺酶的基因編碼。采用這種方式，可在任何微生物中獲得高含量的酰胺酶，也可發(fā)現(xiàn)新的對映選擇酰胺酶活性物。本發(fā)明還涉及具有對映選擇性酰胺酶活性的多肽，它含有至少下述之一的肽序列-圖13中相應(yīng)于氨基酸137至193的序列，-圖8中相應(yīng)于氨基酸159至215的序列，-與這些序列至少50%同源的序列。本發(fā)明的另一個目的涉及其結(jié)構(gòu)來源如上述DNA序列的新的多肽，該多肽具有對映選擇性酰胺酶活性。這些多肽由自然或重組的微生物繁殖，再經(jīng)提取并純化而得。提純采用連續(xù)步驟，包括從培養(yǎng)物中制備粗提取物，提取物的硫酸銨分餾，再經(jīng)過色譜和凝膠過濾純化。詳細(xì)內(nèi)容示于實施例中。更確切地說來，本發(fā)明涉及短桿細(xì)菌R312和紅球菌的對映選擇酰胺酶。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化微生物，它含有至少一種上述提到的DNA序列表達(dá)盒。這些盒優(yōu)選含有本發(fā)明的DNA序列，置于調(diào)節(jié)DNA序列控制之下，保證其在所需宿主中的表達(dá)。這些盒可在宿主的染色體中組合，或插入帶有選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒和宿主復(fù)制機能的起點上。本發(fā)明的意義之一是多肽在人工條件下的表達(dá)，即在特別有利條件下培養(yǎng)的某些細(xì)胞中的異源序列的表達(dá)，和/或為促進(jìn)生成和/或改善培養(yǎng)條件，在至少部份異源調(diào)節(jié)信號控制下的同源序列的表達(dá)?？刂艱NA序列之表達(dá)的DNA序列(屬本發(fā)明目的)優(yōu)選帶有轉(zhuǎn)錄子和轉(zhuǎn)譯起始區(qū)者。該區(qū)含啟動子和核糖體結(jié)合位點，可以與肽產(chǎn)物的位點同源或異源。調(diào)節(jié)區(qū)的選擇取決于使用的宿主。特別是，對原核宿主來說，異源啟動子可從強細(xì)菌啟動子中選擇，例如色氨酸操縱子Ptrp的啟動子、乳糖操縱子Plac的啟動子、噬菌體λPR和PL的左或右啟動子、棒狀桿菌(Corynebacteria)噬菌體的強啟動子、或者甚至棒狀桿菌的同源啟動子。更確切地說來，在λ右啟動子的情況下，優(yōu)選溫度敏感型的PRCⅠts。對如酰母類的真核生物來說，可采用酵母糖酵解基因啟動子，例如磷酸甘油酸激酶(PGK)基因、甘油醛-3磷酸脫氫酶(GPD)基因、乳糖酶(LAC4)基因和烯醇酶(ENO)基因的啟動子。當(dāng)宿主微生物是原核微生物時，核糖體固定位點優(yōu)選來自λCⅡ基因或者棒狀桿菌的同源基因者。在宿主內(nèi)、轉(zhuǎn)錄子和轉(zhuǎn)譯端功能區(qū)置于編碼順序的3′位，質(zhì)粒也帶有供重組宿主選擇的一個或幾個標(biāo)記。優(yōu)選突出的標(biāo)記，例如對氨芐青霉素或鏈霉素這些抗生素有抗性的，或?qū)ζ渌舅赜锌剐缘倪@類標(biāo)記物。所用的宿主微生物較為突出的包括腸細(xì)菌如大腸桿菌(E.Coli)和棒狀細(xì)菌(Corynebacterium)屬，短桿細(xì)菌(Brevibacterium)屬或紅球菌(Rhodococcus)屬這類棒狀桿菌。當(dāng)然根據(jù)同樣原則其它類型的細(xì)胞也可使用。本發(fā)明的目的之一，涉及前面所述質(zhì)粒，這些質(zhì)粒至少包函轉(zhuǎn)錄子和轉(zhuǎn)譯起始區(qū)，編碼所需多肽的DNA序列以及精選的標(biāo)記。本發(fā)明也涉及前述轉(zhuǎn)化微生物，有關(guān)它們在對映選擇性酰胺酶制備中的應(yīng)用，以及從外消旋酰胺對映選擇性合成酸類的用途。制備對映選擇性酰胺的程序包括，培養(yǎng)前面敘述過的微生物(在提供能編碼對映選擇性酰胺酶序列表達(dá)的條件下培養(yǎng))，然后從產(chǎn)生的酰胺酶中分離出微生物。更確切地說，本發(fā)明涉及，在由相應(yīng)的外消旋2-芳基-丙酸酰胺類對映選擇性合成2-芳基-丙酸類中，前面描述過的重組微生物或多肽的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，描述一個推薦的程序從相應(yīng)的外消旋酰胺制備有機酸的立體異構(gòu)體，其特征在于該外消旋酰胺置于存在前述的轉(zhuǎn)化微生物的條件下，或存在由前面敘述的方法獲得的多肽的情況下，然后將得到的立體異構(gòu)體回收。在適于此法的酰胺中，應(yīng)提及酮洛芬的外消旋酰胺，從它們可以制備醫(yī)藥工業(yè)上有用的S(+)酮洛芬。下面所列出的是本發(fā)明其它的典型和優(yōu)異的實施例和圖表。這些只應(yīng)視為例證，而不是限制。圖表的描述圖1A、從短桿細(xì)菌R312純化的酰胺酶獲得的肽序列(N-末端和內(nèi)部)。B、從內(nèi)部肽片斷得到的寡核苷酸探針。圖2A、從短桿細(xì)菌R312酰胺酶得到的N-末端肽片斷，設(shè)計探針Sq918的方法。B、特異性探針Sq918。圖3A、用EcoRⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和SphⅠ消化的短桿細(xì)菌R312得到的全部染色體DNA與探針Sq918雜交作用概貌。