專利名稱：人體C3b/C4b受體(CR1)的制作方法
1.簡介本發(fā)明涉及C3b/C4b受體(CR1)基因及其編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及CR1的核酸順序及其含有70個核苷酸的片段和它們編碼的含有24個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了CR1蛋白質(zhì)及其片段的表達(dá)。CR1核酸和蛋白質(zhì)已被用于診斷或治療涉及補(bǔ)體活性的疾病和各種炎癥以及免疫性疾病。
2.發(fā)明背景2.1補(bǔ)體系統(tǒng)補(bǔ)體系統(tǒng)是一組蛋白質(zhì)，它們構(gòu)成了人體正常血清中球蛋白的10%(Hood，L.E.等人，1984，《Immunology》，第2版，TheBenjamin/Cummings出版公司，Menlo Park，加州，第339頁)。補(bǔ)體(C)在介導(dǎo)免疫和過敏反應(yīng)中起著重要的作用(Rapp，H.J.和Borsos，T.1970，Molecular Basis of Complement Action，Appleton-Century-Crofts(Meredith)，NewYork)。補(bǔ)體組分的激活導(dǎo)致了包括介導(dǎo)與補(bǔ)體依賴性疾病有關(guān)的炎癥的趨化肽在內(nèi)的一組因子產(chǎn)生。補(bǔ)體級聯(lián)放大的連續(xù)活化可通過包含抗原-抗體復(fù)合體的經(jīng)典型途徑產(chǎn)生，或可通過包括識別某種細(xì)胞壁多糖的旁路途徑產(chǎn)生。通過的活的補(bǔ)體蛋白質(zhì)而介導(dǎo)的活性包括靶細(xì)胞的裂解，趨化性，調(diào)理作用，血管和其它平滑肌細(xì)胞的刺激，和諸如乳房細(xì)胞失粒的功能性紊亂，增加的小血管滲透性，白細(xì)胞的定向遷移和B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化(Eisen，H.N，1974，Immunology，Harper ＆ Row出版公司，Hagerstown，Maryland，第512頁)。
在蛋白質(zhì)水解級聯(lián)放大步驟中，生物活性肽片段，過敏毒素C3a，C4a和C5a(可參考WHO Scientific Group，1977，WHOTech.Rep.Ser 6065，此處列為參考)從第3(C3)，第4(C4)和第5(C5)天然補(bǔ)體組分(Hugli，T.E.1981，CRC Crit.Rev.Immunol.1321;Bult，H和Herman，A.G，1983，Agents Actions 13405)中釋放出來。
2.2 C3b/C4b補(bǔ)體受體(CR1)人體C3b/C4b受體(稱為CR1)存在于紅細(xì)胞，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞，B細(xì)胞，部分T細(xì)胞，脾卵泡樹突狀細(xì)胞和腎小球足狀突細(xì)胞中(Fearon，D.T.1980，J.Exp.Med.15220;Wilson，J.G.等人，1983，J.Immunol.131684;Reynes.M.等人，1985，J.Im-munol.1352687;Gelfand，M.C.等人，1976，N，Engl.J.Med.29510;Kazatchkine，M.D.等人，1982，Clin.Immunol.Im-munopathol.27170)。CR1特異性地與C3b，C4b和iC3b結(jié)合。在血漿中已發(fā)現(xiàn)了一種具有配體結(jié)合活性且與膜相關(guān)CR1具有相同分子量的可溶形式的受體(Yoon，SH.和Fearon，D.T.1985，J.Im-munol，1343332)。CR1與已與免疫復(fù)合體和其它補(bǔ)體激活因子共價連接的C3b和C4b結(jié)合，它們相互作用的結(jié)果取決于載有該受體的細(xì)胞類型(Fearon，D.T.和Wong.W.W.1983，Ann，Rev，Im-munol 1243)，紅細(xì)胞CR1與免疫復(fù)合體結(jié)合以轉(zhuǎn)移至肝中(Corna-coff J.B.等人，1983，J.Clin，Invest 71236;Medof M.E.等人，1982，J.Exp，Med，1561739)。而嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的CR1則通過外膜紋孔的吸附性胞吞作用(Fearon D.T.等人，1981，J.Exp.Med.1531615;Abrahamson D.R.和Fearon D.T.1983，Lab，Invest.48162)或通過用佛波醇酯，趨化肽或存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，如纖維結(jié)合素(fibronectin)和海帶氨酸(Laminin)激活受體后的吞噬作用(Newman.S.L.等人，1980，J，Immunol，125，2236;Wright S.D和Silverstein S.C 1982，J.Exp.Med.156149;Wright S.D.等人，1983，J.Exp Med.1581338)使連接的復(fù)合物內(nèi)在化。CR1的磷酸化可能對獲得吞噬活性起作用(Changelian，P.S.和Fearon.D.T.1986，J.Exp.Med.163101)。盡管用抗CR1抗體處理這些細(xì)胞增強(qiáng)了它們對于亞最適劑量的美州商陸植物的有絲分裂素應(yīng)答，CR1對于B淋巴細(xì)胞的作用則未完全確知(Daha，M.R.等人，1983，Immunobiol.164227(Abstr.))。卵泡樹突狀細(xì)胞上的CR1有促進(jìn)抗原遞呈的作用(Klaus，G.G.B.等人，1980，Im-munol，Rev，533)。
CR1還可以抑制C3/C5轉(zhuǎn)化酶的經(jīng)典和旁路的途徑，以及可作為用因子Ⅰ裂解C3b和C4b的輔助因子，這表明除了作為受體外，CR1還具有補(bǔ)體調(diào)節(jié)作用(Fearon，D.T.1979.Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.765867;Iida，K.和Nussenzweig，V，1981，J.Exp，Med.1531138)。在補(bǔ)體激活的旁路途徑中，雙分子復(fù)合體C3b，Bb是C3激活酶(轉(zhuǎn)化酶)。CR1(和H因子，在較高濃度下)可以結(jié)合到C3b上并可促進(jìn)C3b，Bb的解離。此外，C3b，CR1(和C3b，H)的形成使得C3b對于由因子Ⅰ引起的不可逆的蛋白水解失活作用敏感，而導(dǎo)致了形成失活的C3b(iC3b)。在補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑中，復(fù)合體C4b，2a是C3轉(zhuǎn)化酶。CR1(和C4結(jié)合蛋白質(zhì)，C4bp，在較高濃度下)可以結(jié)合到C4b上，也可促使C4b，2a的解離。這種結(jié)合使得C4b對于由因子Ⅰ引起的不可逆蛋白水解失活作用敏感而分裂為C4c和C4d(失活的補(bǔ)體蛋白質(zhì))。
CR1是一種由單個多肽鏈組成的糖蛋白。業(yè)已發(fā)現(xiàn)了四種異型CR1，其分子量為增加約40，000-50，000道爾頓而各異。兩種最常見的形式，F(xiàn)和S異型體，又稱之為A和B異型體，它們的分子量分別為250，000和290，000道爾頓(Dykman，T.R.等人，1983，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.801698;Wong，W.W等人，1983，J，Clin.Invest，72685)，兩種較少見形式的分子量則為210，000和＞290，000道爾頓(Dykman，T.R.等人，1984，J.Exp.Med.159691;Dykman.T.R.等人，1985，J.Immunol.1341987)。這些差異很清楚地表明了變異發(fā)生于CR1的多肽鏈，而不是糖基化狀態(tài)時，因為通過用胞內(nèi)糖苷酶F處理純化的受體蛋白質(zhì)不能消除這些差異(Wong.W.W.等人，1983，J.Clin，Invest，72685)，在衣霉素存在下，當(dāng)受體的異型體被生物合成時，可觀察到這種差異(Lublin，D.M.等人，1986.J/Biol.Chem.2615736)。四種CR1異型體均具有C3b結(jié)合活性(Dykman T.R.等人，1983，Proc，Natl，Acad.Sci，USA，801698;Wong W.W.等人，1983.J.Clin.Invest.72625;Dykman T.R等人，1984，J.Exp.Med.159691;Dykman T.R等人，1985，J.Immunol，1341787)。
在很嚴(yán)格的條件下，CR1 cDNA的兩種不重迭的限制性片段顯示出交雜交(Wong W.W.等人，1985.Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.827711)。兩種cDNA探針也與基因組DNA的多個限制性片段雜交，其中大部分片段與兩種探針是共同的(id)。CR1中存在重復(fù)編碼順序可通過順序比較而證實(Klickstein，L.B等人，1985，Comple-ment 244(Abstr))。此外，通過將設(shè)有編碼順序的基因組探針與幾個基因組限制性片段交叉雜交證實CR1基因具有重復(fù)的插入順序(Wong W.W.等人，1986.J.Exp.Med.1641531)。此外，與來自具有F異型體的個體的DNA相比較，來自具有較大的S異型體的個體的DNA有一個與這個基因組探針雜交的附加的限制性片段，表明基因組順序的重復(fù)與較高分子量的CR1等位基因(id)有關(guān)。
業(yè)已表明，CR1與補(bǔ)體受體2型(CR2)具有同源性(Weis J.J.等人，1986，Proc，Natl，Acad，Sci，U.S.A.835639-5643)。
2.3人體疾病中CR1的異常來自幾個地區(qū)的研究者報道了患有全身性紅斑狼瘡(SLE)的病人的紅細(xì)胞中CR1的表達(dá)的減少，包括日本(Miyakawa等人，1981，Lancet2493-497;Minota等人，1984.Arthr，Rheum.271329-1335)，美國(Iida等人，1982，T.Exp.Med.1551427-1438i Wil-son等人，1982，N，Engl.J.Med，307981-926)和歐洲(Walport等人，初.Clin.Exp，Immunol，59547;Jouvin等人，1986，Complement 388-96;Holme等人，1986，Clin，Exp，Immunol.6341-48)。將病人作為一組來看，其體內(nèi)每個細(xì)胞中受體的平均數(shù)是正常人的50-60%。一份早期報道中指出紅細(xì)胞中CR1的數(shù)目與疾病的活性呈反比的變化，在SLE最嚴(yán)重的表現(xiàn)期，CR1的數(shù)目最少，而在同一病人中，處于緩解期時，則觀察到較多的CR1(Iida等人，1982，J.Exp，Med，1551427-1438)。研究還發(fā)現(xiàn)，CR1的數(shù)目與免疫復(fù)合體的血清水平，C3d的血清水平和結(jié)合紅細(xì)胞的C3dg的量呈負(fù)相關(guān)，這可能反映了補(bǔ)體激活免疫復(fù)合體的攝入和作為“單純的旁觀者”在紅細(xì)胞上的沉積(Ross等人，1985，J，Immunol，1352005-2014;Holme等人，1986，Clin，ExpImmunol.6341-48;Walport等人，1985，Clin，Exp，Immunol.59547)。我們發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞上缺乏CR1的SLE的病人對于CR1具有自身抗體(Wilson等人，1985，J.Clin，In-vest，76182-190)?？笴R1的抗體效價的減少與病人的臨床情況的改善和受體異常的部分逆轉(zhuǎn)相應(yīng)。抗CR1抗體在其它兩個SLE病人身上也已檢測到了(Cook等人，1986，Clin，Immunol，Immunopathol，38135-138)。最近，通過觀察到輸入的紅細(xì)胞中受體迅速喪失而證實了在活動期SLE和溶血性貧血病人中，紅細(xì)胞CR1的后天性喪失(Walport等人，1987，Clin Exp.Immuniol，69501-507)。
感染人體免疫缺乏病毒(HIV)病人(Tausk，F(xiàn).A.等人，1986.T.Clin，Invest，78977-982)和麻風(fēng)病(lepromatus leprosy)(Tausk，F(xiàn).A.等人，1985 J.Invest Dermat 8558s-61s)的病人中已觀察到了相應(yīng)的CR1從紅細(xì)胞上喪失。
在SLE中補(bǔ)體受體表達(dá)的異常不局限于紅細(xì)胞CR1，SLE病人的嗜中性粒細(xì)胞的全部細(xì)胞CR1和B淋巴細(xì)胞的胞質(zhì)膜CR1也已顯示出發(fā)生相應(yīng)缺少(Wilson等人，1986，Arthr，Rheum，29739-747)。
在患有Ⅳ型SLE腎炎的病人中，所有可測得的CR1抗原從足狀突細(xì)胞中消失，而在較不嚴(yán)重的SLE腎炎和非SLE型增生性腎炎，包括膜增生性腎小球性腎炎Ⅰ和Ⅱ型病人中，腎小球足狀突細(xì)胞中CR1的表達(dá)與正常的并無不同(Kazatchkine等人，1982，J，Clin，Invest 69900-912;Emancipator等人，1983，Clin Immunol.Immunopathol 27170-175)。但是，患有Ⅳ型SLE腎炎的病人的紅細(xì)胞CR1的數(shù)目并不比患有其它類型的腎狼瘡或無腎炎的SLE病人少。(Jouvin等人，1986，Complement 388-96)。在體內(nèi)補(bǔ)體活化可促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)膜上CR1的表達(dá)(Lee.J.等人，1984，Clin Exp.Immunol.56205-214;MooreF.D.Jr等人，1986，N.Engl，J.Med，314948-953)。
補(bǔ)體活化也與涉及炎癥的疾病狀態(tài)有關(guān)。節(jié)段性回腸炎的腸炎癥的特征是單核和多形核白細(xì)胞的淋巴組織樣的浸潤。最近發(fā)現(xiàn)在節(jié)段性回腸炎病人的空腸液中補(bǔ)體C4的濃度與正常對照相化增加了(Ahrenstedt et al.，1990，New Engl.J.Med.3221345-9)。其它影響炎癥中的補(bǔ)體系統(tǒng)的疾病狀態(tài)包括熱損傷/灼傷(Gelfand et al.，1982，J.Clin.Invest.701170;Demling et al.，1989，Surgery 10652-9)，血液滲析(Deppisch et al.，1990，Kidney Inst，37696-706;Kojima et al.，1989，Nippon Jenzo Gakkai Shi 3191-7)，及在體外循環(huán)中的泵后綜合癥(Chenoweth et al.，1981，Complement In-flamm，3152-165;Chenoweth et al.，1986，Complement 3152-165;Salama et al.，1988，N.Engl.J.Med，318408-14)。補(bǔ)體和白細(xì)胞據(jù)報道均影響成人呼吸窘迫綜合癥的發(fā)病機(jī)制(Zilow et al.，1990，Clin.Exp.Immunol.79151-57;Langlois et al.，1989，HeartLung 1871-84)。補(bǔ)體系統(tǒng)的活化據(jù)提示涉及膿毒癥中致命并發(fā)癥的發(fā)展，并引起自身免疫疾病的動物模型中的組織損傷，如免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的脈管炎(Cochrane，1984，Springer Seminar Im-munopathol.7263)，腎小球性腎炎(Couser et al.，1985，Kidney Inst.29879)，溶血性貧血(Schreiber ＆ Frank，1972，J.Uin，Invest 51575)，重癥肌無力(Lennon et al.，1978，J.Exp.Med.147973;Biesecker ＆ Gomez，1989，J.Immunol.1422654)，第Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Watson ＆ Townes，1985，J.Exp.Med.1621878)，及實驗性變態(tài)性神經(jīng)炎(Feasby et al.，1987.Brain Res.41997)。在超急性同種移植和超急性異種移值排斥中也涉及補(bǔ)體系統(tǒng)(Knechtle et al.，1985，J.Heart Transplant 4(5)541;Guttman，1974，Transplatation 17383;Adachi et al.，1987，Trans，Proc.19(1)1145)。用重組IL-2進(jìn)行免疾治療時補(bǔ)體的活化從IL-2治療中觀察到將引起嚴(yán)重毒作用和副作用(Thijs et al.，1990，J.Immunol.1442419)。
補(bǔ)體在涉及免疫復(fù)合物的疾病中可能也起作用。免疫復(fù)合物在許多病理狀態(tài)下可被發(fā)現(xiàn)，這些狀態(tài)包括但不局限于自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或SLE，血液的惡性疾病如愛滋病(Tayler et al.，1983，Arthritis Rheum.26736-44;Inada et al.，1986，AIDS Re-search 2235-247)，以及涉及自身抗體和/或補(bǔ)體活化的疾病(Ross et al.，J.Immunol.1352005-14)。Inada等人報道紅細(xì)胞CR1在去除自身免疫性病人中循環(huán)免疫復(fù)合物上起作用，從而可能抑制體內(nèi)組織內(nèi)免疫復(fù)合物的素質(zhì)(disposition)(Inada et al.，1989，Ann，Rheum.Dis 4287)。在ARC和愛滋病人中，CR1活性的減少已與臨床上疾病狀態(tài)相關(guān)(Inada et al.，1986，AIDS Res.2235)。
3.本發(fā)明的概要本發(fā)明涉及C3b/C4b受體(CR1)基因和它編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及CR1核酸順序和含有70個核苷酸的片段和它們編碼的含有24個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明提供了CR1蛋白質(zhì)及其片段的表達(dá)。本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)可用于診斷和治療涉及補(bǔ)體活性的疾病和各種免疫系統(tǒng)或炎癥疾病。
在下面的實例章節(jié)所詳細(xì)描述的本發(fā)明的特定實施例中，將描述一個全長CR1cDNA及其片段的克隆、核苷酸順序和推斷的氨基酸順序。還將描述CR1蛋白質(zhì)及其片段的表達(dá)，并可得到CR1蛋白質(zhì)及其含有C3b和/或C4b結(jié)合位點并顯示因子Ⅰ輔助因子活性的片段的表達(dá)。
下面的實例還描述了可溶性的CR1分子的制備和純化，這些分子對于治療炎癥反應(yīng)和減小心肌梗塞范圍以及預(yù)防腫塊損傷的是有用的。
3.1定義Ad2MLP＝腺病毒2主要的后期啟動子C＝補(bǔ)體C3(ma)＝甲胺處理過的C3C4bp＝C2結(jié)合蛋白質(zhì)CMV＝細(xì)胞肥大病毒CR1＝補(bǔ)體受體，1型，C3b/C4b受體CR2＝補(bǔ)體受體，2型DCFDA＝二氯熒光黃二乙酸酯(dichlorofluorescin diacetate)HPLC＝高壓液相色譜iC3b＝失活C3bLHR＝長同源重復(fù)mAb＝單克隆抗體PAGE＝聚丙烯酰胺凝膠電泳RPAR＝反向被動Arthrus反應(yīng)SCR＝短一致重復(fù)
SCR1＝可溶性CR1分子4.圖表說明

圖1完整的CR1編碼區(qū)的核苷酸和氨基酸順序。該順序始于在克隆λT109.1的八聚體EcoR1接頭后的第一個核苷酸。該順序的1531號核苷酸是圖3中描繪的順序中的1號核苷酸的第1個5’核苷酸。推斷的氨基酸順序，顯示在與mRNA相應(yīng)的鏈的下面。推斷的由28-147號核苷酸編碼的推斷的信號順序在括號內(nèi)。
圖2.人體CR1 cDNA的5.5kb的限制酶圖譜。黑線表示cDNA，限制酶位點是H.Hind Ⅲ;B，BamHⅠ;R，EcoRⅠ;P，PstⅠ;A，ApaⅠ;S，SacⅠ;G，BglⅡ;K，KpnⅠ。獲得該順序的cDNA克隆顯示于圖的下面。箭頭表示采用雙脫氧核苷酸鏈終止方法分析順序的方向和長度。根據(jù)限制酶圖譜和重迭順序同一性而確定cDNA克隆的方向。
圖3，人體CR1 cDNA的5.5kb的核苷酸順序。圖中顯示了與mRNA相應(yīng)的鏈，堿基1(相應(yīng)于圖1中的堿基1532)是大多數(shù)5’克隆中EcoRⅠ接頭后的第一個堿基。終止密碼子用下劃線表示。在核苷酸147和148(箭頭)之間發(fā)現(xiàn)一段110-bp順序，用方框表示，我們認(rèn)為，它表示插入順序部分。
圖4，人體CR1 cDNA的5.5kb的核苷酸順序的點陣分析。如果90bp中至少有40bp匹配，則標(biāo)繪一個斑點。沿正方形對角線劃分的黑線表示與順序本身相重合。與相重合的線相平行的另外兩條黑線1.35和2.7kb代表兩者一前一后，引導(dǎo)每一個為1.35kb的長同源重復(fù)(LHRs)。在兩個LHRs之間的六條較淺的破折號線對應(yīng)于～2kb的短一致重復(fù)。短一致重復(fù)(SCRs)沿長同源重復(fù)延伸出0.4kb。
圖5.人體CR1的推斷的氨基酸順序。每一個殘基用一字母碼表示(Lehninger A.L，1975，Biochemistry，第2版，Worth印刷公司，New York，P.72)。將長同源重復(fù)中的殘基排成一行以表明它們的同源性。LHR-B中的所有殘基均被表示了，只有當(dāng)殘基不同于LHR-B中的時，才給出LHB-C和LHB-D的殘基。親水性排列于蛋白質(zhì)的COOH末端下以說明假定的轉(zhuǎn)移膜區(qū)。緊靠在疏水順序后的四個帶陽性電荷的殘基的范圍用上劃線表示，而與表皮生長因子受體中的蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點67%同源的六個氨基酸順序用下劃線表示，CR1蛋白質(zhì)的圖譜示于上述的順序的上面。(TM)跨膜區(qū)，(Cyt)胞質(zhì)區(qū)，(3’UT)非翻譯順序。
圖6.(A)CR1的SCRs的排列。重復(fù)是從NH末端到COOH末端的1-23號，其中已增加空間以盡可能增大排列。一個殘基如果在至少一半SCRs中存在，則被視為保守或保守置換。水平箭頭表示一個SCR，它也是從CR1基因組克隆2.38來的順序且由單一的外顯子編碼。(B)限制酶圖譜，測序方法和基因組克隆入2.38的部分順序。限制位點是(B)BamHI，(S)SacI，(E)EcoRV，(K)KpnI，(P)PstI。水平箭頭表示測序的方向和長度，垂直的箭頭表示外顯子-內(nèi)含子分界線。
圖7，已知具有該結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的SCRs的一致順序的排列。在其中增加空間以盡可能增大排列。殘基被視為保守如圖5所示，除了只具有1或2個SCRs的那些蛋白質(zhì)，其中如果殘基在至少一半其它蛋白質(zhì)中存在，則殘基為保守的，破折號相應(yīng)于非保守的位置。CR2和C2b的下劃線部分表示對于這些蛋白質(zhì)來說，在尚未有過公開發(fā)表的該區(qū)域的順序資料。方框表示不變異的半胱氨酸。順序右邊的數(shù)字表示用于產(chǎn)生一致順序的SCRs的數(shù)目。用于表示確定一致順序的順序資料的蛋白質(zhì)縮寫和參考是(CR1)補(bǔ)體受體1型，(H)因子H(Kristensen，T.等人，1986，J.Immunol.1363407)，(C46p)C4結(jié)合蛋白質(zhì)(Chung，L.P.等人，1985，Biochem.J.230133)，(CR2)補(bǔ)體受體2型(Weis J.J.等人，1986，Proc Natl.Acad.Sci，U.S.A835639)，(Ba)因子B的蛋白質(zhì)水解片段(Morley B.J.和Campbell R.D.1984.EMBOJ.3153)，(C2b)C2的蛋白水解片段(Gagnon，J.1984，Philos，Trans，R.Soc，Lond.B.Biol.Sci.306301)，(Clr)Cl的r亞基(Leytus S.P.等人，1986，Biochemistry 254855)，(ⅩⅢb)因子ⅩⅢ的b亞基(Ichinose A，等人，1986，Bio-chemistry 254633)，(β2GP1)β2糖蛋白Ⅰ(Lozier J.等人，1984.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640)，(Hap)結(jié)合珠蛋白(Kurosky，A.等人，1980，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.773388)，(IL-2-R)白細(xì)胞介素(interleukin)-2受體(LeonardW，J.等人，1985，Science 230633)。星號表示不完全順序是可以得到的。
圖8，人體CR1的推斷的結(jié)構(gòu)圖。COOH末端胞質(zhì)區(qū)是位于類脂雙層膜的右邊。30SCRs被線性地排列在質(zhì)膜的細(xì)胞外一邊，括號表示LHRs。插入圖是放大的單個SCR，說明三環(huán)結(jié)構(gòu)。
圖9.編碼人體CR1的質(zhì)粒pBSABCD插入的限制酶圖譜。在表示含有編碼順序的區(qū)的方框中顯示有來自八個cDNA克隆的九個片段，它們被連接后形成CR1結(jié)構(gòu)。括號分別指出了LHR-A，-B，-C，和-D的位置。方框下面的線表示新分離的5’cDNA克隆的位置。限制酶位點是A，ApaⅠ，B，BamHⅠ;G，BglⅡ，H，HindⅢ;K，Kp-nⅠ;M，BspMⅡ;P，PstⅠ;R，EcoRⅠ;和S，SacⅠ。
圖10，編碼LHR-A的七個SCRs的5’cDNA克隆的推斷的氨基酸順序，以及LHR-B，-C和-D相應(yīng)的SCRs的這個順序的排列。在每一個SCR中保守的四個胱氨酸用下劃線表示。只有當(dāng)殘基與LHR-A中的不同時，LHR-B，-C和-D的殘基才表示出來。
圖11表達(dá)質(zhì)粒piABCD和pMTABCD的限制酶圖譜。Pm MT和Pcmv分別代表鼠類金屬硫因(metallothionein)和細(xì)胞肥大病毒最近的早期啟動子。
圖12，分別用piABCD(a和b組)和CDM8載體(c和d組)單獨轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，然后用YZ1單克隆抗-CR1抗體和熒光素標(biāo)記的山羊抗鼠F(ab’)2間接染色的相差顯微鏡(a和c組)和免疫熒光顯微鏡(b和d組)的分析。
圖13，采用表達(dá)重組CR1的COS細(xì)胞的結(jié)合C3b和C4b的分析。用piABCD(a和c組)或CDM8載體(b和d組)單獨轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞與EAC4b(lim)，3b(a和b組)或EAC4b(c和d組)一起孵育，通過相差顯微鏡檢查玫瑰花結(jié)的形成。
圖14，由轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞表達(dá)的重組CR1的SDS-PAGE分析。分別用CDM8載體單獨轉(zhuǎn)染(通道1和4)和piABCD轉(zhuǎn)染(通道2和5)的COS細(xì)胞，和來自于具有CR1的F和S異型的個體的紅細(xì)胞(通道3和6)的表面用125Ⅰ標(biāo)記。用去垢劑處理的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，用瓊脂糖UPC10(通道1-3)和瓊脂糖-YZ1(通道4-6)連續(xù)地進(jìn)行免疫吸附，在非還原條件下用SDS-PAGE和放射自顯影分析洗脫物。
圖15，在免疫固相化重組CR1的存在下，用因子Ⅰ裂解125Ⅰ-C3(ma)。在因子H(通道1)，與CDM8載體單獨(通道)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的溶解產(chǎn)物預(yù)孵育的瓊脂糖-UPC10(通道2)，與PiABCD轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的溶解產(chǎn)物預(yù)孵育的瓊脂糖-UPC10(通道3)，用CDM8轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的溶解產(chǎn)物預(yù)孵育的瓊脂糖-YZ1(通道4)，和與piABCD轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的溶解產(chǎn)物預(yù)孵育的6μl(通道5)，12μl(通道6)和25μl(通道7)的瓊脂糖-YZ1存在下，用因子Ⅰ處理125Ⅰ-C3(ma)的重復(fù)樣品。還在無因子Ⅰ的條件下，用25μl已經(jīng)與piABCD轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞(通道8)的溶解產(chǎn)物預(yù)孵育過的瓊脂糖-YZ1處理125Ⅰ-標(biāo)記的C3(ma)的樣品。還原后，采用SDS-PAGE和放射自顯影分析125Ⅰ-C3(ma)。
圖16，編碼CR1缺失型突變體的cDNA結(jié)構(gòu)。在全長piABCD結(jié)構(gòu)(其上顯示了用于制備缺失型突變體的限制酶位點)上面，用括號表示編碼四個LHRs的cDNA片段的位置。在每一個突變體中所保留的cDNA限制片段均由實線表示。限制酶位點是A.ApaⅠ;B.BamⅠ;E，BstEⅡ和P.PstⅠ。
圖17，CR1重組缺失型突變株與野生型CR1的F和S異型的比較。分別用瓊脂糖-UPC10抗果聚糖抗體(通道1-6)，瓊脂糖-YZ-1抗CR1單克隆抗體(通道7-11)和兔抗CR1抗體和瓊脂糖-蛋白質(zhì)A(通道12)免疫沉淀125Ⅰ表面標(biāo)記紅細(xì)胞(通道1和7)及分別用CDM8載體單獨(通道2和8)，piABCD(通道3和9)，piBCD(通道4和10)，piCD(通道5和11)和piD(通道6和12)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞去垢劑處理的溶解物。在還原條件下，將洗脫物進(jìn)行SDS-PAGE和放射自顯影分析。
圖18，在表達(dá)全長和CR1缺失型突變體的COS細(xì)胞的存在下，用因子Ⅰ裂解125Ⅰ-C3(ma)。分別用CDM8載體單獨(通道1和7)，piABCD(通道2和8)，piAD(通道3和9)，piBD(通道4和10)，piCD(通道5和1)，和piD(通道6和12)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞，在因子Ⅰ缺乏(通道1-6)或存在(通道7-12)的情況下，與125Ⅰ-C3(ma)的重復(fù)樣品一起孵育。并分別用因子H和因子Ⅰ(通道13)和單獨用因子Ⅰ(通道14)與125Ⅰ-C3(ma)樣品一起孵育。還原后，用SDS-PAGE和放射自顯影分析125Ⅰ-C3(ma)。
圖19，描述包括CR1的每一個LHR的SCRs的類型，和決定C3b和D4b受體的專一性的預(yù)計位點的圖解模型。它們的次級結(jié)合專一性用圓括號表示。
圖20，保留在可溶性CR1 DNA結(jié)構(gòu)中的DNA區(qū)域的示意圖。全長CR1 cDNA的區(qū)域由圖上面的方框表示。
圖21，pTCS系列表達(dá)載體中主要成份的示意圖。
圖22，表達(dá)載體pTCSgpt的圖。多聚腺苷化位點來自于鼠Ig卡巴粒順序(NBRF Nucleic database accession ＃ Kams，bp1306-1714)，Ad2MLP和三分區(qū)來自于Ad2順序(NBRFNucleic database accession ＃ Gdad2，bp 5791-6069);SV40早1期啟動子來自于SV40基因組(NBRF Nucleic Database accession ＃ GSV40W)。gpt基因，氨芐青霉素基因和細(xì)菌復(fù)制起點來自于載體pSV2gpt(ATCC Accession No.37145)。
圖23.抗體親和純化的sCR1的4-20% SDS-PAGE。非還原(通道1，2，3)和還原(通道4，5，6)的條件下。通道1，3分子量標(biāo)記，通道3，5細(xì)胞培養(yǎng)上清原材料;通道4，6通過抗體親和層析法純化的sCR1。
圖24.陽離子交換HPLC洗脫圖。洗脫蛋白在280nm下測定吸收值(y軸)來監(jiān)測洗脫的蛋白質(zhì)。流過的(0-100分鐘)和洗脫的sCR1(150-165分鐘)的吸收部分均被切下。X軸表示洗脫時間(以分表示)。
圖25.陽離子和陰離子交換HPLC純化的sCR1的4-20%梯度SDS-PAGE。SDS-聚丙烯酰胺凝膠在非還原條件下走電泳。通道1，一部分生物反應(yīng)物的上清液;通道2，經(jīng)陽離子HPLC初始緩沖液透析的一部分生物反應(yīng)物的上清液;通道3，從陽離子交換HPLC柱上洗脫的sCR1峰的一部分;通道4，從陽離子交換HPLC層析柱得到的再經(jīng)陰離子HPLC的初始緩沖液透析的一部分sCR1峰;通道5和6，從陰離子HPLC上洗脫的sCR1的兩個不同分部的一部分。
圖26.在人體嗜中性粒細(xì)胞中C5a所引起氧突增。隨著C5a引起氧突增后，DCFDA被氧化并發(fā)出很亮的熒光。用流動血球計數(shù)法測定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度對應(yīng)于X軸，細(xì)胞數(shù)對應(yīng)于y軸。a組細(xì)胞的圖和入口(gate);b組加入C5a后0分鐘;c組;1分鐘;d組2分鐘;e組3分鐘;f組4分鐘;g組;20分鐘。該DCFDA分析顯示C5a很敏感。
圖27，在sCR1存在下，人體補(bǔ)體的激活顯示還原的C5a活性(DCFDA分析)。a組，未刺激的細(xì)胞，b組，顯示出高度熒光的無sCR1的對照物1;c組，在sCR1存在下DCFDA分析顯示出熒光強(qiáng)度降低75%。y軸是細(xì)胞數(shù)，x軸是熒光強(qiáng)度。
圖28，通過sCR1抑制在人血清中通過經(jīng)典途徑產(chǎn)生C5a和C3a。用抗體親和純化或HPLC純化的sCR1觀察到相似的圖。
圖29，通過重組sCR1抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血作用。用親和純化或HPLC純化的sCR1觀察到相似的圖。
圖30，在sCR1處理(左)和未處理(右)過的鼠中RPAR的粗形態(tài)。(a)兩個大鼠均接受卵白蛋白靜脈注射，然后用sCR1(左邊的鼠)或PBS(右邊的鼠)與抗卵白蛋白，純的(左邊的位置);抗卵白蛋白，1/2稀釋(中間位置)或兔IgG(右邊位置)的混合物進(jìn)行皮下注射。注射進(jìn)行二次;頂端和底部呈現(xiàn)相同的結(jié)果。接受sCR1的鼠幾乎無肉眼可見的變化，而未處理的鼠則顯示了RPAR的全部癥狀。(b)由(a)得到的皮膚活體組織的皮膚表面。從未處理的鼠(右)中得到的活體組織明顯地顯示出肉眼可見的損害，而從sCR1處理過的鼠(左)中得到的活體組織則顯示了正常的形態(tài)。
圖31.從sCR1處理過的(a)和未處理的(b)鼠中得到的皮膚活體組織的光學(xué)顯微鏡檢查。(a)觀察到血管周圍聚集的多形核細(xì)胞和單核細(xì)胞，但是，未看到嗜中性粒細(xì)胞的大量滲入和紅細(xì)胞的外滲。(b)可見到多形核細(xì)胞的大量滲入和紅細(xì)胞的外滲。
圖32鼠和猴的血液中注入的sCR1的廓清率，表現(xiàn)出雙相，α和β廓清率相。
圖33CR1 cDNA和內(nèi)含子探針與表達(dá)F或F′異型的個體的DNA的EcoRV酶切物雜交的Southern Blots放射自顯影圖。λDNA的HindⅢ片段的位置在左面以千堿基表示，F(xiàn)′特異性片段的位置用單箭頭表示。
圖34CR1的F等位基因的EcoRⅤ限制圖?？瞻卓虼硗怙@子的位置，點畫框代表內(nèi)含子探針雜交位置。LHR-B和-C上的方括號表示兩個可能的缺失區(qū)域。Ⅴ代表EcoRⅤ位點。
圖35重組rCR1不同型的cDNA插入子。所表示的限制性位點為A，ApaLⅠ;B，BamHⅠ;C，SacⅠ;H，HindⅢ;L，BglⅠ，PstⅠ;R，EcoRⅠ;及S，SmaⅠ。在上面的簡圖表示CR1蛋白，有同一順序的SCR以同樣的方式插入。
圖36通過在YZ-1-瓊脂糖上吸收作用純化重組sCR1在非還原條件下的Coomassie藍(lán)染色的SDS-PAGE。每欄含10微克從COS細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中純化得的重組sCR1，這些細(xì)胞分別由pasecABB-CO(欄1)，pasecABCD(欄2)或pasecACD(欄3)轉(zhuǎn)染。Mr標(biāo)志的位置在右邊用KD表示。
圖37重組sCR1的輔助因子活性。在從由pasecABBCD，pase-cABCD，或pasecACD轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞得到的重組sCR1增加量的存在下，測定C3b的α’鏈的切割。