B、用BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、SalⅠ、SmaⅠ、SphⅠ、SstⅠ和XhoⅠ消化短桿細(xì)菌R312得到的全部染色體DNA與探針Sq762雜交作用的概貌。圖4質(zhì)粒PXL1650和pXL1651的限制性圖。圖5含短桿細(xì)菌R312的對映選擇性酰胺酶基因的5.4KbPstⅠ片斷的限制性圖。圖6含短桿細(xì)菌R312的對映選擇性酰胺酶基因的BamHⅠ-PstⅠ片斷的序列分析方法。圖7已序列分析片斷的開放解讀結(jié)構(gòu)的分析。圖8短桿細(xì)菌R312的對映選擇性酰胺酶基因的核苷酸和肽的序列。圖9質(zhì)粒pXL1724的限制性圖。圖10質(zhì)粒pXL1751的限制性圖。圖11質(zhì)粒pXL1752的限制性圖。圖12Coomassie蘭染色后的12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠、表示在大腸桿菌B和大腸桿菌K12E1035菌株中短桿細(xì)菌R312的對映選擇酰胺酶的表達(dá)，每個泳道相應(yīng)蛋白質(zhì)量相當(dāng)于60μl在2.1(E103S)或0.7(E.coliB)的O.D上的培養(yǎng)物。聲處理(pXL1029和pXL906)的總和T包括分別在PRCⅠts或Ptrp啟動子的控制下的IL1-β基因。圖13紅球菌對映選擇酰胺酶的核苷酸和肽序列(源自質(zhì)粒pXL1836的BamHⅠ片段)。圖14往復(fù)性載體pSV73的限制性圖。圖15表達(dá)質(zhì)粒pYG811B的限制性圖。圖16表達(dá)質(zhì)粒pYG817B的限制性圖。圖17表達(dá)質(zhì)粒pYG822的限制性圖。起始質(zhì)粒Jung等曾經(jīng)描述過質(zhì)粒pXL1029(1988，Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.139.129-146)。它攜帶含PRCⅠts-RBScⅡ△tRⅠ的EcoRⅠ-Ndel片斷。實施例1鑒別和提純短桿細(xì)菌R312的對映選擇性酰胺酶1.1.鑒別與2-芳基-丙酰胺衍生物比較，2-芳氧基-丙酰胺的衍生物(R.S)-2-(4-羥基-苯氧基)-丙酰胺(HPP酰胺)是對映選擇性酰胺酶較好的底物，顯著地優(yōu)于2-苯基-丙酰胺和2-(3-苯甲酰基-苯基)-丙酰胺。而且對應(yīng)于HPP酰胺的R對映體的酰胺酶的選擇性代表對應(yīng)于2-芳基-丙酰胺衍生物S對映體的選擇性。結(jié)果是用2-(4-羥基-苯氧基)-丙酰胺作為底物來鑒定對映選擇性酰胺酶活性。反應(yīng)在25℃，于短桿細(xì)菌R312存在下，在50mM磷酸鈉緩沖液中攪拌，pH7.0的條件下進(jìn)行。以55/40/5(V/V)的比例加入0.05M磷酸、乙腈和1NHCl混合物停止反應(yīng)。離心后，培養(yǎng)物上層清液用反相高效液相色譜(HPLC)(Hibar-MerkRP-18，5μm)分析、洗脫液是0.005M磷酸和乙腈的溶液(85/15)(V/V)。將洗脫峰與標(biāo)準(zhǔn)峰比較測量出相應(yīng)的HPP酰胺和HPP酸的濃度。對于該底物，對映體的過量程度用(R-S)/(R+S)×100表示，其中R和S分別是HPP酸的R和S對映體的濃度。對映體的過量值可通過旋光測定(用589nm的鈉吸收)或通過手性柱用HPLC測定推測出。從整個細(xì)胞和可溶物提取獲得的活性物質(zhì)，分別是15U/mg和24U/mg的蛋白質(zhì)，(1U＝每小時形成1μmolHPP酸)，(R)-HPP酸對映體過量程度是95%。結(jié)果證明，短桿細(xì)菌R312具備對映選擇酰胺酶，能水解外消旋2-芳基-丙酰胺為相應(yīng)的S酸。從外消旋2-苯基-丙酰胺和外消旋2-(3-苯甲?；?苯基)-丙酰胺水解為各自的S酸，都證實了這一點，一種對映體的過量值可高于93%。1.2.純化純化在4℃下進(jìn)行，細(xì)胞(短桿細(xì)菌R312干重40g)被解凍并懸浮于30ml緩沖液A中(50mM磷酸鈉，pH7，5mMβ-巰基乙醇)。然后用聲處理打碎細(xì)胞，在20000rpm下離心處理30分鐘，除去細(xì)胞膜碎片。于攪拌下，在30ml上層清液中，緩緩加入25ml10%的鏈霉素硫酸鹽。45分鐘后，如上所述澄清溶液，用硫酸銨處理所得的上層清液。在硫酸銨飽和度30.8%和56.6%之間蛋白質(zhì)成份被沉淀出。離心收集沉淀、并把它溶于35ml的緩沖液A中，然后用同樣緩沖液緩慢的滲析。把所得的溶液調(diào)節(jié)到20%硫酸銨飽和度，離心處理。加到苯基-瓊脂糖CL-4B柱(藥用)上，此柱系用緩沖液A，于20%飽和度的硫酸銨下保持平衡的。用同樣緩沖液、洗脫有活性的餾份。然后用AmiconDiafloPM10細(xì)胞超濾濃縮到體積為18ml，然后在濃縮液中加入丙三醇(10%)。把所得溶液加到用50mMTris-HCl、pH7，100mMNaCl予先平衡的UltrogelAcA44柱(IBF-Bio-technics，F(xiàn)rance)上。收集含有最高比活度的餾份(約占柱中總載活性成份的32%)、濃縮、用相同的膠進(jìn)行重復(fù)過濾步驟。同樣用SDS-PAGE分析含有最高比活度的餾份(約占柱中所載全部蛋白質(zhì)的30%)并保存之。也測定純化蛋白質(zhì)的對映選擇性。