圖38通過重組sCR1抑制紅細(xì)胞攝取125Ⅰ-C3b二聚體。在從由pasecABBCD，pasecABCD，或pasecACD轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞得到的C3b二聚體，C3b單體和重組sCR1的增加濃度下測定紅細(xì)胞結(jié)合配位體。
圖39通過由編碼CR1變異體的不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞純化而來的重組sCR1抑制旁路(A)或經(jīng)典(B)C3轉(zhuǎn)化酶。
圖40通過由編碼CR1變異體的不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞純化而來的重組sCR1抑制旁路(A)或經(jīng)典(B)C5轉(zhuǎn)化酶。
5.發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及C3b/C4b受體(CR1)基因和它編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及CR1核酸順序及其含有70個核苷酸的片段和它們編碼的包含24個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明還提供了CR1蛋白質(zhì)及其片段的表達(dá)。這種CR1順序和蛋白質(zhì)在炎癥或免疫系統(tǒng)疾病，和涉及補(bǔ)體活性疾病的診斷和治療中是有價值的。
在一個特例中，本發(fā)明涉及可溶性CR1分子和它們的表達(dá)，純化和應(yīng)用。在這里所采用的術(shù)語“可溶性CR1分子”意指與天然的CR1蛋白質(zhì)相反，部分CR1蛋白質(zhì)不能以膜蛋白質(zhì)的形式在細(xì)胞表面表達(dá)。尤其是，大量缺少跨膜區(qū)的CR1分子是可溶性CR1分子。在一個較佳實例中，可溶性CR1分子被表達(dá)它們的細(xì)胞所分泌。
在下面將要詳細(xì)描述的本發(fā)明的特例中，描述了全長CR1 cD-NA以及其片段的克隆和全部核苷酸順序和推斷的氨基酸順序，和編碼CR1產(chǎn)物的表達(dá)。具有C3b和/或C4b的結(jié)合位點，且抑制因子Ⅰ輔助因子活性的CR1以及其片段的表達(dá)也將描述。本發(fā)明通過可溶的，平截的CR1分子的制備和純化而進(jìn)一步加以描述。在一個特例中，這類分子被證明對于減輕炎癥，減小心肌梗塞范圍和防止腫塊損傷的治療是有用的。
5.1CR1基因的分離CR1基因的完整編碼順序及其推斷的氨基酸順序列于圖1。
任何人體細(xì)胞都有可能作為CR1基因的分子克隆的核酸源。CR1基因的分離包括編碼顯示CR1相關(guān)結(jié)構(gòu)或性能(例如，結(jié)合C3b或C4b或免疫復(fù)合體，調(diào)節(jié)吞噬作用，免疫激活作用或增殖，以及補(bǔ)體的調(diào)節(jié))的蛋白質(zhì)的那些DNA順序的分離。DNA可以通過該領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從克隆的DNA(如，DNA“庫”)中獲得，可采用化學(xué)合成，cDNA克隆，或基因組DNA克隆或它的片段的克隆;和從所需要的人體細(xì)胞中提純(如，可參考Maniatis等人，1982，Molecular Cloning，實驗室手冊，Gold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，New York;Glover D.M.1985，DNA克隆Apractical Approach，MRL Press有限公司，Oxford，U.K.Vol.Ⅰ，Ⅱ.)?？勺鳛镃R1基因cDNA克隆的核酸源的細(xì)胞包括(但不局限于此)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞，B細(xì)胞，T細(xì)胞，脾卵泡樹狀突細(xì)胞和腎小球足狀突細(xì)胞。來自于基因組DNA的克隆除編碼區(qū)外還可能包含調(diào)節(jié)和內(nèi)含子DNA區(qū);來自于cDNA的克隆則僅包含外顯子順序。不管來源如何，CR1基因均應(yīng)分子克隆進(jìn)入用于基因增殖的合適的載體中。
在對來自于基因組DNA的基因進(jìn)行分子克隆時，產(chǎn)生DNA片段，它們中的一些將編碼所需要的CR1基因。采用不同的限制酶，DNA可在特定的位點切斷?；蛘?，在錳存在下，我們可使用DNA酶分解DNA，或DNA可通過諸如聲處理方法而被物理地剪切。然后可采用包括(但不局限于此)瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱層析在內(nèi)的常規(guī)方法根據(jù)大小將線狀的DNA片段分離。
一旦產(chǎn)生了DNA片段，則可用許多方法來鑒定包含CR1基因的特定DNA片段。例如，如果可以得到CR1基因或它的特定RNA，或它們的片段，并可被純化和標(biāo)記，則所產(chǎn)生的DNA片段就可通過與標(biāo)記探針的核酸雜交進(jìn)行篩選(Benton W和Davis R，1977，Sci-ence 196180;Grunstein M和Hogness D，1975，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.723961)。與探針大量同源的那些DNA片段將能雜交。如果純化的CR1專一探針得不到，則富含CR1的核酸部分可以作為探針而用于初步選擇方法。作為一個實例來說，可以使用已去除了成纖維細(xì)胞表達(dá)的信息的表現(xiàn)B細(xì)胞cDNA的探針。也可通過限制酶酶切并根據(jù)已知的限制酶圖譜(如果它是可以得到的)與預(yù)期的片段進(jìn)行片段大小比較來鑒定合適的片段。在初步選擇后，根據(jù)基因的性能，或它的表達(dá)產(chǎn)物的物理，化學(xué)或免疫性能(如后面要描述的)，可以進(jìn)行進(jìn)一步的選擇。
CR1基因也可以通過核酸雜交然后體外翻譯進(jìn)行mRNA選擇而被鑒定。在這個過程中，片段被用于通過雜交來分離互補(bǔ)的mR-NAs。這些DNA順序可代表可以得到的，純化的CR1DNA，或已被富集CR1順序的DNA。
分離的mRNAs的體外翻譯產(chǎn)物的免疫沉淀分析或功能鑒定(如，C3b或C4b的結(jié)合，或吞噬作用或免疫激活的促進(jìn)，或補(bǔ)體調(diào)節(jié)等)識別了mRNA和含有CR1順序的互補(bǔ)DNA片段。此外，通過從細(xì)胞中分離出來的多核糖體對專一地抗CR1的固相抗體的吸附，可以選擇出特定的mRNAs。用選出的mRNA(來自于被吸附的多核糖體)作為模板可以合成放射標(biāo)記的CR1cDNA。然后可用放射標(biāo)記的mRNA或cDNA作為探針將CR1DNA片段從基因組其它DNA片段中識別出來。
分離CR1基因組DNA的其它方法包括(但不局限于此)從已知的順序中化學(xué)地合成基因順序本身或制備編碼CR1基因的mR-NA的cDNA。例如，如上面所描述的，用于CR1基因的cDNA克隆的RNA可以從包括(但不限于)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞，B細(xì)胞，T細(xì)胞，樹狀突細(xì)胞和足狀突細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞中分離出來。在一個較佳具體實施例中，扁桃體(tonsilar)細(xì)胞可以作為用于cDNA克隆的mRNA的來源(見后面)。在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方法也是可行的。
然后，可將經(jīng)確定和分離的基因插入合適的克隆載體中。該領(lǐng)域已知的很多載體宿主系統(tǒng)均可采用?？赡艿妮d體包括(但不局限于)質(zhì)?；蚪?jīng)修飾的病毒，但是載體系統(tǒng)必須與所采用的宿主細(xì)胞相容。這類載體包括(但不局限于)噬菌體，如λ衍生物;或質(zhì)粒，如pBR322或pUC質(zhì)?；駽DM8質(zhì)粒(Seed B.1987，Nature 329840-842)或衍生物。重組子可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，感染，電刺激(elec-troporation)等而導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
在另一個方法中，在以“鳥槍”法插入合適的克隆載體后，可以確定和分離CR1基因。在插入克隆載體前，可通過諸如大小分部分離的方法而富集CR1基因。
CR1基因被插入可以用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染合適的宿主細(xì)胞的克隆載體中，這樣，可產(chǎn)生很多基因順序的拷貝。在一個特例中，克隆載體可以是CDM8載體，它可用于在哺乳動物宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。插入至克隆載體內(nèi)可以通過將DNA片段連接到具有互補(bǔ)的粘性末端的克隆載體中而完成。但是，如果在克隆載體中不存在可用于切割DNA的互補(bǔ)限制酶位點，則DNA分子的末端可進(jìn)行酶修飾。換句話說，任何所需要的位點均可通過將核苷酸順序(接頭)連接到DNA末端而產(chǎn)生;這些連接接頭可以包含能編碼限制性核酸內(nèi)切酶識別順序的特定的化學(xué)合成的寡核苷酸。在另一個方法中，切割的載體和CR1基因可以用同聚加“尾”加以修飾。
根據(jù)DNA本身的性能，或者，根據(jù)它所編碼的蛋白質(zhì)的物理免疫學(xué)的或功能的性能，可以用許多不同的方法來進(jìn)行克隆的CR1基因的鑒定。例如，DNA本身可以通過將噬菌斑或菌落與標(biāo)記的探針進(jìn)行核酸雜交而檢測(Benton W和Davis R.1977，Science 196180;Grunstein M和Hongness D，1975，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.723961)。或者，CR1基因的存在可以通過根據(jù)它的表達(dá)產(chǎn)物的性能的測定而檢測。例如，可以將能產(chǎn)生這樣的蛋白質(zhì)，如與已知的CR1具有相近或相同的電泳遷移，等電聚焦現(xiàn)象，蛋白質(zhì)水解消化圖譜，C3b和/或C4b和/或免疫復(fù)合體結(jié)合活性，補(bǔ)體調(diào)節(jié)活性，對吞噬作用或免疫制激的影響，或抗原性的cDNA克隆或能雜交選擇合適的mRNAs的DNA克隆選出來。采用一種CR1抗體，用ELISA(酶連免疫吸附分析法)的方法，CR1蛋白質(zhì)就可通過將標(biāo)記的抗體與推測的合成CR1的克隆相結(jié)合而得以鑒定。
在一個特例中，用插入了分離的CR1基因，cDNA，或合成的DNA順序的重組DNA分子進(jìn)行的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能夠產(chǎn)生多個基因拷貝。因此，通過使轉(zhuǎn)化子生長，從轉(zhuǎn)化子中分離重組DNA分子和，當(dāng)需要時，從分離的重組DNA中重新得到所插入的基因，就可以獲得大量的基因。
在一個特例中，在CDM8載體中的CR1cDNA克隆可以被轉(zhuǎn)染入COS(猴腎)細(xì)胞，以在細(xì)胞肥大病毒啟動子的控制下進(jìn)行大量的表達(dá)(見下面第8章節(jié))。
如果最終的目的是將基因插入病毒表達(dá)載體，如牛痘病毒或腺病毒，將插入CR1基因的重組DNA分子進(jìn)行修飾，以使該基因側(cè)面與病毒順序相接，這些病毒順序允許在被該病毒感染的細(xì)胞內(nèi)發(fā)生遺傳重組從而使CR1基因能插入到病毒的基因組內(nèi)。
當(dāng)含CR1DNA的克隆鑒定，生長和收集后，它的DNA插入的特性如下面5.4.1中所描述的。
當(dāng)CR1基因的遺傳結(jié)構(gòu)已知時，就有可能操作該結(jié)構(gòu)，使其最佳地用于本發(fā)明。例如，啟動子DNA可以與編碼CR1的順序的5’相連接，此外，還可替代天然啟動子以增加蛋白質(zhì)的表達(dá)。能表達(dá)CR1缺失突變體的表達(dá)載體也可制備，以得到CR1順序的確定的片段的表達(dá)(見下面8.3章節(jié))。在一個特例中，可以構(gòu)建能編碼可呈現(xiàn)所需要的C3b和/或C4b結(jié)合活性(見下面9章節(jié))的CR1蛋白質(zhì)的片段(例如，結(jié)合C4b的LHR-A，或結(jié)合C3b的LH■C)的缺失突變體。在另一個實例中，編碼帶有缺失跨膜區(qū)的CR1分子的表達(dá)載體可被用于制備可溶性的CR1蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，很多操作都是可能的。
5.2克隆的CR1基因的表達(dá)編碼CR1蛋白質(zhì)(圖1)或它的一部分的核苷酸順序可以被插入合適的表達(dá)載體，即含有插入的蛋白編碼順序的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的成份的載體。必要的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號也可由天然CR1基因和/或它的側(cè)面區(qū)所提供。各種宿主-載體系統(tǒng)可用于表達(dá)蛋白編碼順序。它們包括(但不局限于)被病毒(如牛痘病毒，腺病毒等)感染的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng);被病毒(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng);微生物，如包含酵母載體的酵母(菌);或用噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或cosmidDNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。這些載體的表達(dá)成份的強(qiáng)度和特性不同。根據(jù)所采用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用任何一種合適的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯成份。例如，當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時，可以采用自哺乳動物細(xì)胞的基因組或在這些細(xì)胞中生長的病毒(如腺病毒，猴病毒40，細(xì)胞肥大病毒)分離得的啟動子。也可以使用由重組DNA或合成技術(shù)所制備的啟動子以轉(zhuǎn)錄插入的順序。
為了有效地翻譯插入的蛋白編碼順序，專一起始信號也是需要的。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近的順序。在包括其固有的起始密碼子和鄰近的順序的完整CR1基因被插入合適的表達(dá)載體內(nèi)的情況下，不需要附加的翻譯控制信號。但是，在只有部分CR1的編碼順序被插入的情況下，一定要提供包括ATG起始密碼子在內(nèi)的外源翻譯控制信號。此外，起始密碼子必須與蛋白編碼順序的讀碼同相，以保證整個插入部分的翻譯。這種外原翻譯控制信號和起始密碼子可以是各種來源的，天然或合成的均可。
上述用于將DNA片段插入載體的任何方法均可用于構(gòu)建包含由合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號和蛋白質(zhì)編碼順序所組成的嵌合基因的表達(dá)載體。這些方法可以包括體外重組DNA和合成技術(shù)和體內(nèi)重組(遺傳重組)。
上述用于將DNA片段插入載體的任何方法均可用于構(gòu)建包含由合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號和蛋白質(zhì)編碼順序所組成的嵌合基因的表達(dá)載體。這些方法可以包括體外重組DNA和合成技術(shù)和體內(nèi)重組(遺傳重組)。
在一個特例中，可溶性CR1分子可以被表達(dá)。這種可溶性分子可以通過采用重組DNA技術(shù)，刪除編碼CR1跨膜區(qū)的DNA順序而制備(見下面11-14章節(jié))。如在下面所演示的，表達(dá)可溶性CR1分子的能力不受任何一種CR1核酸順序的遺傳修飾的限制，只要刪除編碼CR1跨膜區(qū)的六部分的核酸順序，就可獲得可溶性的CR1結(jié)構(gòu)。
含有CR1基因插入部分的表達(dá)載體可以通過三種普通的方法來鑒別(a)DNA-DNA雜交，(b)“標(biāo)記”基因的功能的存在或缺乏，和(c)插入的順序的表達(dá)。在第一種方法中，被插入于表達(dá)載體中的外源基因的存在可以通過DNA-DNA雜交，采用含有與插入的CR1基因同源的順序的探針，來加以檢測。在第二種方法中，重組載體/宿主系統(tǒng)可以根據(jù)由外源基因插入載體而引起的一定的“標(biāo)記”基因的功能(例如，胸腺嘧啶核苷激酶活性，耐抗生素性，轉(zhuǎn)化表型，在桿狀細(xì)菌中閉合體的形成等等)的存在或缺乏而加以鑒別和選擇。例如，如果CR1基因被插入于載體的標(biāo)記基因順序中，包含CR1插入部分的重組子可以通過標(biāo)記基因的功能的缺乏而鑒別。在第三種方法中，可以通過測定由重組子所表達(dá)的外源基因產(chǎn)物而鑒定重組表達(dá)載體。這種測定方法可以根據(jù)基因產(chǎn)物的物理，免疫或功能的特性而進(jìn)行。
一旦當(dāng)一個特定的重組DNA分子被鑒別和分離，則可用該領(lǐng)域中已知的幾個方法使它增殖。當(dāng)一個合適的宿主系統(tǒng)和生長條件被建立，則重組表達(dá)載體可以大量地繁殖和制備。
在本發(fā)明的實例中詳細(xì)描述的一個特例中，攜帶CR1cDNA插入部分的CDM8載體可被轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞，在其中CR1cDNA插入部分被表達(dá)以產(chǎn)生CR1蛋白質(zhì)。在下面章節(jié)的實例中詳細(xì)描述的一個特例中，攜帶相應(yīng)于部分CR1編碼區(qū)的CR1cDNA插入部分的CDM8載體可被轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞，在其中CR1或片段被表達(dá)。在下面將要描述的另一實例中，通過采用表達(dá)載體，如在11.3.1章節(jié)中所描述的pTCS載體，平截的，可溶性CR1分子可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。如前面所述的，可以采用的表達(dá)載體包括(但不局限于)下列載體或它們的衍生物人體或動物病毒，如牛痘病素或腺病毒;昆蟲病毒，如桿狀病毒;酵母載體;噬菌體載體(如λ-噬菌體載體)和質(zhì)粒和cosmid DNA載體，前面例舉的只是少數(shù)。
此外，可以選擇一個宿主細(xì)胞系，它能調(diào)節(jié)插入順序的表達(dá)，或按所需要的特定形式修飾和加工嵌合基因產(chǎn)物。在一定的誘導(dǎo)物存在下，一定的啟動子的表達(dá)可以增強(qiáng);因此，遺傳工程的CR1蛋白質(zhì)的表達(dá)可以控制。而且，不同的宿主細(xì)胞對于蛋白質(zhì)的翻譯和翻譯后加工和修飾具有特定和專一的機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以保證所表達(dá)的異源蛋白質(zhì)的所需要的修飾和加工。例如，在一個實施例中，在細(xì)菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)可用于產(chǎn)生一種具有圖1中所推斷的氨基酸順序的未糖基化的CR1蛋白質(zhì)。而在酵母中表達(dá)則得到一種糖基化的產(chǎn)物。在另一個實施例中，為了保證異源CR1蛋白質(zhì)的“天然”糖基化作用，可以采用哺乳動物的COS細(xì)胞。此外，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可能影響加工反應(yīng)，如產(chǎn)生不同程度的蛋白質(zhì)裂解。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以得到CR1蛋白質(zhì)的多種不同的加工產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個較佳實施例中，可溶性CR1分子的大量制備可以如下面12.1等章節(jié)中所描述的那樣進(jìn)行。
5.3.表達(dá)的基因產(chǎn)品的鑒別和純化一旦表達(dá)CR1基因的重組子被鑒別了，就應(yīng)該分析基因產(chǎn)物。這可以通過產(chǎn)物的物理，免疫或功能的特性的測定而完成。
CR1蛋白質(zhì)可通過包括色譜法(如離子交換，親和層析，和大小分離柱層析，高壓液相層析)，離心，差異溶解性，或通過純化蛋白質(zhì)的基它常規(guī)技術(shù)而被分離和純化。
在下面的實例中詳細(xì)描述的本發(fā)明的一個較佳實例，大量的可溶性CR1可以通過包括HPLC在內(nèi)的方法而純化(見12.2等章節(jié))。如下所述，純化的CR1的大量制備可以通過采用一種表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行，它產(chǎn)生可溶性CR1作為初始物質(zhì)，這就不需要對膜結(jié)合CR1用去垢劑以使之溶解。在生物反應(yīng)培養(yǎng)物中牛胎血清濃度的減小和/或在這些培養(yǎng)物中采用選擇性培養(yǎng)基就消除了在后面的純化中從含有可溶性CR1初始物質(zhì)中除去高濃度的外源蛋白質(zhì)的需要。在這個較佳實例中，陽離子HPLC或陽離子HPLC，然后陰離子交換HPLC相結(jié)合的方法可以用于純化。這樣，僅以一或二個步驟，就可高產(chǎn)率地獲得基本純化的可溶性CR1。
或者，一旦由重組子所產(chǎn)生的CR1蛋白質(zhì)被鑒定，則蛋白質(zhì)的氨基酸順序就可以從包含于該重組子中的嵌合基因的核苷酸順序來推斷。結(jié)果，蛋白質(zhì)可以通過該領(lǐng)域已知的常規(guī)化學(xué)方法來合成(例如，可參考Hunkapiller M.等人，1984，Nature 310105-111)。
在本發(fā)明的一個特例中，這種CR1蛋白質(zhì)(不管是由重組DNA技術(shù)還是用化學(xué)合成方法制得的)包括(但不局限于)包含初級氨基酸順序，圖1中描繪了全部或部分氨基酸順序包括在該順序內(nèi)的由功能相同的殘基進(jìn)行取代而產(chǎn)生同義變化(Silent Change)的改變順序。例如，在該順序中的一個或多個氨基酸順序可以被一個具有相似極性的起同樣功能的氨基酸所取代而產(chǎn)生同義置換。非保守的置換也可產(chǎn)生功能相同的蛋白質(zhì)。
在一個實施例中，CR1順序內(nèi)的氨基酸的置換可以從該氨基酸所屬的組的其他組份中選擇。例如，非極性(疏水的)氨基酸包括丙酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在翻譯中或翻譯后，進(jìn)行各種不同的修飾，如糖基化，蛋白質(zhì)水解等的CR1蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在下面要詳細(xì)描述的本發(fā)明的一個實例中，顯示了由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)的克隆重組CR1，它不能用SDS-PAGE方法與紅細(xì)胞的F-異型體區(qū)別開來(圖14)，它可介導(dǎo)載有C4b或C3b的羊紅細(xì)胞的結(jié)合，和能夠再產(chǎn)生CR1的配體專一性(圖13)，并顯示出對于切割C3(ma)的α多肽的因子Ⅰ輔助因子活性(圖15)。
5.4.CR1基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)CR1基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以通過該領(lǐng)域已知的多種方法來分析，包括(但不局限于)下面描述的那些。
5.4.1.遺傳分析與CR1基因相應(yīng)的克隆的DNA或cDNA可以用包括(但不局限于)Southern雜交(Southern E.M.1975，J.Mol.Biol.98503-517)，Northern雜交(可參考Freeman等人，1983，Proc.Natl.A-cad.Sci.U.S.A.804094-4098)，核酸限制內(nèi)切酶圖譜(Maniatis T.1982，Molecular Cloning，實驗室手冊，Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，New York)，和DNA順序分析在內(nèi)的方法來分析。Southern和Northern雜交的雜交條件的嚴(yán)格程度可進(jìn)行控制以保證與所用的特定CR1探針具有所需的核酸順序的檢測。例如，在不很嚴(yán)格的條件下，與含有編碼LHR-B和LHR-C的CR1基因順序的探針雜交可用于檢測CR2核酸順序。
限制性核酸內(nèi)切酶圖譜可用于粗略地確定CR1基因的遺傳結(jié)構(gòu)。在一個特例中，用限制酶切割可以得到如下面的圖2中所示的限制酶圖譜，由限制性核酸性內(nèi)切酶切割所得到的限制酶圖譜可以通過DNA順序分析而得以證實。
DNA順序分析可以通過該領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來進(jìn)行，包括(但不局限于)Maxam和Gilbert方法(1980，Meth.Enzymol.65499-560)，Sanger雙脫氧方法(Sanger，F(xiàn).等人，1977，Proc.Natl.Acael.Sci.U.S.A.745463)或使用自動DNA測序儀(如，Ap-plied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA.)。CR1基因的cDNA順序包括在后面的圖1中所標(biāo)繪的和在第6，第7章節(jié)所描述的順序。
5.4.2.蛋白質(zhì)分析CR1蛋白質(zhì)的氨基酸順序可以通過從DNA順序推斷，或者直接測蛋白質(zhì)的順序，如采用自動氨基酸順序儀。一個典型的CR1蛋白質(zhì)的氨基酸順序主要包括在圖1中和下面的第6章節(jié)中詳細(xì)描述的順序。如下面所要描述的，所有F異型體CR1的編碼順序均已克隆，在切去41個氨基酸的信號肽后，成熟受體包含1998個氨基酸，其中包括形成30SCRs的1930殘基的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū)(其中28個SCRs被組入LHR-A，-B，-C和-D(圖10))，25個氨基酸的跨單層膜區(qū)和43個氨基酸的相對較短的胞質(zhì)區(qū)。
在包含多個SCRs的C3/C4結(jié)合蛋白中，CR1是唯一具有幾組組入LHRs的SCRs的。比較CR1的四個LHRs顯示，每一個均由四種類型的SCRs組成，即a、b、c和d型(圖19)。例如，LHR-A的SCR-1和SCR-2的順序與LHR-B，-C和-D的前二個SCRs分別只有62%，62%和57%相同。但是，SCR-3至SCR-7與LHR-B上相應(yīng)的SCRs2僅在一個位置上不同，SCR-3和-4與LHR-C上相應(yīng)的SCRs僅在三個位置上不同(圖10)。因此，LHR-A的“a”型SCRs中的一些也存在于LHR-B和-C中。與LHR-A上相應(yīng)的SCRs不同的LHR-B的前二個SCRs與LHR-C上相應(yīng)的SCRs有99%相同，因此，LHR-B和-C在這些位置上共有“b”型SCRs。LHR-C上的SCR-5，-6，-7只有77%與在這些位置上的LHR-A和-B的“a”型SCRs相同，被認(rèn)為是“c”型SCRs。LHR-D的1-4個SCRs是相對獨特的，是“d”型，而SCRs5-7有約93%與在LHR-C中發(fā)現(xiàn)的“c”型相同。
CR1蛋白質(zhì)順序可進(jìn)一步通過親水性分析(Hopp T.和Woods K.1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.A，783824)來定性。親水性的圖可用于鑒別CR1蛋白質(zhì)的疏水區(qū)的親水區(qū)，以及編碼這些區(qū)域的基因順序的相應(yīng)區(qū)域。圖5描繪了CR1蛋白質(zhì)的COOH末端的親水性圖。
為了預(yù)測CR1特異性二級結(jié)構(gòu)區(qū)，可以進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析(Chou P.和Fasman G.，1974，Biochemistry 13222)。
可以采用其它方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。它們包括(但不局限于)X-射線結(jié)晶學(xué)(Engstom A.1974，Biochem.Exp.Biol.117-13)和計算機(jī)模型(Fletterick R.和Zoller M.ceds.)，1986，Computer Graphicsand Molecular Modeling，in Current Communications in Molecular Biolo-gy，Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，New York)。
5.5.與CR1有關(guān)的衍生物，類似物和肽與CR1有關(guān)的衍生物，類似物和肽的制備和使用也是可以展望的，關(guān)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這類具有所需要的免疫原性或抗原性的衍生物、類似物或肽可以被用于諸如免疫分析，免疫接種，治療等中。這類分子保留或者抑制了一個所需要的CR1性能，例如，C3b或C4b的結(jié)合，補(bǔ)體活性的調(diào)節(jié)，或促進(jìn)免疫刺激或吞噬作用等，它們可分別用作這些特性的誘導(dǎo)物，或抑制劑。
本發(fā)明的CR1相關(guān)衍生物，類似物和肽可以通過該領(lǐng)域已知的多種方法來制備。制備它們的操縱可在基因或蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行。例如，克隆CR1基因可以通過該領(lǐng)域已知的多種方法(Maniatis T.1982，Molecular Cloning，實驗室手冊，Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，New York)加以改進(jìn)得到?？梢宰骱怂嵯拗苾?nèi)切酶(一種或多種)將CR1順序在合適的位點酶切，如果需要的話，再進(jìn)一步用酶進(jìn)行修飾，分離，并在體外連接(見下面第8章節(jié))。在制備編碼CR1相關(guān)衍生物，類似物或肽的基因時，必須十分仔細(xì)以保證經(jīng)修飾的基因在編碼所需要的CR1專一活性的基因區(qū)內(nèi)，保留在與CR1相同的翻譯閱讀框架中，不被翻譯終止信號打斷。在一個特定的實例中，可生產(chǎn)出編碼融合蛋白的核苷酸順序，其組成包括部分CR1順序和非CR1順序。
此外，CR1基因可以在體外或體內(nèi)突變，以產(chǎn)生和/或破壞翻譯，起始，和/或終止順序，或在編碼區(qū)內(nèi)產(chǎn)生變異和/或新的限制性核酸內(nèi)切酶位點或破壞先前所存在的位點，促進(jìn)在體外的進(jìn)一步修飾。該領(lǐng)域已知的任何突變技術(shù)均可使用，包括(但不局限于)在體外直接點突變(Hutchinson C.等人，1978，J.Biol.Chem.2536551)，TAB接頭的使用(Pharmacia)，等等。
CR1順序的操縱也可以在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行?？刹捎靡阎募夹g(shù)來進(jìn)行幾種化學(xué)修飾中的任一種，包括(但不局限于)通過溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH的特異性化學(xué)裂解;乙酰化，甲?；?，氧化，還原;在衣霉素的存在下，代謝合成;等等。
此外，CR1相關(guān)類似物和肽可以用化學(xué)方法合成。例如，與可介導(dǎo)所需要的活性(例如，C4b和/或C3b結(jié)合，免疫刺激，補(bǔ)體調(diào)節(jié)等)的一部分CR1相應(yīng)的肽可以采用肽合成儀(例如，Applied-Biosystems Model 380A)來合成。
可通過重組DNA步驟對CR1核苷酸順序進(jìn)行特異性修飾，這樣可得到編碼具有重復(fù)LHR-B順序的蛋白質(zhì)順序。這種效價修飾改變C3b結(jié)合程度。
5.6.CR1的用途5.6.1測試和診斷CR1蛋白質(zhì)、類似物、衍生物及其亞序列(subsequence)、及抗-CR1抗體可應(yīng)用在測試及診斷中。本發(fā)明的具有所需的CR1性質(zhì)或功能的分子可用于測試這類性質(zhì)或功能。例如表現(xiàn)出以游離的或復(fù)合物形式連接C3b及/或C4b的CR1蛋白質(zhì)或其片段可用于測定某一樣品，例如病人體液中的該物質(zhì)的量。
在一個特定的實例中，具有結(jié)合C3b(例如參見下述之表Ⅱ、第9章)ic3b或C4b(例如參見表Ⅱ)的在細(xì)胞表面表達(dá)的全長CR1或CR1缺失突變體(例如在以下的第8章所述者)可用于在同一個樣品中分別測定C3b、ic3b、或C4b的水平。在另一個實施例中，用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的缺失一個跨膜序列的一個CR1蛋白或其片段被分泌并被采用。
在一個特殊的實例中，這類對C3b及/或C4b的測定可以用作對補(bǔ)體活性的標(biāo)志，從而可用于對炎癥及免疫系統(tǒng)疾病的診斷。這類疾病包括(但不限于)因燒傷引起的組織損傷或心肌梗塞引起的創(chuàng)傷成年人的呼吸窘迫綜合征(shock lung)，自身免疫性疾病，諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡，以及其他的涉及不希望的或不正常的補(bǔ)體活性的各種疾病或不適(參見文獻(xiàn)e.g.，Miescher，P.A.and Muller-Eberhard，H.J.，eds.，1976，Text Book ofImmunopathology，2d Ed.，Vols.Ⅰ and Ⅱ，Grune andStratton，NewYork;Sandberg，A.L.，1981，in Cellular FunctionsinImmunity and Inflammation，Oppenheim，J.J.et al.，eds.，Elsevier/North Holland，New York，P.373;Conrow，R.B.et al.，1980，J.Med.Chem.23242;Regal，J.F.and Pickering，R.H.，1983，Int.J.Immunopharmacol.571;Jacobs H.S.，1980，Arch.Pathol.Lab.Med.104617)。
CR1蛋白及其片斷含有一個表位，可用于(但不限于)免疫測定等測試中?？梢圆捎玫拿庖邷y定包括(但不限于)競爭性和將競爭性測定系統(tǒng)，采用的技術(shù)諸如放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫附試驗)、“夾心式”免疫測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散試驗、凝集試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、免疫放射量測定、熒光免疫測定、蛋白A免疫測定及免疫電泳測定等，以上列舉的是部分。
CR1基因及相關(guān)的核酸序列及亞序列可以用于雜交測試法。這類雜交測試法可以用于監(jiān)測與CR1表達(dá)相關(guān)的炎癥或免疫應(yīng)答，用于診斷某些與CR1表達(dá)的變化相關(guān)的疾病狀態(tài)，用于確定某個病人的CR1異型，用于檢測CR1基因及相關(guān)基因(例如，CR2)的存在及/或表達(dá)。
用于進(jìn)行本發(fā)明的測試的成套工具也有供應(yīng)。
5.6.2治療CR1蛋白及其片段、衍生物及類似物可在調(diào)節(jié)CR1介導(dǎo)的功能上有治療作用。這類功能包括(但不限于)以游離或復(fù)合物的形式結(jié)合C3b及/或C4b、促進(jìn)吞噬作用、補(bǔ)體的調(diào)節(jié)、免疫刺激等等。有效劑量的本發(fā)明的CR1蛋白及相關(guān)分子對于與這些功能相關(guān)的許多疾病或不適，諸如免疫或炎癥疾病(例如，如以上第5.6.1章節(jié)所述)具有治療價值。例如，那些顯示了所需活性的全長的CR1或其片段和相關(guān)分子可用于補(bǔ)體抑制的治療中，通過其作為因子Ⅰ輔助因子的能力，促進(jìn)補(bǔ)體成分C3b或C4b的不可逆失活(參見Fearon，D.T.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.765867;Iida，K.andNussenzweig，V.，1981，J.Exp.Med.1531138)，及/或其通過抑制旁路或經(jīng)典的C3或C5轉(zhuǎn)化酶的能力。
本發(fā)明的一個特定的實例中，可以構(gòu)建一個表達(dá)載體，它編碼缺乏跨膜區(qū)域的一個CR1分子(例如，使C-末端缺失，到為大多數(shù)C-末端SCR所編碼的精氨酸為止)，從而產(chǎn)生一種，在游離或復(fù)合物形式下保持了連接C3b及/或C4b能力的可溶性CR1片段。在一個特別的實例中，這樣的一種CR1蛋白可以不再顯示出因子Ⅰ輔助因子的活性。這種可溶性的CR1產(chǎn)物可施于患者體內(nèi)，以便使可溶性的CR1有效地與天然的細(xì)胞表面CR1競爭地結(jié)合C3b及/或C4b，從而阻斷細(xì)胞表面CR1因子Ⅰ輔助因子活性，并提高補(bǔ)體活性。