此種純化法可使所得酶的純度大于80%，其比活度為815U/mg。在該步驟中，從SDS-PAGE上，可見表現(xiàn)分子量為59+/-5KD的主要區(qū)帶，它至少相應(yīng)于全部蛋白質(zhì)的80%。而且從HPLCTSK3000柱中洗脫的酰胺酶活性物的分子量為122KD，表明該酶是二聚體形式。表1列出了不同餾份的特征。該表也描述了提純短桿細(xì)菌R312的對映選擇性酰胺酶的不同步驟-以鏈霉素硫酸鹽沉淀后，取40g濕細(xì)胞。-在下述條件下，一單位(U)相當(dāng)于每小時形成1μmol的HPP酸。表1</tables>實施例2克隆短桿細(xì)菌R312的對映選擇性酰胺酶2.1蛋白質(zhì)序列的衍生使用純化酶分別確定相應(yīng)的短桿細(xì)菌R312的對映選擇酰胺酶的N-末端(27個殘基)和胰蛋白酶(Trypsic)內(nèi)部片斷(21個殘基)的肽序列。將3nmol的酰胺酶進(jìn)行還原和羧甲基化制備反應(yīng)，然后把主要蛋白質(zhì)成分脫鹽，用反相HPLC純化至均一。然后用Applied.BiosystemsModel470A儀器進(jìn)行連續(xù)自動的Edman降解，確定N-末端的序列。用這種方法得到示于圖1A的序列。為了得到另外的內(nèi)部序列，把相同量的蛋白質(zhì)用胰蛋白酶消化。經(jīng)過還原和羧甲基化的片斷，采用反相HPLC分離(2.1×10mm流速0.2ml/min)，使用下述的洗脫緩沖液0至50%乙腈于0.07%三氟乙酸中的梯度。洗脫的肽具良好分離峰(在40.8%乙腈中)，將之進(jìn)行序列分析(圖1A)。2.2.核苷酸探針的構(gòu)成使用兩種方法。第一個方法是，建造一個29聚體探針(最小59%同源性)，記住短桿細(xì)菌lactofermentum的色氨酸操縱子密碼子的用法(含6個順反子的7.7Kb序列Matsui等Mol.Gen，Genet.209p.299，1987)，且采用內(nèi)部片斷的IDGALGSYDV序列(顯示較小平均簡并度)?？紤]到GT對的相對熱力學(xué)中性，通過引入幾次簡并合成非編碼鏈、以使所考慮的密碼子平均理論頻率達(dá)極大值(相對于所用挑選的密碼子的88%)。這些條件使得探針中的GC值達(dá)約69%。探針的序列(Sq762)示于圖1B。第二個方法是，用Girges等所述的PCR方法(NucleicAcidRes.16，P.10371，1988)，從相應(yīng)的高簡并度密碼子的多肽得到準(zhǔn)確的核苷酸探針。為達(dá)此目的，合成25聚體寡核苷酸(見圖2A中劃線的序列)，相當(dāng)于N-端基肽序列的第一或最后5個密碼子的所有可能性編碼，并在它們的5′末端，分別攜帶EORⅠ和HindⅢ位點。這些25聚體用于起始短桿細(xì)菌R312DNA染色體的酶放大。30個放大循環(huán)后，用凝膠提純候選的片斷。然后插入噬菌體M13mp19的HindⅢ和EcoRⅠ位點之間。事實上，采用兩個不同的引物雜交溫度(45℃和48℃)，得到兩個候選片斷?？寺∑瑪嗪?，每個溫度下的幾個克隆被序列分析，并加以比較，結(jié)果示于圖2A?？梢姡ビ梢镆氲暮啿⑼?，編碼酰胺酶N-末端的DNA片斷(只在引物之間)被有效的放大。相當(dāng)于該內(nèi)部片斷的合成的40聚體寡核苷酸(Sq918)，因此作為準(zhǔn)確的酰胺酶N-端基探針，用于克隆(Clonage)其余的、特異性探針Sq918的核苷酸序列示于圖2B。用32P通過5′磷?；瘉順?biāo)記由此獲得的Sq762和Sq918兩個探針。2.3.克隆編碼短桿細(xì)菌R312的對映選擇性酰胺酶的基因本方法包括首先證實探針的特異性，并通過Southernbolt法確定將被克隆的DNA染色體片斷的性質(zhì)。簡單地說，通過幾個相應(yīng)于可能的克隆位點，特別是相應(yīng)于PUC質(zhì)粒的多位克隆區(qū)位點的幾種限制性內(nèi)切酶交替消化短桿細(xì)菌R312的染色體DNA。使用PstⅠ較為突出。通過瓊脂糖凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜后，經(jīng)多種消化作用，可使探針Sq762和探針Sq918雜交。示于圖3的結(jié)果證明在雜交條件下(至多每次消化雜化一個片斷)兩個探針有足夠的特異性。而且，由于兩個探針幾乎有相同的雜交概貌，可認(rèn)為試圖獲得的基因雜交信號是相當(dāng)特異的，也可相信，胰蛋白酶消化所得的內(nèi)部肽非常接近N-端基末端。特別是，雜交作用的印跡表示存在單獨的5.4KbPstⅠ片斷，它被兩個探針強烈地雜交。因此決定克隆該片斷。經(jīng)克隆，從PstⅠ消化的全部短桿細(xì)菌R312染色體DNA，產(chǎn)生大約大小在4.6kb和5.5kb之間的片斷，用瓊脂糖提純、電洗脫、并連接到用PstⅠ切斷的pUC19上。大腸桿菌(E.Coli)菌株DH52轉(zhuǎn)化后，在X-gal介質(zhì)上得到500個白集落，它在理論上是相應(yīng)的重組微生物。每一集落被單獨分離，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，然后通過以32P標(biāo)記的Sq918探針雜交來分析。將二個克隆強烈雜交、分離并用于下面步驟。使用各種方法分析從這兩個克隆中分離出的兩個重組質(zhì)粒pXL1650和pXL1651，包括限制性制圖，用探針作序列引物部份序列分析，并可使用Southernblot法。圖4表示兩個質(zhì)粒含有相同5.4kbPstⅠ插入物，有兩個取向。圖5表示這些片斷的限制性圖。這兩個質(zhì)粒確實含有能編碼特定肽的序列，鄰近N-末端的胰蛋白酶片斷(圖8)。而且這些結(jié)果表示編碼短桿細(xì)菌R312的對映選擇酰胺酶的基因位于2.3kb的BamHⅠ-PstⅠ片斷，在此種情況下，定向是BamHⅠ對著PstⅠ。給出了編碼序列5′末端的位置，且已知酶在至多2kb被編碼(據(jù)我們估計是57-63KD單體)，便可肯定整個基因包含在BamHⅠ-PstⅠ片斷上，因此我們對該片斷進(jìn)行序列分析。實施例3含有編碼短桿細(xì)菌R312對映選擇酰胺酶基因的BamHⅠ-PstⅠ片斷序列圖6表示BamHⅠ-PstⅠ片斷的序列分析方法。通過鏈中止法(在7-deaza-dGTP，(35S)-dATP存在下的SequenaseKit)，可獲得各種序列，在帶有亞片斷的單股M13基質(zhì)上獲得，或者直接在質(zhì)粒pXL1650上獲得。為此也合成了幾個特定的引物。獲得的序列平均GC含量是61.5%，圖7表示開放閱讀框架的分析，可以看到相應(yīng)于521個氨基酸(計算過分子量為54671的蛋白質(zhì))的酰胺酶密碼的開放閱讀框架。開放閱讀框架的GC含量分別是第一密碼子位為65.8%，第二密碼子位52.5%，第三密碼子位為70%。上述是富GC微生物編碼序列的典型分布。圖8表示BamHⅠ-PstⅠ片斷的完全序列。實施例4編碼短桿細(xì)菌R312對映選擇性酰胺酶的基因在大腸桿菌(EColi)中的表達(dá)4.1.質(zhì)粒的構(gòu)成建造幾個質(zhì)粒，其中，酰胺酶結(jié)構(gòu)基因(含均一核蛋白體結(jié)合位點(RBS)或來自λCⅡ基因的RBS)置于它自己的啟動子，色氨酸操縱啟動子或λ右溫度敏感啟動子控制下。由將5.4kb片斷(由全部短桿細(xì)菌R312染色體DNA的PstⅠ消化而來)插入質(zhì)粒PUC19的獨特PstⅠ位而獲得質(zhì)粒pXL1650(圖4)。因此該質(zhì)粒攜帶乳糖操縱子Plac的啟動子，再加上核蛋白體結(jié)合位點，編碼短桿細(xì)菌R312對映選擇性酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因，以及編碼抗氨芐青霉素的標(biāo)記。質(zhì)粒pXL1724(圖9)含有從5.4kbPstⅠ片斷切下(在大腸桿菌色氨酸操縱子的啟動子控制下)的2.3kbBamHⅠ-PstⅠ片斷。因此在此結(jié)構(gòu)中，短桿細(xì)菌的酰胺酶基因由含其自身核蛋白體結(jié)合位點的ATG密碼子的58對堿基上段領(lǐng)先(圖8)。制得其它兩種結(jié)構(gòu)，其中，編碼短桿細(xì)菌R312的對映選擇性酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因置于異源啟動子控制下(帶異源核蛋白體結(jié)合位點)。這些質(zhì)粒(pXL1751和pXL1752)通過如下方法獲得為了由NdeⅠ位點(CATATG)取代位于酰胺酶結(jié)構(gòu)基因上段的ATG密碼子，用PCR誘變質(zhì)粒pXL1724。使用相應(yīng)于以起始ATG密碼子雜交的NdeⅠ位的引物，和以位于ATG密碼子下段的XhoⅠ位的相應(yīng)引物進(jìn)行放大處理。然后通過以NdeⅠ和XhoⅠ消化切斷該放大片斷。-啟動子Ptrp的應(yīng)用由EcoRⅠ和XhoⅠ消化的質(zhì)粒pXL1724中插入帶有Ptrp啟動子和λCII基團的核蛋白體結(jié)合位(λCII基因除去了端基序列tR1)，并攜帶有酰胺酶結(jié)構(gòu)基因(片斷NdeⅠ-XhoⅠ)的5′區(qū)的EcoRⅠ-NdeⅠ片斷。這樣產(chǎn)生出質(zhì)粒pXL1751(圖10)-啟動子PRCⅠts的應(yīng)用采用相同的方法，只不過這次采用來自質(zhì)粒pXL1029的EcoRⅠ-NdeⅠ片斷，該片段含λCII基因，PRCⅠts啟動子和核蛋白體結(jié)合位(消除了端基序列tR1)。由此生成質(zhì)粒pXL1752(圖11)。4.2.短桿細(xì)菌R312的酰胺酶基因在E.ColiB和E.ColiK12B1035中的表達(dá)采用氯化鈣法，質(zhì)粒pXL1751和pXL1752分別被用于轉(zhuǎn)化coliB和E.coliK12E103S菌株，在氨芐青霉素介質(zhì)中進(jìn)行重組微生物的選擇。聲處理細(xì)胞后，采用粗分餾SDS-PAGE測量短桿細(xì)菌R312的對映選擇性酰胺酶的表達(dá)，或者離心處理之后，聲處理碎片和上層清液再測量。從圖12的結(jié)果可見酰胺酶高水平表達(dá)，達(dá)全部蛋白質(zhì)的20%。實施例5用短桿細(xì)菌R312對映選擇酰胺酶對映選擇性合成2-芳基-丙酸下述的菌株用于此例大腸桿菌(E.Coli)(pXL1751)-酰胺酶編碼序列放置在色氨酸操縱子的啟動子的控制下。大腸桿菌(E.Coli)(pXL1752)-在指數(shù)生長期末，λPR啟動子在溫度敏感阻遏物CIts控制下，將溫度從30℃提高到40℃，產(chǎn)生酰胺酶。也采用兩個對照菌株大腸桿菌(E.Coli)(pXL906)-等同于帶有由基因IL1β置換了酰胺酶基因的大腸桿菌(E.Coli)(pXL1751)大腸桿菌(E.Coli)(pXL1029)-等同于帶有被IL1β基因置換了酰胺酶基因的大腸桿菌(E.Coli)(pXL1752)。