當(dāng)C3b被共價地結(jié)合到顆粒及可溶性的免疫復(fù)合體后，經(jīng)過蛋白水解加工C3b失活形成ic3b及C3dg，具有兩種生物學(xué)結(jié)果阻止補(bǔ)體系統(tǒng)通過放大途徑的過多的激活，以及形成可以結(jié)合非CR1的受體的配位體。由于ic3b片段不能連接B因子，因而轉(zhuǎn)變成這種狀態(tài)后可阻斷通過另一放大途徑的額外的補(bǔ)體激活。然而，ic3b可以與CR1及CR3結(jié)合，兩種補(bǔ)體受體介導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞的吞噬作用。因而，C3b轉(zhuǎn)化成為ic3b的初級生物學(xué)結(jié)果是在不干擾由CR1-及CR3介導(dǎo)的對C3包被的(C3-coated)復(fù)合物的清除的情況下，中止補(bǔ)體的激活。相反，ic3b向C3dg的另外的轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的一個片段僅與CR2作用而不與CR1及CR3作用。這種情形限制了依賴補(bǔ)體的載有C3dg的復(fù)合物與表達(dá)CR2的那類細(xì)胞的連結(jié)，這類細(xì)胞包括B淋巴細(xì)胞、濾泡樹狀突細(xì)胞，也許還包括真皮的上皮細(xì)胞、并且減少或排除了與吞噬作用型細(xì)胞的作用。這種改變的細(xì)胞聯(lián)合形式的生物學(xué)結(jié)果，應(yīng)該將涉及免疫應(yīng)答傳入期的細(xì)胞而非那些涉及清除及降解顆粒及復(fù)合物的細(xì)胞作為載有C3dg復(fù)合體的靶子。因而，CR1在治療上不僅可用以影響清除過程，而且可用以將參與抗原遞呈及抗體形成的載有CR2的細(xì)胞類型作為復(fù)合物的靶子。
在另一個實例中，能與C3b或C4b結(jié)合、及/或保留抑制旁路的或經(jīng)典的C3或C5轉(zhuǎn)化酶能力或保留因子Ⅰ輔助因子活性的CR1蛋白或片段可以用以促進(jìn)補(bǔ)體的失活。在該實例中，該CR1蛋白或片段在醫(yī)治那些涉及不希望的或不合適的補(bǔ)體活性的疾病(例如，成年呼吸窘迫癥(Shock lung)，因燒傷引起的組織損傷或心臟局部缺血的病情，自身免疫性疾病，類癥情況等等)方面具有價值。
在下述舉例的11-14章中細(xì)述的特定的實施例，一種可溶性CR1分子被表達(dá)，它保留了所需的功能活性，例如在體外具有對經(jīng)典的補(bǔ)體介導(dǎo)的血細(xì)胞胞溶，經(jīng)典的C5a產(chǎn)生，經(jīng)典的C3a的產(chǎn)生，或中性粒細(xì)胞的氧突增(Oxidative burst)等的抑制能力。在一個特殊的實施例中，該種可溶性的CR1分子可用于減輕炎癥及其損害，或減小心肌梗塞的區(qū)域大小或預(yù)防腫塊(reperfusion)損傷等等。這種體內(nèi)治療試驗中有用的CR1分子可用各種現(xiàn)有技術(shù)中的模型系統(tǒng)進(jìn)行測定，包括(但不限于)反相被動阿圖斯氏反應(yīng)(見第14.1章節(jié))及大鼠心肌梗塞模型(見第14.3章節(jié))。
在本發(fā)明的另一個實施例中，一個顯示能抑制所需的CR1性質(zhì)或功能的CR1的片段或其類似物或衍生物可用以預(yù)防或治療與這些功能有關(guān)的疾病或不適。
已知各種傳遞系統(tǒng)可用于遞送CR1及相關(guān)分子，例如，用脂質(zhì)體微分子包囊法或微膠囊法、在基因治療中用造血干細(xì)胞后代來表達(dá)等等。其它的引入的方法包括(但不限于)皮膚內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)及口服等等施用途徑。
本發(fā)明還提供了藥理學(xué)組合物。這些組合物包括治療上有效量的CR1蛋白，或其類似物，衍生物，或片段，及藥理學(xué)上可接受的載體。這種載體包括但不局限于鹽水、緩沖鹽溶液，右旋糖及水。
5.6.3聯(lián)合療法本發(fā)明的另一方面提供了治療血栓形成的方法，尤其是人類及動物中的急性心肌梗塞，這個方法包括給需要的人或動物服用本發(fā)明的有效量的可溶性CR1蛋白質(zhì)，及有效量的溶血栓劑。
本發(fā)明還提出了將可溶性CR1蛋白質(zhì)和溶血栓劑制成藥物，治療人類及動物中的血栓形成疾病。
在上述方法中，化合物可以任何方便的方式給藥，如輸注或藥用注射，可以依次或一并給藥。當(dāng)依次給予本發(fā)明的可溶性CR1蛋白質(zhì)和溶血栓劑時，可在接受溶血栓劑前或后使用可溶性CR1蛋白。當(dāng)同時給予可溶性CR1蛋白質(zhì)和溶血栓劑時，較好的方法是以包含兩種藥劑的藥理學(xué)組合物的形式給藥。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥理學(xué)組合物，它包含一種可溶性CR1蛋白質(zhì)和一種溶血栓劑，在一種藥理學(xué)上可行的載體上。
在一個較佳實施例中，組合物可用常規(guī)方法加工成適合于人類靜脈內(nèi)給藥的形式。
典型的靜脈內(nèi)給藥的組合物為在無菌等滲緩沖液中的溶液。如必要的話，組合物還可包括一種增溶劑和一種局部麻醉劑，如利多卡因，以緩解注射處的疼痛。一般來說，各組分可以單位劑量形式分別或混合提供，例如，以干燥凍干粉末或無水濃縮物形式在密封的容器如安瓿或袋中，上面以活性單位形式標(biāo)明活性劑的量。如組合物以輸注方式給藥，可將它在含無菌藥學(xué)級“注射用水”或鹽水的輸注瓶中配藥。當(dāng)組合物是以注射方式給藥時，需提供一安瓿元菌注射用水或鹽水，以便在給藥前先混合組分。
包含一個或更多個基中有一個或更多個藥理學(xué)組合物組分的容器的藥物包也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
使用的材料量，以及溶血栓劑對CR1蛋白質(zhì)的比率，將根據(jù)血栓栓塞嚴(yán)重的程度及血塊的位置和大小來決定。所用的精確量及給藥形式需考慮到病的性質(zhì)，由主治醫(yī)生根據(jù)情況決定。但是，通常情況下，治療血栓的病人一般接受每標(biāo)準(zhǔn)劑量的溶血栓劑0.5至50毫克補(bǔ)體抑制劑(可溶性CR1組分)。
用于上述聯(lián)合療法的特定的溶血栓劑為溶(血)纖維蛋白酶，包括(血)纖維蛋白溶酶原激活劑。
名詞(血)纖維蛋白溶酶原激活劑包括但不局于鏈激酶，人體組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)及尿激酶(u-PA)(單鏈或雙鏈形式)。這些酶可從天然來源或從組織中或通過重組DNA方法得到，在DNA重組技術(shù)中，異種宿主有機(jī)體如細(xì)菌、酵母、真菌或哺乳動物類細(xì)胞編碼特定酶的基因，這一術(shù)語還包括(a)在EP(歐洲專利公開文本)-A-0155387和EP-A-0297882中公開的蛋白質(zhì)，這二篇文獻(xiàn)公開了具血纖維蛋白溶解活性的雜交蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包括二鏈蛋白酶中的一條鏈與另一個不同的二鏈蛋白酶的一條鏈連結(jié)，在雜交蛋白質(zhì)中至少有一條鏈來自有血纖維蛋白溶解活性的蛋白酶，這樣雜交蛋白質(zhì)具有對血纖維蛋白溶解活性重要的催化位點，它可被一個可移動的阻遏基團(tuán)阻遏;
(b)EP-A-0152736公開的蛋白質(zhì)結(jié)合物，如與可逆性阻遏的的血纖維蛋白溶酶連接的尿激酶;
(c)由EP-A-155388公開的血纖維蛋白溶解酶的衍生物，其中酶上的與血纖維蛋白溶解活性有關(guān)的催化位點被一種人體蛋白所阻遏，該蛋白通過可逆性連接基團(tuán)而附著在其上，例如尿激酶可逆地與人類血纖維蛋白溶酶活性中心連接;
(d)EP-A-0183503公開的結(jié)合物，包括一種血纖維蛋白溶解酶與一種水溶性多聚物通過一種可逆的連接基團(tuán)連接;及(e)基因工程得到衍生物，包括如EP-A-0201153、EP-A-0207589、WO(PCT出版物)-8604351、EP-0041766、EP-0213794、EP-0199574、EP-A-020334、EP-A0241208、EP-A-0241209、EP-A-0241210、EP-A-0233013、EP-A-290228、EP-A-292326、EP-A-0213794、EP-A-0231883、WO-8704722、EP-A-0242836、EP-A-0234051、EP-A-0253582、EP-A-0253241、WO-8604351、EP-A-0236040、EP-A-0200451、EP-A-0238304、EP-A-0225286、DE(西德出版物)-3537176、EP-A-0236289、WO-8601538、EP-0227462，AU(澳大利亞出版物)-08661804、WO-8703906和EP-0199574公開的自然產(chǎn)生血纖維蛋白溶酶原激活劑的突變蛋白質(zhì)，如des(cys51-asp87)t-PA。
在本發(fā)明的一個特定方面，血纖維蛋白溶酶原激活劑為一個雜交分子，如EP-A-0297882所述，它包括血纖維蛋白溶酶原的5個區(qū)域通過一氨基酸順序與t-PA或u-PA以B鏈連結(jié)，該B鏈上依次包括在殘基275和276之間的t-PA的切割位點，及t-PA的264半胱氨酸殘基，或者在殘基158至159之間的u-PA的切割位點，及uPA的148半胱氨酸殘基。
這些雜交分子的例子包括含有一和二鏈變異體的血纖維蛋白溶酶原1-544/t-PA262-527，lys78和glu1變異體，及其混合物;
包括一和二鏈變異體的血纖維蛋白溶酶原1-544/t-PA262-257(arg275→gln)，lys78和glu1變異體，及其混合物;
包括一和二鏈變異體的血纖維蛋白溶酶原1-514/t-PA262-257，lys78和glu1變異體，及其混合物;
包括一和二鏈變異體的t-PA1-50/t-PA 88-91/pro-gly-ser/血纖維蛋白溶酶原84-544/t-PA 262-527，gly-3，ser1和val4變異體，及其混合物;
包括一和二鏈變異體的t-PA1-91/pro-gly-ser/血纖維蛋白溶酶原84-544/t-PA 262-527，gly-3，ser1和val4變異體，及其混合物;或包括一和二鏈變異體的血纖維蛋白溶酶原1-546/u-PA 137-411，lys78和glu1變異體，及其混合物。
在一較佳實施例中，在聯(lián)合療法中用的溶血栓劑是一種被可逆阻遏的體內(nèi)血纖維蛋白溶解酶，具有在美國專利號4，285，932中Smith給的含意，即一種體內(nèi)血纖維蛋白溶解酶，其中對血纖維蛋白溶解活性重要的催化位點被一基團(tuán)所阻遏，該基團(tuán)可通過水解除去，水解率為水解的恒定準(zhǔn)一級速率在10-6/秒至10-3/秒之間，在等滲含水介質(zhì)中進(jìn)行，pH為7.4，溫度為37℃。
當(dāng)血纖維蛋白溶解酶為血纖維蛋白溶酶原激活劑，包括t-PA或尿激酶的絲氨酸蛋白酶區(qū)時，可移動的阻遏基團(tuán)的一個例子是2-氨基苯甲?；?，其中3或4位被一個鹵原子取代，也可任意地進(jìn)一步被一個或多個弱吸電子或供電子基團(tuán)取代，其中衍生物水解的恒定準(zhǔn)一級速率在6.0×10-5/秒至4.0×10-4/秒之間，它是在一種緩沖液系統(tǒng)中測定的，該系統(tǒng)含0.05M磷酸鈉，0.1M氯化鈉，0.01%v/v的去垢劑包括聚氧乙烯脫水山梨糖醇含油酸基化合物，其分子量約為1300，該緩沖液pH為7.4，溫度為37℃。
較佳的是，可逆阻遏的體內(nèi)血纖維蛋白溶解酶是一個鏈激酶和血纖維蛋白溶酶原的二元復(fù)合物，更佳的是無內(nèi)部鍵裂解的對甲氧苯甲酰鏈激酶/血纖維蛋白溶解酶原復(fù)合物，如美國專利號4，808，405所述，由Beecham Group Inc.以商標(biāo)EMINASE銷售(一般名稱為anistreplase，以后稱作APSAC，即甲氧苯甲酰化人類血纖維蛋白溶酶原-鏈激酶-激活劑復(fù)合物，參見如J.P.Monk and R.C.Heel，1987，Drugs 3425-49)。
在一較佳實施例中，在聯(lián)合療法中用的可溶性CR1組分由核苷酸載體編碼，該載體從下述組中選出，它包括pBSCR1c，pBSCR1s，pBM-CR1c，pBSCR1c/pTCSgpt及pBSCR1s/pTCSgpt，以及尤其是從上述的pBSCR1c/pTCSgpt制備的(見第12章)。
在聯(lián)合療法中所用的特定溶血栓劑(有給藥劑量和方法例子)如下鏈激酶 1.0-3.0兆單位 在30分鐘至3小時中APSAC 30單位 注射2-5分鐘t-PA(野生型) 50-150毫克 輸注6小時二鏈尿激酶 40-100毫克 輸注6小時(3-12兆單位)單鏈尿激酶 30-100毫克 輸注5小時雜交的血纖維蛋白 20-100毫克 注射或輸注溶酶原激活劑和?；苌?如EP-A-0155387)血纖維蛋白 10-100毫克 注射或輸注溶酶原激活劑的突變蛋白(如EP-A-0207589)6.例子人類C3b/C4b受體(CR1)的克隆及測序在此詳述的例子中，我們就5.5千堿基對(kb)的CR1編碼區(qū)的克隆及核苷酸順序進(jìn)行了描述(Klickstein，L.B.，et al.，1987，J.Exp.Med.1651095-1112)。
10個全長5.5kb的重疊的CR1 cDNA克隆從扁桃體庫中分離出，并對其整個或部分進(jìn)行測序。已經(jīng)鑒定了一個自該克隆5’端開始的、向下游延伸4.7kb到中止密碼子處的長的單獨的開放閱讀框架。它代表了預(yù)計為6kb的CR1F異型的編碼序列的80%。還確定了三個450個氨基酸的串聯(lián)的長同源重復(fù)(LHRs)。胰蛋白酶肽順序分析為CR1F異型存在第四個LHR提供了證據(jù)。各LHR之間的氨基酸的同一性范圍為自第一及第三個重復(fù)之間的70%，到第一個重復(fù)及第二個重復(fù)的氨基末端的250個氨基酸之間的99%。每個LHR包括七個60-70氨基酸的短一致重復(fù)(SCR)，類似于其它C3/C4結(jié)合蛋白，諸如補(bǔ)體受體2型、因子B及H、C4結(jié)合蛋白及C2的SCRs。有兩個另外的SCRs將LHRs與25個氨基酸的單一的跨膜區(qū)域相連接因而，CR1的F異型可能含有至少30個SCRs，其中的個23已被測序。預(yù)計每個SCR形成一個三環(huán)結(jié)構(gòu)，四個保守的半胱氨酸形成二硫橋。作為一種半堅固結(jié)構(gòu)，該線狀排列的30個SCR可自質(zhì)膜伸出1，140埃，并且可以促進(jìn)CR1與位于免疫復(fù)合物及微生物細(xì)胞壁的空隙中的C3b及C4b的作用。43個殘基的羧基末端胞質(zhì)區(qū)域含有一個六個氨基酸的序列，它與被蛋白激酶C磷酸化的表皮生長因子受體序列是同源的。
6.1.材料及方法6.1.1.CR1胰蛋白酶肽的分離及測序CR1是用連續(xù)的Matrex.紅A及YZ-1單克隆抗體親和層析法從洗過的人類紅細(xì)胞上提純的(參見Wong，W.W.，et al.，1985，J.Immunol.Methods 82303)。胰蛋白酶肽是用所述的連續(xù)梯度及常液反相HPLC制備并提純的(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)。胰蛋白酶肽的分析是用一個470A蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster city，CA)進(jìn)行的，而對每個降解循環(huán)的分析是通過采用一個120 PTH氨基酸分析儀(Applied Biosystems，Inc.)進(jìn)行的。
6.1.2.cDNA克隆及基因組克隆的分離如上所述，用人類扁桃體poly(A)+RNA在λgtll中構(gòu)建了一個cDNA庫(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)。用RNA印跡雜交法，使扁桃體(tonsil)供體對于CR1的F等位基因為同型接合的(id)。在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行cDNA選擇，使之在克隆之前包括2至7kb的組份。該庫的起始容量為每100ng cDNA有4.5×106重組子，該庫在大腸桿菌Y1088株中擴(kuò)增。該庫的篩選(Maniatis，T.，et.，al.，1982，Molecular Clonig，A Labora-tory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)采用CR1探針、CR1-1(ATCC保藏號第57330號(含CR1-1質(zhì)粒的大腸桿菌)、第57331號(純化的CR1-1DNA)及CR1-2(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)，其已通過缺口轉(zhuǎn)移進(jìn)行放射標(biāo)記達(dá)比活性為2-8×108cpm/μg。雜交過程是在50%甲酰胺(使用5×SSC(1×SSC15mM檸檬酸鈉，150mM氯化鈉))，在43℃下進(jìn)行的，而將濾紙在60℃下于0.2×SSC中洗滌，這些條件不能用于檢測CR2 cDNA克隆(參見Weis，J.J.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.835639)。在進(jìn)行限制酶圖譜及DNA序列分析之前先對陽性克隆進(jìn)行兩次噬菌斑純化。
用由Sau3 AI部分酶切人類白細(xì)胞DNA所產(chǎn)生的15-20kb片段在EMBL-3中組建一個基因組庫。最初的容量為1.2×106，并將該庫在大腸桿菌P2392株中進(jìn)行擴(kuò)增。該庫同樣用cDNA探針CR1-1及CR1-2進(jìn)行篩選(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)。
6.1.3DNA順序分析cDNA克隆的限制性片段被亞克隆入M13mp18或M13mp19并用雙脫氧核苷酸鏈終止法(參見Sanger F.，et al.，1977 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463)進(jìn)行測序。通過首先用核酸外切酶Ⅲ產(chǎn)生預(yù)定的缺失突變子的方法，全部地或部分地對一些克隆進(jìn)行測序(參見Henikoff，S.，1984，Gene 28351)。每個區(qū)域在兩條鏈上都進(jìn)行測序，在大多數(shù)情況下，每個區(qū)域在由兩個獨立分離的cD-NA克隆(圖2)所組建的M13亞克隆上進(jìn)行測序。在對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時，采用了威斯康星大學(xué)遺傳學(xué)計算機(jī)組設(shè)備。