下述的方法用于檢驗這些微生物的活性。將適當(dāng)誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮液，加入含有下述成份的溶液中-羥基-4-苯氧基-2-丙酰胺(HPPAm)或-苯基-2-丙酰胺(PPAm)或例如-酮洛芬的酰胺(KAm)用含有乙腈N鹽酸(90∶10)(V/V)的緩沖液稀釋反應(yīng)混合物、離心除去細(xì)胞。反應(yīng)混合物用HPLC分析，并測定酰胺酶活性，其結(jié)果表示在表2中，證明該系統(tǒng)的效率。表2列出短桿細(xì)菌R312酰胺酶(在誘導(dǎo)條件下，于E.Coli產(chǎn)生的)的特定的對外消旋的底物HPPAm、PPAm和KAm的特異活性，以及產(chǎn)生的手性酸對映異構(gòu)體的過量程度。在本實驗中，含有質(zhì)粒pXL1751(酰胺酶)或pXL906(對照)的大腸桿菌(E.Coli)的菌株，在37℃條件下生長。表2</tables>續(xù)表2HPPAmPPAmKAmHPPAP+HPPAS+Ketos+pXL906pXL1029014nd0nd0ndndndndndnd</table></tables>表3表示短桿細(xì)菌R312(表達(dá)質(zhì)粒pXL1751)酰胺酶(在28℃誘導(dǎo)或抑制條件下于E.Coli產(chǎn)生的)對外消旋底物KAm的特異性活性，以及產(chǎn)生的手性酸的對映異構(gòu)體過量值。表3</tables>nd＝未測定ee對映體過量值(%)注(1)＝TrpL-tryptophane(色氨酸)因此，含有短桿細(xì)菌R312(genotypeAmd+)的酰胺酶基因的大腸桿菌(E.Coli)菌株，可有效地水解下述三種酰胺(phenotypeAMD+)-2-(4-羥基-苯氧)-丙酰胺(HPPAm)-2-苯基-丙酰胺(PPAm)-酮洛芬的酰胺(KAm)所得對映體過量值總是大于93%實施例6提純紅球菌(Rhodococcus)的對映選擇酰胺酶Ⅰ.測定酶的活性把活性成份在500μl的緩沖液(0.1MTrisHClpH7.5，5mMDTT，18mM2-苯基-丙酰胺)保溫后，在反應(yīng)混合物中加入2ml乙腈/HCl1N(90/10)混合物和2ml50mMH3PO4/CH3CN(75/25)的混合物。于5000rpm下離心處理約10分鐘后，等分的上層清液用高效液相色譜測定反應(yīng)產(chǎn)物。柱Nucleosil5-C1825cm洗脫液50mMH3PO4/CH3CN(75/25)載荷10μl。流速1ml/min一個單位活力定義為每小時水解1μmol2-苯基-丙酰胺需要的酶量Ⅱ.純化方案6.1.酶提取物的制備將7g細(xì)胞懸浮于15ml0.1MTris-HClpH7.55μMDTT的溶液中，在4℃下聲處理約15分鐘，在50000rpm下離心約1小時，收集粗酶提取物。6.2.第一級離子交換色譜在20ml的粗提取物中，加入20ml緩沖液A(25mMTrisHClpH7.5，5mMDTT)。樣品被注入到MonoQHR10/10柱(藥用)中，用緩沖液A平衡，流速為3ml/min。洗完柱后，蛋白質(zhì)以0.1至1MKCl的線性1小時梯度，在流速3ml/min下洗脫出，餾份體積是6ml，以18ml大約0.3MKCl將酰胺酶洗脫。6.3.第二級離子交換色譜合并活性餾份，并用Centriprep超濾系統(tǒng)(Amicon)濃縮至2ml，用6ml緩沖液稀釋后，以1ml/min的速度，把4ml樣品注射到用緩沖液A平衡的MonoQHR5/5柱中，以緩沖液A中0至0.5MKCl的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。合并活性餾份，調(diào)節(jié)至15%丙三醇溶液(V/V)，按上述方法濃縮至1ml。6.4.疏水色譜在樣品中加入1ml緩沖液B(0.1MTrisHClpH7.5，0.5mMDTT，1.7M(NH4)2SO4)，然后在流速為0.25ml/min下，把樣品注射入(分二針)苯基-瓊脂糖HR5/5柱中(藥用)。蛋白質(zhì)在0.5ml/min，用25ml(NH4)2SO4(1.7M至0M)遞減線性梯度洗脫。餾份的體積是0.5ml。將活性餾份調(diào)節(jié)至15%丙三醇，然后用緩沖液A稀釋至1ml。6.5.羥磷灰石色譜把樣品以0.5ml/min的速度，注射入Bio-GelHPHT，用緩沖液C(85mMTrisHClpH7.5，0.5mMDTT，10μMCaCl2、15%的丙三醇)平衡的柱(Bio-Rad)中。在流速0.5ml/min下，用緩沖的(0.35M磷酸鉀，pH7.5，0.5mMDTT，10μMCaCl2、15%丙三醇)0至100%線性梯度洗脫酰胺酶，洗脫在20分鐘內(nèi)進(jìn)行。通過上述步驟酶純化達(dá)到均一程度，其蛋白質(zhì)的比活度為988U/mg。所得的酶以相同亞單元的二聚體形式存在，其表觀分子量為53+/-2KD。實施例7克隆編碼該酰胺酶的基因經(jīng)過在TSK-G3000SW上進(jìn)行的附加提純步驟后，對該酶進(jìn)行序列分析。用埃德曼型化學(xué)變化難于得到N-末端，因此，進(jìn)行完全胰旦白酶消化，水解產(chǎn)物的HPLC三餾份-123，124和162提供了能得到確定序列的多肽，從得到的123分餾物的序列，合成32-聚體核苷酸探針，它相應(yīng)于8個寡聚核苷酸的混合物，且在至少簡并三次的位點處含有7個次黃苷。探針A(來自肽123)ATVDVPVPDYA5′3′GCIACIGTIGATGTCCIGTICCIGATTATGCCCC利用Southern方法，通過轉(zhuǎn)移到來自紅球菌(Rhodococcus)的基因組DNA上，而測定5′末端用32P標(biāo)紀(jì)的探針的效能，該基因組DNA先用下面任一種限制性內(nèi)切酶消化SstⅠ，SphⅠ，SmaⅠ，PstⅠ，KpnⅠ，EcoRⅠ，SalⅠ和BamHⅠ。實驗條件如下雜交緩沖液5×SSC，5×Denhardt，0.1%SDS，50mMNaPO4，pH6.5，250μg/ml鮭精子DNA;雜交的溫度是50℃或55℃(兩個實驗);洗滌條件是在室溫下用6×SSC洗滌1小時，以及在50℃用2×SSC，0.1%SDS洗滌5分鐘。在上述條件下，探針A顯示出強的，確定的信號;尤其是，用BamHⅠ，KpnⅠ，SphⅠ，SstⅠ，SmaⅠ，SalⅠ和PstⅠ消化時，得到一條單一的基因組譜帶，它能與探針A強烈地雜交。通過PstⅠ的消化，與探針A雜交的信號大小相當(dāng)于約3.2kb的染色體片段。染色體DNA的3至4kbPstⅠ消化片段的純化是經(jīng)過瓊脂糖制備電泳后，電洗脫，然后連接到質(zhì)粒pUC19，該質(zhì)粒已用PstⅠ切割。轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli)菌株DH5α后，在LBAmp-X-gal上顯示白色的600個克隆各自再挑取出，并在與Southern影印法相同的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，采用菌落雜交的方法，用探針A檢測。9個克隆顯示有強烈的雜交信號，然后通過限制性分析質(zhì)粒DNA，分析這9個克隆，結(jié)果清楚地顯示，在這些克隆中的6個，以兩種定向插入了相同的3.2kb的片段，對其中顯示每一種定向的兩個克隆(pXL1835和pXL1836)進(jìn)行更詳細(xì)分析(詳細(xì)制圖，Southern分析)，從而確定獲得了預(yù)期的片斷。實施例83.2kb的PstⅠ片段的序列已測定3.2kbPstⅠ片段的兩條鏈的全部核苷酸序列。該片段的GC含量是62.4%。與R312的GC含量(約62%)相近，序列分析表明，存在一個為含有462氨基酸的多肽(計算得分子量為48554)編碼的1386個核苷酸(位點210至1595)的開放式閱讀框架，該多肽也含有先前通過序列分析胰蛋白酶片段獲得的三肽。該開放式閱讀框架包含于BamHⅠ亞克隆的片段中，該片段的核苷酸序列示于圖13。3個劃線的肽序列對應(yīng)于根據(jù)純化酶的胰旦白酶片段直接測得的肽片段(肽123，124和162)，劃線的核苷酸序列相應(yīng)于用于克隆基因的(已簡并)探針，斜體字表示的肽序列相應(yīng)于殘基137至193，它們于短桿菌(Brevibacterium)菌株R312和紅球菌(Rhodococcus)菌株的對映選擇性酰胺酶之間高度守恒(見下文)。該開放式閱讀框架表示對映選擇酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因。實施例9不同酰胺酶之間的同源性鑒定具酰胺酶活性特征的序列比較R312的對映選擇酰胺酶(圖8)和示于圖13的酰胺酶的肽序列，結(jié)果表明，序列的三分之二處即位于R312的殘基150-300之間的序列有高度同源性(50%完全相同)。在殘基159到215之間同源性達(dá)67%)。通過導(dǎo)找GENPRO基因庫的同源性序列，發(fā)現(xiàn)在150至200區(qū)域，和構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)的乙酰胺酶，PseudomonasSyringae和Bradyrhizobiumjaponicum的吲哚乙酰胺水解酶(IAH)，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的tms2蛋白質(zhì)，和黃胞菌屬(Flavobacterium)菌株K172和假單孢菌屬(Pseudomonas)菌株NK87的6-氨基己酸-環(huán)-二聚水解酶(ACDH)的序列都有強烈的同源性。表4表示上面描述的酰胺酶的肽137-193殘基之間與其它酶相應(yīng)位點之間的同源性(用氨基酸的嚴(yán)格等同百分?jǐn)?shù)表示)表4該高度守恒區(qū)域很可能負(fù)責(zé)提供這些酶的活性(催化位點)。實施例10對映選擇性酰胺酶在大腸桿菌(E.Coli)中的表達(dá)為了確切鑒定編碼對映選擇性酰胺酶的狀態(tài)，通過PCR方法，在210位的假定的ATG密碼子處制造出NdeⅠ位點(CATATG)(圖13)，將在該位點和在1683位的SalⅠ位點之間的片段(該片段含有唯一的編碼酰胺酶的區(qū)域)置于大腸桿菌(E.Coli)的轉(zhuǎn)錄起始(啟動子Ptrp或PR)和轉(zhuǎn)譯(核旦白體結(jié)合位點CⅡ)的功能信號的控制下。由此獲得的載體(pXL1893，Ptrp;和pXL1894和PR-CIts)與表達(dá)R312酰胺酶的載體pXL1752和pXL1751相似，如上所述。分別在大腸桿菌(E.Coli)B和大腸桿菌(E.Coli)K12E103S中研究了質(zhì)粒pXL1893和pXL1894的表達(dá)。