6.2結(jié)果6.2.1 CR1基因的核苷酸序列用從CR1 cDNA克隆、λT8.3中得的CR1-1及CR1-2探針對經(jīng)大小選擇的扁桃體cDNA庫進(jìn)行篩選(Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)。從1.5×106個重組體中確定出15個陽性噬菌體，而其中的13個為不同的克隆。對其中10個進(jìn)行了限制酶圖譜分析，并用雙脫氧核苷酸鏈終止法進(jìn)行全部的或部分的測序。cDNA克隆根據(jù)其重疊序列的一致性(圖2)而排列成直線，并且已發(fā)現(xiàn)其長為5.5kb(圖3)。已經(jīng)確定自該cDNA克隆的5’端起一直延伸至下游的4.7kb處的一個終止密碼子為單一的長的開放閱讀框架。在該庫中CR1的編碼順序預(yù)計為6kb，依據(jù)為該非糖基化的受體的估計分子量為220，000(參見Wong，W.W.，et al.，1983，J.Clin Invest.72685)。因而這些克隆占了所估計的編碼序列的約80%。
克隆T49.1及T55.1在其5’端含有編碼序列，表明附加的5’編碼及非編碼序列仍待確定。在3’區(qū)域，重疊克隆T8.2、T43.1及T87.1含有由各個克隆中的相同序列所編碼的跨膜及細(xì)胞質(zhì)區(qū)。延伸到最遠(yuǎn)3’端的克隆T8.2含有一個無poly(A)序列的807個堿基對的不翻譯序列，與克隆T6.1及T55.1中所發(fā)現(xiàn)的序列比較，克隆T8.3在1，406-1，497之間缺失91bp的核苷酸，而克隆T40.1在1，498-1，507之間缺失9-bp的核苷酸。這些缺失出現(xiàn)在具有與5’拼接位點同源序列的區(qū)域，可能表示這是mRNA中的拼接錯誤?？寺49.1及T55.1在開放閱讀框架的147及148核苷酸之間含有一個110bp的插入片段(圖3)。該序列據(jù)判斷為內(nèi)含子的一部分，因為它不與扁桃體poly(A)+RNA印跡雜交，它含有一個5’拼接位點(參見Breathnach，R.，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.754853)(圖3)，它在CR1基因組克隆中位于cDNA序列的側(cè)翼，而且，它還移動了讀碼?？寺9.4在3’端含有0.88kb的插入順序，該插入順序不與扁桃體poly(A)+RNA印跡雜交。
6.2.2 CR1的核苷酸及氨基酸順序分析CR1的核苷酸順序(圖3)的點陣(Dot)分析揭示出有兩種類型的內(nèi)在同源性(圖4)。第一類型的內(nèi)在同源性如粗黑的實線所示，在1.35kb中存在三個正向的高度同源的串聯(lián)重復(fù)。這些核苷酸順序編碼CR1的長同源重復(fù)(LHRs)。第二類型的重復(fù)由平行的虛線所示，指明具有較低同源性的區(qū)域。每隔190-210個核苷酸這些序列總要出現(xiàn)，并且編碼CR1的短一致重復(fù)(SCRs)。
從cDNA順序推斷的氨基酸序列如圖5所示，這三個LHR分別稱為LHR-B、LHR-C及LHR-D，它們在圖中被排成直線以示其同源性。LHR-B自殘基1延伸至殘基438，LHR-C相應(yīng)于殘基439-891，而LHR-D自殘基892延伸到殘基1，341。LHR-C的殘基451-69499%相同于LHR-B的殘基1-244，然而與LHR-D相應(yīng)殘基只有61%相同。相反，LHR-C的殘基695-891 91%相同于LHR-D的殘基1，148-1，341，而與LHR-B相應(yīng)區(qū)域只有76%相同。由此看來，LHR-C為一個雜合體，包括的序列與LHR-B的前半部，及LHR-D的后半部非常同源。
LHRs后接兩個不重復(fù)的SCR，即為一個25殘基的疏水片段及一個與該SCR無序列同源性的43個氨基酸COOH末端區(qū)域(圖5)。
CR1編碼序列的5’的1.3kb的片段為第四個LHR，即LHR-A(參見以上的圖1及以下的第七章)。該結(jié)果由紅細(xì)胞CR1的胰蛋白酶水解肽的分析來支持。十個胰蛋白酶水解肽具有與來自于cDNA克隆的氨基酸序列相同的序列(表Ⅰ)表Ⅰ
發(fā)現(xiàn)于衍生的氨基酸序列＊中的CR1胰蛋白酶水解肽肽號碼 氨基酸序列 在衍生序列中殘基數(shù)66 VDFVCDEGFQLKGS-A 330-34528 GAASL-QG-WSPEAP 732-749，1，185-1，20249 -IFC-NP-AIL 805-826，1，258-1，27935 CQALNKWEPELPSCSR 228-243，678-69341c DKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLR 260-28134b AV-YTCDPHPDRGTSFDLIGESTIR 393-41744d VCQPPPEILHG 694-704，1，147-1，15754d VFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQ 152-179，602-62957b YECRPEYYGRPFS 19-31，469-48139b LIGHSSAECILSGNAA 85-100＊發(fā)現(xiàn)于衍生的氨基酸序列中的來自人類紅細(xì)胞CR1的胰蛋白酶水解肽。
列于右手一欄內(nèi)的數(shù)字范圍表明該肽位于衍生氨基酸序列中的位子。在肽66、28及49中的每個破折線表明在那一輪中已確定多個殘基。而在肽34b中的破折線表明在那一輪中已確定無殘基。
每個LHR包括七個60-70氨基酸SCR，它們是C3及C4結(jié)合蛋白(C4bp)族的特征(圖6A)。通過在線性排列的序列(圖6A)中引入空間，可以觀察到CR1的23個SCRs中最大的同源性。概括起來在每個重復(fù)中平均65個殘基中共有29個保守。有六個殘基存在于所有的SCRs中四個半胱氨酸位于相似的相關(guān)位置上，這一點表明它們各自涉及關(guān)鍵的二硫鍵，及第二個半胱氨酸后面的色氨酸及第二個甘氨酸。(圖6A)。采用周氏(chou)及范斯曼(Fasman)的規(guī)則(參見chou，P.Y.and Fasman，G.D.，1974，Biochemistry 13222)對那些恒定的半胱氨酸之間順序的二級結(jié)構(gòu)的分析，作出的預(yù)言為，它具有較高的形成β-折疊的幾率而具有較低的形成α-螺旋的幾率。對兩種CR1基因組克隆，即2.38(圖6B)及2.46克隆的序列分析表明，SCR-14(圖6A)是由一個單一的外顯子編碼的，而SCR-23的COOH的末端相應(yīng)于一個外顯子的末端。因而，CR1的SCRs可以被不相連的外顯子編碼，正如在B因子的SCRs(參見Campbell，R.D.and Bentley，D.R.，1985，Immunol.Rev.8719)及在IL-2-R的SCRs(參見Leonard，W.J.，et，al.，1985，Science 230633)所表現(xiàn)的那樣。
將CR1SCRs的相同序列與具有該特征性結(jié)構(gòu)(圖7)的超家族(Superfamily)的其它成員的SCRs相比較。這類成員不僅包括具有C3/C4結(jié)合功能的蛋白，如CR2(參見Weis，J.J.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.835639)、C4bp(參見Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230133)、H因子(參見Kristensen，T.，et al.，1986，J.Immunol.1363407)、B因子(參見Morley，B.J.and Campbell，R.D.，1984，EMBO J.3153;Mole，J.E.，et al.，1984，J.Biol.Chem.2593407)及C2(參見Bentley.D.R.and Porter，R.R.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.811212;Gagnon，J.，1984，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.306301)，而且還包括那些還不知其有該功能的蛋白，諸如白細(xì)胞介素(interleukin)2受體(參見Leonard，W.J.，et.，al.，1985，Science 230633)、β2-糖蛋白Ⅰ(參見Lozier，J.，J.et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640)、Clr、(參見Leytus，S.P.，et al.，1986，Biochemistry 254855)、觸珠蛋白α鏈(參見Kurosky，A.，et al.，1980，Proc.Natl.A-cad.Sci.U.S.A.773388)，以及ⅩⅢb因子(參見Ichinose，A.，etal.，1986，Biochemistry 254633)。除了觸珠蛋白缺乏第三個半胱氨酸外，半胱氨酸殘基在所有蛋白的SCRs中都不變化。色氨酸同樣也保持不變，但β2-糖蛋白Ⅰ中的第五個SCR及ⅩⅢb因子中的兩個重復(fù)為例外。其它雖保守但并不在每一個SCR中都存在的殘基趨向于聚集在半胱氨酸周圍。在B因子及C2中僅有一個游離的巰基(參見Christie，D.L.and Gagnon，J.，1982，Biochem.J.201555;Parkes，C.，et al.，1983，Biochem.J.213201)而在β-糖蛋白Ⅰ的SCRs中第一個半胱氨酸與第三個形成二硫鍵，而第二個與第四個形成二硫鍵(參見Lozier，J.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640)。
在衍生的CR1的氨基酸序列中，存在17個N-連接寡糖的潛在位點，而且它們均位于細(xì)胞外區(qū)域(圖6A)。在存在與不存在衣霉素的情況下合成的CR1在分子量上的差異(參見Lublin，D.M.，et al.，1986，J.Biol.Chem.2615736)及對氨基葡萄糖含量的分析(參見Sim，R.B.，1985，Biochem.J.232883)表明僅有6-8N連接復(fù)合寡糖存在，說明潛在位點并未全部用上。例如，肽41C中已確定了衍生的氨基酸序列(圖5)的第263殘基位上為天冬酰胺(表Ⅰ)，表明在該位點不存在糖基化作用。相反，在肽34b上未經(jīng)確定的氨基酸也許在第395殘基上對應(yīng)于一個糖基化的天冬酰胺。
在5.5kb cDNA上的已確定的唯一的不重復(fù)的CR1序列位于COOH末端區(qū)域。對于該區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)的分析確定了有一個單一的25個殘基的推定的跨膜片段，它具有很強(qiáng)的疏水性，從而具有很高的形成α-螺旋的潛力(圖5)。該序列之后緊跟著四個帶正電的殘基，這是許多膜蛋白的特征。推測的CR1的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域包括43個殘基，含有一個六個氨基酸的序列，即VHPRTL，該序列與作為在表皮生長因子(EGF)受體及erb B致癌基因產(chǎn)物的蛋白激酶C的磷酸化作用位點的VRKRTL有同源性(參見Hunter，T.，et al.，1984，Nature 311480;Davis，R.J.and Czech，M.P.，1985，Proc.Natl.A-cad.Sci.U.S.A.821974)。扁桃體CR1的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域中不存在酪氨酸殘基。
6.3討論通過對重疊cDNA克隆進(jìn)行測序，已經(jīng)獲得CR1的F異型初級結(jié)構(gòu)的約80%。在這個分析中發(fā)現(xiàn)的最為不尋常的CR1結(jié)構(gòu)特點為，存在450個氨基酸的正向串聯(lián)LHRs，預(yù)計有四個出現(xiàn)在長約2，000殘基的多肽鏈CR1的F異型中(參見Wong，W.W.，et al.，1983 J.Clin.Invest.72685;Sim，R.B.，1985，Biochem.J.232883)。這些LHRs中的三個已被克隆并測序，而其中的第四個存在的依據(jù)已由胰蛋白酶肽的分析而提供。每個LHR含有七個SCRs，它們是其它C3/C4連接蛋白的基本結(jié)構(gòu)成分。在每個SCR中都有四個保守的半胱氨酸，第1與第3及第2與第4個半胱氨酸之間可能形成二硫鍵(參見Lozier，J.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640)，還有，保守的氨基酸諸如脯氨酸、甘氨酸及天冬酰胺常常出現(xiàn)于β-折疊中(參見Rose，G.D.，et al.，1985，Adv.Protein Chem.371)，所有這些情況導(dǎo)致這樣一個推斷，即SCR是借二硫鍵維持而形成的一個三環(huán)結(jié)構(gòu)(圖8)。對半胱氨酸的這一作用的推測，通過以下的發(fā)現(xiàn)得到支持，即經(jīng)胰蛋白酶溫和處理的CR1(參見Sim，R.B.，1985，Biochem.J.232883)及H因子(參見Sim，R.B.and Di Scipio，R.G.，1982，Biochem.J.205285)當(dāng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)在非還原條件下進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)它們作為一個完整的分子進(jìn)行遷移，而當(dāng)還原之后則轉(zhuǎn)化成多個胰蛋白酶片段。
預(yù)計串聯(lián)的重復(fù)的SCRs系列將形成一個延長的結(jié)構(gòu)(圖8)，與對H因子及人類C4bp的各個亞基的預(yù)計一樣(參見Sim.R.B、and Di Scipio，R.G.，1982 Biochem.J.205285;Whaley，K.and Ruddy，S.，1976 J.Exp.Med.1441147;Dahlback，B.，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.803461)。對于C4bp亞基進(jìn)行的電子顯微鏡的研究表明其大小為300×30埃(參見Dahlback，B.et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.803461)。因為每個亞基是由8個SCRs組成的(參見Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230133)，一個單獨的SCR的大小計為38×30埃。假設(shè)CR1的各個SCR有相近的大小并且F異型具有30個SCR，受體可以自細(xì)胞膜向外伸展至1，140埃的距離。與對CR1結(jié)構(gòu)的預(yù)言相一致的是早先的發(fā)現(xiàn)，即結(jié)合于中性粒細(xì)胞上的CR1的鐵蛋白標(biāo)記抗體常常與質(zhì)膜的外層小葉相距500埃(參見Abrahamson，D.R.andFearon，D.T.，1983，Lab.Invest.48162)。CR1的這種延伸的結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)載有受體的細(xì)胞與共價地結(jié)合于相對地不易接近的免疫復(fù)合物及微生物細(xì)胞表面上的位點的C3b發(fā)生作用。
SCR是主要的也許是唯一的CR1的細(xì)胞質(zhì)外的成分的發(fā)現(xiàn)為受體與H因子及C4bp的緊密關(guān)系提供了結(jié)構(gòu)方面的依據(jù)，H因子和C4bp這兩個原生質(zhì)蛋白是由大量的SCR或主要由SCR組成的(參見Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230133，Kristensen，T.，et al.，1986，J.Immunol.1363407)。CR1最初是作為一個具有類H因子活性的紅細(xì)胞膜蛋白用去垢劑溶解法分離的(參見Fearon，D.T.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.765867)，隨后發(fā)現(xiàn)當(dāng)其位于原生質(zhì)膜上時具有H因子及C4bp的調(diào)節(jié)功能(參見Lida，K.and Nussenzweig V.，1981，J.Exp.Med.1531138)。通過對CR1、H因子、及C4bp的結(jié)構(gòu)多態(tài)性的遺傳分析，表明編碼這三種蛋白的基因是相連的(參見deCordoba，R.，et al.，1985，J.Exp.Med.1611189)，最近，通過原位(in situ)雜交作用及體細(xì)胞雜合體的分析已經(jīng)顯示出該連接組及結(jié)構(gòu)上相關(guān)的受體CR2的位置位于1號染色體長臂q32帶(參見Weis，J.H.，et al.，1987，J.Immunol.138312)。在本研究之前，這些蛋白結(jié)構(gòu)上關(guān)系的依據(jù)僅是這些蛋白質(zhì)的氨基酸組成明顯相似(參見Wong，W.W.，et al.，1985，J.Immunol.Methods 82303)。因而，本發(fā)明在CR1中至少有23個SCR的發(fā)現(xiàn)為受體與具有類似功能的蛋白，H因子及C4bp之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系(參見Chung，L.P.，et al.，1985，Biochem.J.230133;Kristensen，T.，et al.，1986，J.Immunol.1363407)、和為受體與B因子及C2的Ba及C2b片段之間的關(guān)系提供了直接而正式的證據(jù)，B因子及C2分別為與C3b和C4b形成酶復(fù)合物的成分(參見Morley，B.J.andCampbell，R.D.，1984，EMBOJ.3153;Mole，J.E.，et al.，1984，J.Biol.Chem.2593407Bentley，D.R.andPorter，R.R.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.811212;Gagnon，J.，1984，Philos，Trans.R.Soc.Lond.BBiol.Sci.306301)。然而，SCR也同樣可見于幾個非補(bǔ)體蛋白中(參見Campbell，R.D.，andBently，D.R.，1985，Immunol.Rev.8719;Lozier，J.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813640;Leytus，S.P.，et al.，1986，Biochemistry 254855;Kurosky，A.，et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.773388;Ichinose，A.，et al.，1986，Biochemistry 254633)(圖7)，這表明它并不一定代表一個C3/C4結(jié)合結(jié)構(gòu)。
在那些具有SCR的蛋白中，CR1在將該種基本結(jié)構(gòu)及遺傳單位組織到較高的有序的LHR的結(jié)構(gòu)單位方面是獨特的。對于與S異型表達(dá)相關(guān)的基因組DNA的14.5kb BamHI片段的分析表明，在CR1中至少有一個重復(fù)基因組單位是一個含有編碼至少五個SCR的外顯子及與其鄰側(cè)相接的內(nèi)含子的延伸了的DNA片段(參見Wong，W.W.，et al.，1986，J.Exp.Med.1641531)。這類研究還表明與F等位基因中存在的數(shù)目相比，S等位基因含有這類基因組單位的額外拷貝。這一觀察連同胰蛋白酶肽圖譜的研究(參見Nickells，M.W.，et al.，1986 Mol.Immunol.23661)及LHR代表了一個40-50KD的肽這一發(fā)現(xiàn)，使我們可以預(yù)言，相對于估計在F異型(分子量為250，000道爾頓)中有四個LHR，而在S異型(290KD)中具有一個附加的LHR。