在42℃，質(zhì)粒pXL1894存在時，特異性地產(chǎn)生一種與純化的酰胺酶共遷移的旦白質(zhì)。實施例11對映選擇性酶胺酶在棒狀桿菌中的表達(dá)1.構(gòu)建表達(dá)載體這些載體來自于棒狀桿菌的復(fù)制性載體。他們包括-一個大腸桿菌(E.Coli)的復(fù)制子-一個棒狀桿菌(corynebacteria)的復(fù)制子-一個選擇性標(biāo)記-一個Amd序列載體pSV73(圖14)該質(zhì)粒是通過在C.glutamicum(Yoshihamaet.al.，J.Bacteriol.162，591，1985)的pSR1質(zhì)粒中插入含有大腸桿菌(E.Coli)復(fù)制子的質(zhì)粒pUC8和攜帶于轉(zhuǎn)座子Tn903的卡那霉素抗性基因而獲得。這些質(zhì)粒用于構(gòu)建示于圖13的Amd序列的不同表達(dá)載體，較好的-載體pYG811A和B(圖15)。通過將圖13描繪的SalⅠ片段中含有的Amd序列，以兩種取向克隆到pSV73的SalⅠ位點而獲得這些表達(dá)載體。-載體pYG817A和B(圖16)。這些表達(dá)載體是通過將圖13描繪的BamHⅠ片段中含有的Amd序列，以兩種取向克隆到pSV73的BglⅡ位點而獲得。-載體pYG882(圖17)。該表達(dá)載體來自于pSV73，通過在SalⅠ和BglⅡ位點之間插入一個表達(dá)盒而獲得，該表達(dá)盒含有顯示于圖13的Amd序列，該Amd序列在E.Coli的色氨酸操縱子的Ptrp啟動子控制下。-其他同形的棒狀桿菌質(zhì)粒可用于構(gòu)建在棒狀桿菌中具功能的表達(dá)Amd序列的載體。例如，從B.lactofermentum(Yehet.al.，Gene，47，301-306，1986)中分離的質(zhì)粒pX18，可用于構(gòu)建穿梭載體pYG820A和pYG820B，它們可以在短桿菌屬(Brevibacterium)R312中復(fù)制，因而可在幾種棒狀細(xì)菌的克隆和表達(dá)實驗中作為受體。2.轉(zhuǎn)化棒狀桿菌可采用所有已知的轉(zhuǎn)化技術(shù)，較好的是如前記載的Yoshimaet.al.所述的質(zhì)生質(zhì)體-再生技術(shù)。但是本申請的申請人已證明，電擊穿技術(shù)是非常有效的，可將轉(zhuǎn)化頻率擴大至1000倍。經(jīng)超聲波處理的細(xì)胞的SDS-PAGE分析技術(shù)，可用于研究重組宿主內(nèi)酶的胞內(nèi)表達(dá)。實施例12酶的催化作用本實施例例證了Amd-型蛋白質(zhì)，或表達(dá)這些旦白質(zhì)的重組微生物，在通過水解相應(yīng)的外消旋的酰胺，對映選擇性地合成有旋光活性的有機酸中的應(yīng)用。1.細(xì)胞的制備在28℃，以每分鐘150轉(zhuǎn)的速度攪拌的合適培養(yǎng)條件下，將不同的菌株培養(yǎng)于含有600ml培養(yǎng)基的錐形瓶中，終止培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，用NaCl(9g/l)溶液洗滌，并貯藏在-18℃。2.以2-苯基-丙酰胺作為底物方法如下2-苯基-丙酰胺和細(xì)胞懸浮液被加到帶有攪拌器的燒瓶中，用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)將體積調(diào)至5ml。將燒瓶放在恒溫的結(jié)晶盤上，在25℃攪拌約1小時，然后用乙腈/HCl(9/1)(V/V)溶液稀釋反應(yīng)混和物。通過離心除去細(xì)菌和細(xì)胞碎片，用HPLC測定酸和酰胺的組合。從短桿菌(Brevibacterium)R312和Brevibacteriumlactofermentum(ATCC21086)獲得的結(jié)果如下表5</tables>3.外消旋苯酮苯丙酸(酮洛芬)酰胺作為底物如表6所示，用重組體棒狀桿菌表達(dá)來自紅球菌(Rhodococeus)的酰胺酶的活性明顯高于用pSV73轉(zhuǎn)化的對照細(xì)胞表達(dá)的酶活性。表6</tables>nd＝未測定ee對映異構(gòu)體的過量值注釋(1)＝IBN異丁腈;IBNAm異丁酰胺權(quán)利要求1.編碼具對映選擇酰胺酶活性的多肽的DNA序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA序列，其特征在于它們選自-示于圖8的編碼短桿細(xì)菌(Brevibacterium)R312對映選擇酰胺酶的序列和示于圖13的編碼紅球菌(Rhodo-coccus)的對映選擇酰胺酶的序列，-編碼相同蛋白質(zhì)的一些類似序列，但其來源于基因密碼的簡并，-用一個該序列或其片斷雜交并編碼具有對映選擇酰胺酶活性多肽的DNA。3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA序列，其特征在于它至少包括示于圖13的編碼氨基酸137至193的序列，或示于圖8的編碼氨基酸159至215的氨基酸，或與這些序列有至少50%同源性的肽序列。4.至少含有示于圖8的序列編碼位區(qū)的DNA。5.至少含有示于圖13的序列編碼位區(qū)的DNA。6.含有根據(jù)權(quán)利要求1～5任何一項的DNA序列的基因。