除了提供重復(fù)方面的依據(jù)之外，LHRs的序列還表明CR1基因內(nèi)存在著轉(zhuǎn)變。LHR-B與LHR-D在全長范圍內(nèi)有67%的同源性，而LHR-C與LHR-B在NH末端四個SCR中有99%的同源性，與LHR-D在COOH末端三個SCR中有91%的同源性。在這個雜合LHR起源時這樣的結(jié)構(gòu)不可能通過相同親代等位基因之間的一次單一的重組而引起，而是雜合的LHR可能通過基因轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生(參見Atchison，M.and Adesnik，M.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.832300)，即一個LHR-C前體中的序列被存在于LHB-B或LHR-D中的序列取代了。三個LHRs中近乎完全相同的和精確的線性排列的同源順序(圖5)同樣可能采用一個涉及基因轉(zhuǎn)變的機(jī)制來維系。對編碼該LHRs的CR1基因的那些片段的插入順序之間的同源性程度進(jìn)行分析，可以確定是基因轉(zhuǎn)變還是基于功能性限制的選擇嚴(yán)格地限制了順序的差異。
盡管原先的研究表明CR1為單價的(參見Wilson，J.G.，et al.，1982，N.Engl.J.Med.307981)，而每一個LHR可能代表一個單獨的C3b/C4b結(jié)合區(qū)域，從而使受體成為多價的，并且適應(yīng)于與載有多個C3b及C4b分子的復(fù)合物結(jié)合?；蛘?，各種LHR能夠分別地連結(jié)C3b及C4b，(見下文，第9章)從而為在CR1中的H因子及C4bp結(jié)合活性提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。結(jié)果，如假設(shè)的結(jié)構(gòu)模型(圖8)所示，CR1的LHR可以代表使CR1自質(zhì)膜向外延伸的結(jié)構(gòu)區(qū)域，以及正如H因子中所發(fā)現(xiàn)的，NH2末端區(qū)域的SCR結(jié)合C3b及C4b(參見Sim，R.B.and Di Scipio，R.G.，1982，Biochem.J.205285;Alsenz，J.，et al.，1984，Biochem.J.224389)。
用佛波醇酯激活蛋白質(zhì)激酶C誘導(dǎo)了嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞(參見Changelian，P.S.and Fearon，D.T.，1986，J.Exp.Med.163101)中的CR1的磷酸化作用，在43個氨基酸的CR1細(xì)胞質(zhì)區(qū)域具有一個與在表皮生長因子受體中被蛋白激酶C磷酸化的位點同源的序列(參見Hunger，T.，et al.，1984，Nature 311480;Davis，R.J.and Czech，M.P.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.821974)。然而，存在于扁桃體庫中三個獨立克隆中的這個細(xì)胞質(zhì)順序，最有可能是在蛋白激酶C激活后未被磷酸化的B細(xì)胞CR1(參見Changelian，P.S.and Fearon，D.T.，1986，J.Exp.Med.163101)。
7.例子含有第四個長同源重復(fù)的CR1 5’DNA序列對于CR1的部分cDNA順序的分析顯示了一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中有三個450個氨基酸的LHR，即LHR-B、LHR-C、LHR-D，它們各自含有七個具有C3/C4結(jié)合蛋白特征的65個氨基酸的一致短重復(fù)(SCR)(參見上文第6章節(jié))。在此所述的例子中，我們將通過對5’cDNA克隆測序來對第四個氨基末端LHR，即LHR-A的克隆核苷酸序列進(jìn)行描述(參見Klickstein，L.B.，et al.，1987，Complement 4180)。對LHR-A的分析顯示，在五個3’SCR中它與LHR-B的同源性有99%，而在兩個5’SCR中僅有61%的同源性。
7.1材料及方法7.1.1 cDNA庫的構(gòu)建一個選擇性預(yù)備的cDNA庫，λHH，是用自DMSO誘導(dǎo)(induced)細(xì)胞中純化的3μg poly(A)+RNA構(gòu)建的(有下列修飾)(參見Chirgwin，J.M.et al.，1979，Biochemstry 185290;Aviv，H.and Leder，P.，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.691408;Ausubel，F(xiàn).M.，et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆ Sons，NewYork)。一個LK35.1，35-mer寡核苷酸，即5’-TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-3’用以代替寡(dT)12-18，并且在第二鏈合成中加入40μCiαP-dCTP。三分之一的cDNA被克隆進(jìn)入λgt11，并且如上文的第6.1.2所述自人類扁桃體poly(A)+RNA中構(gòu)建了一個cDNA庫。獲得了750，000個獨立的重組子。
7.1.2克隆的分離、探針及DNA順序分析用于篩選cDNA庫的探針為CR1-1(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827711)(ATCC accession no.57331)、CR-2(Wong，W.W.，et al.，supra)、CR1-4(參見Wong，W.W.et al.，1986，J.Exp.Med.1641531)、及CR1-18，及一個252bp Sau 3AI片段，它來自cDNA克隆λH3.1的相應(yīng)于圖1中核苷酸101-352的0.5kb EcoRI片段。在高度嚴(yán)格的條件下，CR1-18僅與編碼LHR-A的NH2末端SCR或者信號肽的cDNA克隆雜交。在將片段亞克隆入M13mp18及M13mp19之后(參見Yanisch-Perron，C.et al.，1985，Gene 28351)，通過雙脫氧核苷酸技術(shù)(參見Sanger，F(xiàn).，et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463)對cDNA克隆插入部分進(jìn)行測序。
7.2結(jié)果一個特別預(yù)備的λgt11 cDNA庫，即λHH含有7.5×105個重組子，是從DMSO誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞的poly(A)+RNA合成的cD-NA。這些細(xì)胞僅僅表達(dá)那些預(yù)計有四個LHR(參見Lapata，M.A.，et al.，1984，Nucl.Acids Res.125707)的CR1F異型(參見Lublin，D.M.，et al.，1986，J.Biol.Chem.2615736)。引物，LK35.1，為一個反意35-mer，相應(yīng)于圖3所示的CR1部分的cDNA順序的896-930核苷酸部分。這個寡核苷酸顯示在反轉(zhuǎn)錄條件下可與LHR-B、LHR-C及LHR-D雜交。在用CR1-1及CR1-4的混合CR1 cDNA探針進(jìn)行篩選的未擴(kuò)增的含有3.8×105個重組噬菌體的平板上確定了250個陽性克隆。挑出38個陽性克隆并進(jìn)行噬菌斑提純。來自這些克隆的經(jīng)EcoRI酶切的DNA的Southern印跡是用23-mer寡核苷酸，KS23.1，即5’-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG 3’，也就是相應(yīng)于圖3的部分CR1 cDNA序列的核苷酸763-785來進(jìn)行篩選。該探針在高度嚴(yán)格的條件下，僅在編碼LHR-B的順序的一個位點進(jìn)行雜交，而不與LHR-C或LHR-D的編碼序列雜交?？寺ˇ薍7.1(圖9)的插入部分含有三個EcoRI片段，1.0kb、0.9kb及0.4kb，其中兩較大的片段與KS23.1雜交，這一點表明該克隆含有編碼LHR-A的3’的七分之五及LHR-B的全部順序。這一發(fā)現(xiàn)證實了LHR-A是與LHR-B是高度同源的?？寺ˇ薍3.1(圖9)含有一個單獨的KS23.1-陽性的1.0kb EcoRI片段，及一個在高度嚴(yán)格的條件下與CR1-4有弱雜交的5’0.5kb的片段。據(jù)認(rèn)為該克隆含有構(gòu)成完全LHR-A的額外的5’序列(5’Sequence completingLHR-A)，包括SCRs-1、SCRs-2及0.1kb的上游順序。所有與CR1-1雜交的剩余的36個克隆，均不能用探針CR1-18檢測到，該探針為不與編碼LHR-B、-C或-D的序列雜交的來自克隆λH3.1的0.5kb EcoRI片段的252bp的Sau 3AI片段。
λH3.1的DNA序列分析揭示了開放閱讀框架持續(xù)至cDNA的5’末端，這表明該克隆不延續(xù)至翻譯起始位點。因而，用探針CR1-18重新篩選cDNA庫，即λHH及λS2T，并分別找到了一個克隆λH10.3及λT109.1。這些與CR1-18雜交的克隆的EcoRI片段和來自克隆λH3.1及λH7.1的插入部分一樣被進(jìn)行測序，該組成的序列于圖1中，在圖1中數(shù)碼為1531號之后的核苷酸為圖3中的核苷酸＃1。來自HL-60的cDNA克隆的重疊序列與扁桃體庫是相同的。
緊靠LHR-A的上游處的克隆λH10.3及λT109.1含有相同的編碼41個氨基酸，包括一個與ATG相配的被認(rèn)為是真核生物翻譯起始位點的(圖10)NNA/GNNATGG一致順序(參見Kozak，M.，1986，Cell 44283)的推定的疏水前導(dǎo)序列(參見VonHeijne，G.，1986，Nucl.Acids Res.144683)。位于所選的ATG上游六個密碼子處，且在一個框架內(nèi)終止密碼子下游處的第二個ATG與該一致序列的匹配很差。CR1的該前導(dǎo)序列的頭三個氨基酸為MGA，與所報導(dǎo)的CR2的一樣。這兩個克隆的序列偏離ATG的上游，而來自克隆λ10.3的序列據(jù)信代表了一個插入序列的一部分，這已在上文的第6章節(jié)中對CR1 cDNA的其它克隆進(jìn)行了敘述。
預(yù)計信號肽的酶切(參見Von Heijne，G.，1986，Nucl.Acids Res.144683)將發(fā)生于gly-46及gly-47之間，這一點表明，被阻斷(blocked)的CR1 NH-末端(參見Wong.，W.W.，et al.，1985，J.Immunol.Methods 82303;Holeis，V.M.，et al.，1986，Complement 363)可能是由于吡咯烷酮酰胺的存在引起的。這些克隆中LHR-ANH2-末端的頭兩個SCR與LHR-B的相應(yīng)區(qū)域僅有61%的相同，而LHR-A的SCRs3-7與LHR-B的相應(yīng)SCRs(圖10)有99%的相同。將LHR-A與LHR-C相比較顯示，僅僅是各自的第三及第四個SCRs才有較高的同源性(99%相同)。LHR-A及LHR-D僅有68%整體同一性，在每個LHR的第六個SCR之間的最高同一性為81%。因而，CR1 5’cDNA序列的完全測定表明，F(xiàn)異型由2039個氨基酸組成，包括41個氨基酸信號肽、四個各有七個SCRs的LHRs、兩個額外的COOH-末端SCRs、一個25殘基的跨膜區(qū)及一個43個氨基酸的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。有25個潛在的N-連接的糖基化位點。
7.3討論CR1的F異型的信號肽及NH2-末端的初級結(jié)構(gòu)，已通過對5’cDNA克隆的分離及測序而推斷出來。CR1序列的高度重復(fù)的特性，使之成為制備及鑒定編碼受體該區(qū)域的cDNA克隆的方法發(fā)展的關(guān)鍵。以一個已知在反轉(zhuǎn)錄條件與LHR-B、-C及-D雜交的35-mer寡核苷酸為引物，制備一個cDNA庫。該引物可能也會與被預(yù)測與LHR-B具有高度的同源性的LHR-A發(fā)生雜交(參見上文第6章節(jié))。合適的cDNA克隆是通過采用另一個在嚴(yán)格條件下僅與LHR-B雜交的寡核苷酸，KS23.1，從而使找到5’cDNA克隆的幾率提高的方法來檢出的。發(fā)現(xiàn)兩個克隆差不多包括了CR1的所有的殘余順序，其中一個Sau3AI片段，CR1-18，具有十分獨特的順序可用于鑒定其它5’克隆(圖9，10)。
一個來自LHR-A5’區(qū)域的250bp的探針，CR1-18，在嚴(yán)格的條件下不僅與7.9kb及9.2kb的CR1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交，而且與人類扁桃體RNA的2kb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交。這種交叉雜交mRNA未在采用來自其它的LHRs的CR1 cDNA探針時發(fā)現(xiàn)，也未在來自二甲基亞砜誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞及HSB-2T類淋巴母細(xì)胞的northern印跡中發(fā)現(xiàn)。因而，CR1含有與兩種附加的B細(xì)胞蛋白同源的序列，其一種是這種新確定的mRNA編碼的，以及CR2。
8.例子人類CR1重組子的表達(dá)如上文所述，人類CR1 cDNA克隆已被分離，其長為7.0kb，包含一個編碼2039氨基酸(圖1)的開放閱讀框架。假設(shè)的受體的前體形式包括一個41個氨基酸的信號肽、四個450個氨基酸的各含七個短一致重復(fù)(SCRs)的長同源重復(fù)(LHRS)、兩個65個氨基酸的COOH末端SCRs、一個25個氨基酸的跨膜區(qū)域，以及一個43個氨基酸的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。因而，該CR1F異型含有30個SCRs。NH-末端LHR(LHR-A)(見上文的第7章節(jié))在頭兩個SCR中與LHR-B的相應(yīng)區(qū)域有61%的同源性，而在COOH-末端五個SCRs中有99%的同源性。八個CR1 cDNA克隆的限制性片段，拼接而形成一個全長的6.9kb的結(jié)構(gòu)，并且置于小鼠金屬硫因啟動子的下游或巨大細(xì)胞病毒啟動子的下游，隨后轉(zhuǎn)染入L(小鼠)細(xì)胞或者COS(猴)細(xì)胞中。重組細(xì)胞表面CR1用間接放射免疫測試法及免疫熒光法來檢測。在僅用親代載體(CR1-)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上未檢測出抗原。用抗-CR1單克隆抗體對轉(zhuǎn)染的、表面用125Ⅰ標(biāo)記的COS(猴)細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀測試，以及用非還原的、十二烷基磺酸鹽(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳加以分析，得出一種與人類紅細(xì)胞的F異型共遷移的190，000道爾頓的區(qū)帶，對于正確分子量的重組CR1抗原的表達(dá)(參見Klick-stein，L.B.，et al.，1988，F(xiàn)ASEBJ.2A1833)為該cDNA含有人類CR1完整的編碼序列提供了證據(jù)。
8.1含有完整的CR1編碼序列的質(zhì)粒pBSABCD的構(gòu)建我們在此描述一個編碼全長(SCRs1-30)CR1蛋白的質(zhì)粒載體pBSABCD的構(gòu)建。
將來自cDNA克隆λT8.2的2.3kb插入部分(參見Klickstein，L.B.，et al.，1987，J，Exp.Med，165105;see Section 6，supra)作為一個EcoRI片段亞克隆至pUC18中，以使5’末端靠近質(zhì)粒多聚接頭中的Hind Ⅲ位點。這質(zhì)粒稱為p188.2。p188.2用ApaI及Hind Ⅲ酶切，對較大的4.7kb的含有CR1序列自SCR26至3’非翻譯區(qū)及載體序列的片段進(jìn)行膠提純。
來自cDNA克隆λT50.1(參見Klickstein，L.B.，et al，1987，J.Exp.Med.1651095 see Section 6，supra)的插入部分作為一個EcoRI片段亞克隆入M13mp18。該噬菌體稱為18R50.1。來自該克隆的復(fù)制型DNA用Hind Ⅲ及ApaI進(jìn)行酶切，分離其中含有CR1 SCRs18-25的1.45kb的片段，并連接至來自p188.2的4.7kb的片段上，再將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。該質(zhì)粒稱為p8.250.1。
將來自cDNA克隆λT8.3(參見Wong，W.W.，et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A227711)的0.75kb及0.93kb的EcoRI片段亞克隆入質(zhì)粒pBR327。這些亞克隆分別稱為pCR1-1及pCR1-2，它們分別含有11-14SCRs及17-21SCRs。EcoRI插入部分被各自從中提純出來。用SamI酶切0.75kb pCR1-1片段，隨后將其連接到用EcoRI及SmaI切開的pUC18DNA上去。分離出一種具有0.5kb的相應(yīng)于SCRs12-14的插入部分的亞克隆p181-1.1。用Hind Ⅲ酶切0.93kb pCR1-2的片段，并連接到用EcoRI及Hind Ⅲ切開的pUC19上，并且分離出一種含有0.27kb的包括SCR17的插入部分的亞克隆p191-2.1。
用EcoRI酶切cDNA克隆λT6.1(參見上文第6章節(jié)、Klickstein，L.B.，et al.，1987，J.Exp.Med.1651095;Wong，W，W，et al.，1987，J.Exp.Med.1641531)并將相應(yīng)于CR1 SCR15及16的0.37kb的片段亞克隆入pBR322。該克隆稱為pCR1-4。用EcoRI及ScaI酶切克隆p181-1.1，并且分離出1.4kb的片段。用EcoRI及ScaI酶切克隆p191-2.1(參見Klickstein，L.B.，et al.，1987，J.Exp.Med.，1651095;see Section 6，supra)，分離2.0kb的片段，并連結(jié)到來自p181-1.1的1.4kb片段上，隨后將混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。獲得的質(zhì)粒稱為p1-11-2。質(zhì)粒p1-11-2用EcoRI進(jìn)行酶切，通過連接插入來自pCR1-4的0.37kb的插入片段。將獲得的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