7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任何一項中的DNA序列的表達(dá)所得的新的多肽，該多肽具有對映選擇酰胺酶的活性。8.根據(jù)權(quán)利要求7的多肽，其特征在于示于圖8和圖13的序列。9.具有對映選擇酰胺酶活性的多肽，且具有至少選自下述的序列。-圖13中相應(yīng)的氨基酸137至193序列，-圖8中相應(yīng)的氨基酸159至215序列，-與前述序列至少具有50%同源性的序列。10.根據(jù)權(quán)利要求7～9的任何一項的多肽，其特征在于它們不是自然起源的。11.轉(zhuǎn)化微生物它含有至少載有根據(jù)權(quán)利要求1～6任何一項序列的表達(dá)盒，在DNA序列的控制下，保證這些序列在宿主生物中的表達(dá)。12.根據(jù)權(quán)利要求11的微生物，其特征在于保證根據(jù)權(quán)利要求1～6中之一項的序列表達(dá)的DNA序列含轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始區(qū)。13.根據(jù)權(quán)利要求11的微生物，其特征在于轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始位區(qū)含有啟動子序列和核蛋白體結(jié)合位點。14.根據(jù)權(quán)利要求13的微生物，其中啟動子序列和核蛋白體結(jié)合位點，根據(jù)產(chǎn)生的肽可以是同源的或異源的。15.根據(jù)權(quán)利要求14的微生物，其特征在于啟動子序列可以選自下述的棒狀細(xì)菌噬菌體的強啟動子，色氨酸操縱子的啟動子Ptrp紫膠操縱子的啟動子Plac，λ噬菌體的左啟動子PL1或λ噬菌體的右啟動子PR。16.根據(jù)權(quán)利要求15的微生物，其中，啟動子選自色氨酸操縱子的啟動子Ptrp和λ噬菌體的右啟動子PRCIts。17.根據(jù)權(quán)利要求11的微生物，其中，核蛋白體結(jié)合位點，源自λ噬菌體的CⅡ基因，或棒狀細(xì)菌的同源基因。18.根據(jù)權(quán)利要求11至17之一項的微生物，其特征在于表達(dá)盒攜帶于帶有選擇性手段的質(zhì)粒上。19.根據(jù)權(quán)利要求11的微生物，其中選擇手段是具有對抗生素有抗性的精心挑選的標(biāo)記。20.根據(jù)權(quán)利要求11的微生物，其特征在于質(zhì)粒含有色氨酸操縱子的啟動子Ptrp，刪除了轉(zhuǎn)錄末端序列tR1的λ噬菌體基因CⅡ的核蛋白體結(jié)合位點，編碼短桿細(xì)菌(Brevibacterium)R312的對映選擇酰胺酶基因的DNA和具有氨芐青霉素抗性的基因。21.根據(jù)權(quán)利要求11的微生物，其特征在于質(zhì)粒含有溫度敏感的λ噬菌體PRCIts右啟動子，刪除了轉(zhuǎn)錄末端序列tR1的λ噬菌體CⅡ基因的核蛋白體結(jié)合的位點，編碼短桿細(xì)菌(Brevibacterium)R312的對映選擇酰胺酶基因的DNA和具有氨芐青霉素抗性的基因。22.根據(jù)權(quán)利要求11至21之一項的微生物，其特征在于它選自下述的大腸桿菌(E.coli)，短桿細(xì)菌(Brevibacterium)，棒狀桿菌(Corynehacterium)，紅球菌(Rhodococcus)菌株。23.根據(jù)權(quán)利要求22的微生物，其特征在于它是大腸桿菌(E.coli)B或大腸桿菌(E.coli)K12E103s。24.對映選擇酰胺酶的制備方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求11至23任何一項的微生物，使之在能表達(dá)編碼酰胺酶序列的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)后分離微生物并提取酰胺酶。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其特征在于聲處理培養(yǎng)物，用硫酸銨分餾。在苯基-瓊脂糖凝膠色譜上分析并進(jìn)行雙凝膠過濾。26.從相應(yīng)的外消旋酰胺制備有機酸的立體異構(gòu)體的方法，其特征在于外消旋酰胺放置于上述權(quán)利要求11至23任何一項敘述的微生物存在下，或上述權(quán)利要求7-10任何一項所述的多肽的存在下，反應(yīng)完成后回收立體異構(gòu)體。27.根據(jù)權(quán)利要求26的制備方法，其特征在于酰胺是外消旋的2-芳基-丙酰胺，而酸是(S)酸。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法。其特征在于外消旋的2-芳基-丙酰胺是酮洛芬的酰胺而酸是(s+)酮洛芬。29.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征是酰胺是外消旋的2-芳氧基-丙酰胺，而酸是相應(yīng)的R立體異構(gòu)體。全文摘要本發(fā)明涉及編碼具有對映選擇性酰胺酶活性的多肽的DNA序列。文檔編號C12P41/00GK1052508SQ9011004公開日1991年6月26日申請日期1990年11月15日優(yōu)先權(quán)日1989年12月11日發(fā)明者多米尼科·彼得,伊迪絲·塞伯勞德,瓊-弗蘭克斯·梅尤科斯,帕特里克·耶申請人:羅納-布朗克衛(wèi)生品公司