選擇一個含有0.39kb的BamHI-Hind Ⅲ片段的亞克隆。該質(zhì)粒稱為p142，含有CR1 SCRs12-17。將來自p8.250.1的3.5kb的EcoRI-Hind Ⅲ插入片段轉(zhuǎn)移到pGEM3b中。該質(zhì)粒稱為pG8.250.1。提純來自p142的1.2kb Hind Ⅲ片段，并且連接到已用Hind Ⅲ切開的pG8.250.1上。選擇一個含有2.4kb的PstI-ApaI插入部分的亞克隆，隨后選擇正確的方向。該質(zhì)粒稱為pCD，含有自SCR12直至3’端的CR1序列。
用PstI切斷cDNA克隆λ5’7.1(參見Klickstein，L.B.，et al，Sept.1987，Complement 4180;see Section 7，supra)，隨后分離出相應(yīng)于SCRs6-12的1.35kb的片段，再連接到PstI酶切的pCD上。轉(zhuǎn)化該混合物，隨后選擇一個含有1.35kb及1.1kb Hind Ⅲ片段的亞克隆。該克隆稱為pBCD。
用EcoRI酶切cDNA克隆λ5’3.1(參見Klickstein，L.B.，et al，1987，Complement 4180;see Section 7，supra)并將其連接到EcoRI酶切的pUC18上。分離出一個含有1.0kb相應(yīng)于SCRs3-7的插入部分(該插入部分用凝膠提純)的亞克隆p3.11-1。用EcoRI酶切cD-NA克隆λ5’10.3(參見Klickstein，L.B.，et al，1987，Complement 4180;see Section 7，supra)，并將含有SCRs1及2的0.63kb插入部分亞克隆入pUC18。該克隆稱為p10.3.5。質(zhì)粒p10.3.5用EcoRI進(jìn)行部分酶切，并分離出一個相應(yīng)于線性質(zhì)粒的3.4kb的片段，隨后，連接到來自p3.11-1的1kb的片段上。在正確的插入位點及方向上含有一個1.3kb的PstI片段的亞克隆pLA被挑出。
用EcoRI酶切cDNA克隆λT109.4(參見Klickstein，L.B.，et al，1987，Complement 4180;see Section 7，supra)，并亞克隆入pUC18。選擇一個含有相應(yīng)于5’非翻譯區(qū)直至前導(dǎo)序列及SCRs1及2的0.55kb的EcoRI片段的亞克隆。用PstI及BspM Ⅱ酶切質(zhì)粒p109.4，并且分離出一個含有載體、前導(dǎo)序列及SCR1的3.0kb片段。將該片段連接到含有SCRs2-5的來自pLA的0.81kbPstI-BspM Ⅱ片段上。該新的質(zhì)粒稱為pNLA。質(zhì)粒pNLA先用EcoRI部分酶切再用PstI完全酶切，將一個含有自前導(dǎo)序列直至SCR5的CR1序列的1.1kb的EcoRI-PstI片段分離出來，并連到pBluescript KS+上(Stratagene，SanDiego，CA)，以在cDNA的5’端上放置一個XhoI位點。該質(zhì)粒稱為pXLA。
用EcoRV酶切質(zhì)粒pBCD，而后用PstI部分酶切，然后分離出一個含有自SCR6直至3’非翻譯區(qū)的CR1序列的6.0kb的PstI-EcoRV片段，接著將其連接到用PstI及SmaI酶切過的pXLA上。所獲的含有完整的CR1 cDNA編碼序列的細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒稱為pB-SABCD。
8.2.質(zhì)粒piABCD，一種含有全部CP1編碼順序的哺乳動物表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定。
用XhoI和NotI酶切pBSABCD質(zhì)粒，在業(yè)已用這些限制性內(nèi)切酶酶切的表達(dá)載體CDM8(Seed，B.，1987，Nature 329840-842)的4.4kb片段中的CMV啟動子的下游連接插入部分。所得的結(jié)構(gòu)稱之piABCD(圖11)。另外，在業(yè)已用這些限制性內(nèi)切酶酶切的表達(dá)載體pMT.neol中的金屬硫因啟動子的下游連接6.9Kb XhoI-NotI片段。所得的結(jié)構(gòu)稱之pMTABCD(圖11)。
通過用C1、C2和125I-C3先后處理EAC4b(lim)(Diamedix)，隨后在37℃下、在含有EDTA 40mM的明膠凡羅那緩沖鹽溶液中孵育60分鐘，制備用兔的抗體(EA)及少量的C4b[EAC4b(lim)]和每個細(xì)胞[EAc C4b(lim)，3b]12，000cpm的125I-C3b致敏的羊紅細(xì)胞。另外，把經(jīng)甲胺處理的C3[C3(ma)]共價連接到用3-(2-吡啶基二硫代)丙炔酸N-羥基丁二酰亞胺酯(Sigma)處理的羊E(紅細(xì)胞)上(Lambris，J.D.，et al.，1983，J.Immunol.Methods 65277)。用純化的C4制備EAC4b(Hammer，C.H.，et al.，1981，J.Biol.Chem.2563995)。
采用DEAE(二乙胺乙基)-葡聚糖法，把piABCD和pMTABCD轉(zhuǎn)染入COS(猴)細(xì)胞中。在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面上，用抗CR1單克降抗體YZ-1免疫熒光法;和由125I標(biāo)記細(xì)胞的免疫沉淀法及非還原性SDS-PAGE，(它顯示一種具有與由F異型純合的供體的人的紅細(xì)胞免疫沉淀的CR1的相同泳動速度的蛋白質(zhì))(Wong，W.W.，et al.，1983，J.Clin.Invest.72685);以及通過用C3b包被的羊紅細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)(Fearon，D.T.，1980，J.Exp.Med.15220)來檢測重組子CR1。天然的和重組CR1蛋白質(zhì)的相同的電泳泳動速度證實CR1F異型含有SCRs1-30。
此外，采用DEAE-葡聚糖法(Ausubel，F(xiàn).M.，et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Seidman，J.G.and Struhl，K.，eds.，John Wiley ＆ Sons，New York;Seed，B.，1987，Nature 329840)，用雙份0，2或4μg piABCD或者pMTABCD和2μg pXGH5，一種指示生長激素表達(dá)的信息質(zhì)粒(Selden，R.F.，et al.，1986，Mol.Cell.Biol.63173)共轉(zhuǎn)染鼠類L細(xì)胞。兩天后收集該細(xì)胞且通過與YZ1單克隆抗CR1抗體的結(jié)合檢測CR1的表達(dá)。重組體質(zhì)粒DNA和CR1抗原的表達(dá)之間存在一種劑量應(yīng)答關(guān)系(表Ⅱ)。
表Ⅱ重組CR1和人類生長激素在在共轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞中的劑量應(yīng)答測定板 pXGH5 pMTABCD5 pIABCD YZ1抗CR1 生長激素編號 (μg) (μg) (μg) mAB RIA＊ (ng/ml)(cpm)1 2 0 0 1444 1202 2 0 2 6058 1303 2 0 2 6531 1404 2 0 4 10620 1805 2 0 4 9898 806 2 2 0 3111 1807 2 2 0 2747 160＊放射免疫測定(RIA)在0℃，在含有1%牛血清白蛋白和0.02%疊氮化鈉的0.1ml磷酸鹽緩沖液中將3×105的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的重復(fù)樣品與3μg/ml YZ-1抗CR1IgG1一起孵育60分鐘(Changelian，P.S.，et al.，1985，J.Immunol.1341851)。細(xì)胞經(jīng)洗滌且重新懸浮在含有1-2μci/ml125I-F(ab’)山羊抗小鼠IgG或者125I-蛋白A的0.1ml緩沖液中。在0℃下1-2小時之后，洗滌細(xì)胞且測定125I。
質(zhì)粒piABCD指導(dǎo)的CR1抗原的表達(dá)幾乎比pMTABCD的多三倍。除了測定板5之外，培養(yǎng)基中的生長激素濃度的變化小于兩倍。補(bǔ)充的實驗顯示，piABCD在COS細(xì)胞中的CR1抗原的瞬時表達(dá)較在L細(xì)胞中多三倍。
當(dāng)由用YZ1抗CR1 mAB染色的細(xì)胞的間接免疫熒光法測定時，CR1抗原在轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的表面上呈束狀(圖12)。重組CR1在COS細(xì)胞上的這種分布類似野生型CR1在人類白細(xì)胞上的分布(Fearon et al.，1981，J.Exp.Med.1531615)。
重組CR1的分子量通過piABCD轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的表面碘化、用Sepharose-YZ1的細(xì)胞裂解物的免疫沉淀、SDS-PAGE以及放射自顯影術(shù)確定。重組CR1的分子量不小于190，000，相等于F異型的分子量而小于紅細(xì)胞CR1的S異型的分子量(圖14)。
通過在經(jīng)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞和EAC4b或EAC4b(lim)，3b之間形成玫瑰花結(jié)來測定重組CR1的C3b結(jié)合功能和C4b結(jié)合功能。在31次單獨轉(zhuǎn)染中，5%-50%用質(zhì)粒piABCD轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞結(jié)合5個或5個以上EAC4b或EAC4b(lim)，3b.(圖13)。表達(dá)CR1的COS細(xì)胞并不同EAC4b(lim)，3bi形成玫瑰花結(jié)，雖然這種中間體與表達(dá)CR2的RajiB類淋巴母細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)。
8.3.CR1片段的表達(dá)如下所述，構(gòu)建編碼部分CR1編碼順序的表達(dá)載體(缺失突變型體)，當(dāng)它們轉(zhuǎn)化入COS細(xì)胞時能表達(dá)它們各自的CR1插入部分。CR1片段被表達(dá)為細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。
8.3.1缺失突變型piBCD、piABD、piACD、piAD、piBD、piCD和piD的構(gòu)建這些缺失突變型的構(gòu)建是利用在4個CR1長同源重復(fù)(LHRs)的每一個接近氨基未端的同源位置中存在一個單BsmI位點，而在CR1 cDNA的其他位置和Bluescript載體中無BsmI位點(Stratagene，San Diego，CA)進(jìn)行的。
用50單位限制性內(nèi)切酶BsmI部分酶切10微克質(zhì)粒pB-SABCD45分鐘，并且用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物。純化分別對應(yīng)于缺少一個、二個或三個LHRs的親本質(zhì)粒線型片段的8.55kb、7.20kb和5.85kb的DNA片段。把這三種片段中的每一片段自身連接起來，連接產(chǎn)物分別用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.Coli DH5α使之抗氨芐青霉素。
8.55kb片段是由于pBSABCD在二個鄰近的BsmI位點上酶切而產(chǎn)生的，故而在連接之后有三種可能的質(zhì)粒產(chǎn)物，pBCD、pACD或pABD，其中大寫字母代表質(zhì)粒中仍然存在的LHRs。這些是可通過用SmaI做的限制酶圖譜區(qū)別的。從12個克隆制備DNA，用SmaI酶切和瓊脂糖凝膠電泳分離。5個克隆具有二個SmaI片段，2.5kb和6.1kb對應(yīng)于LHR-A的編碼順序的缺失，因此代表pBCD。3個克隆具有8.5kb單個線型片段，對應(yīng)于pACD。4個克隆具有1.2kb和7.4kb兩個SmaI片段，預(yù)計為LHR-C的編碼順序的缺失，形成pAB-D。這三種結(jié)構(gòu)中的每一種的5.6kb插入部分在用XhoI和NotI雙酶切之后經(jīng)凝膠純化，連接到在用相同限制性內(nèi)切酶酶切之后業(yè)已經(jīng)凝膠純化的表達(dá)載體CDM8上。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.Coli DK/p3且由各自的5個克隆制備DNA。在用SacI酶切的每種情況下都表明，在表達(dá)載體中存在缺失的CR1 cDNA插入部分，這顯示了4.20kb和5.75kb的兩個所預(yù)期的片段。這些質(zhì)粒稱之piBCD、piACD和piABD。
pBSABCD的部分酶切產(chǎn)生的7.20kb片段是BsmI在三個鄰近的位點上酶切的結(jié)果，或者對該大片段而言，在兩個位點間有一個未被酶切的位點，這樣，在轉(zhuǎn)化之后可得到兩種可能的產(chǎn)物pAD和pCD。這些可用XhoI和PstI雙酶切來區(qū)別，在pAD情況下得到1.0kb和6.2kb兩個片段，而對pCD則得到一個7.2kb線型片段。自這些質(zhì)粒的每一質(zhì)粒中來的4.2kb插入部分在用XhoI和NotI雙酶切之后經(jīng)凝膠純化，再亞克隆入上述的CDM8。由PstI和Bg1Ⅱ雙酶切表明，在表達(dá)載體中有缺失的CR1 cDNA。克隆piAD具有2.4kb和6.2kb兩片段，而piCD具有一個8.6kb片段。
自pBSABCD的BsmI酶切中來的5.85kb片段，代表一種完全酶切的產(chǎn)物，而單克隆pD是在轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α之后得到的。這可用Hind Ⅲ和Bg1Ⅱ雙酶切，得到所預(yù)期的3.7kb和2.2kb兩片段來證實。該克隆的2.9kb插入部分在用XhoI和NotI雙酶切之后經(jīng)凝膠純化后連接到上述的表達(dá)載體上。所得piD克隆的Hind Ⅲ酶切得到了預(yù)期的7.3kb片段，XhoI和Bg1Ⅱ雙酶切得到2.2kb和5.1kb兩片段，SacI酶切產(chǎn)生預(yù)期的1.5kb和5.8kb兩片段。
由pBCD的BsmI部分酶切制備質(zhì)粒pBD。凝膠純化相應(yīng)于在兩鄰近BsmI位點酶切產(chǎn)生的7.2kb線型片段，經(jīng)如上所述的自身連接，再轉(zhuǎn)化E.coli DH5α為抗氨芐青霉素。通過在SmaI酶切時存在1.2kb和6.0kb兩片段來識別pBD。4.2kb插入部分在用XhoI和NotI雙酶切之后經(jīng)純化且轉(zhuǎn)移到上述的CDM8。通過在Hind Ⅲ酶切后看到預(yù)期的0.8kb和7.8kb兩片段證實了克隆piBD。
用125I分別對瞬時表達(dá)piABCD、piBCD、piCD和piD的COS細(xì)胞作表面標(biāo)記，再用抗CR1抗體作免疫沉淀。在還原性SDS-PAGE上，piABCD結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物與CR1的F異型共遷移，而缺失突變型表明約為45，000道爾頓逐漸減少，分別表示一個、二個和三個LHRs的缺失(圖17)。
8.3.2.缺失突變型piP1、piE1、piE2、piE-2、piU1、piU-2和piA/D的構(gòu)建用BstEⅡ完全酶切質(zhì)粒piABCD，1.35kb(一種二聯(lián)體)和8.6kb的兩個片段經(jīng)凝膠純化、混合以及連接，并且使E.coli DK1/p3轉(zhuǎn)化成抗氨芐青霉素和四環(huán)素。通過與CR1 cDNA探針CR1-4雜交篩選菌落(參見上述8.1節(jié))，挑選強(qiáng)陽性克隆并且通過用SmaI酶切進(jìn)一步篩選。piE1通過存在2.7kb和7.3kb兩個片段來識別，piE2由10.0kb一個線型片段來識別。piE-2被認(rèn)為是一種含有一個8.6kbSmaI片段的弱CR1-4陽性克隆。
通過用PstI完全酶切piABCD以及凝膠純化10.0kb大片段得到質(zhì)粒piP1。連接該片段且用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DK1/p3。所得到的質(zhì)粒piP1含有一個10.0kb SmaI片段。
通過首先用質(zhì)粒pXLA轉(zhuǎn)化dcm菌株GM271/P3，再分離DNA來制備質(zhì)粒piU1和piU-2。這種DNA用StuI和NotI雙酶切，凝膠純化3.3kb片段。質(zhì)粒pBSABCD用NsiI部分酶切，產(chǎn)生的4個堿基對的3’凸出通過用E.coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段處理來去除。然后，用Not完全酶切IDNA，凝膠純化5.4kb和4.0kb片段。把這些片段連接到來自pXLA的3.3kb StuI-NotI片段上，再用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α成抗氨芐青霉素。通過與CR1 cDNA探針CR1-4雜交篩選菌落，然后用Hind Ⅲ限制性酶切進(jìn)一步驗證陽性克隆，對于pU1來說得到0.8kb、1.3kb和6.5kb三個片段，對于pU-2得到0.8kb和6.5kb二個片段。通過這些質(zhì)粒的DNA測序證實StuI鈍化的NsiI剪接是處于框架內(nèi)。在XhoI和NotI雙酶切之后，凝膠純化分別為5.6kb和4.2kb的pU1和pU-2的插入部分，再連接在如上所述的表達(dá)載體CDM8上。經(jīng)用XhoI+PstI限制性酶切證實了克隆piU1和piU-2的結(jié)構(gòu)，對于piU1，得到1.2kb和8.8kb兩個預(yù)期的片段，對于piU-2，得到8.7kb-線型片段。
通過首先用PstI完全酶切piABCD來制備質(zhì)粒piA/D。然后，用ApaI部分地酶切PstI酶切產(chǎn)物，再用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段去除了3’凸出。隨后，用瓊脂糖凝膠電泳使DNA分開，分離7.5kb片段，連接并轉(zhuǎn)化E.coli DK1/P3轉(zhuǎn)化成抗氨芐青霉素和四環(huán)素。用KpnI+SacI雙酶切證實了該結(jié)構(gòu)，即得到0.8kb、1.5kb、1.7kb和3.3kb四個預(yù)期的片段。
9.實例C3b和C4b結(jié)合區(qū)域的鑒定
9.1.測定和結(jié)果將含有由它們名稱的大寫字母表示的LHR(s)的質(zhì)粒piABCD、piAD、piCD和piD轉(zhuǎn)化入COS細(xì)胞，在測定中，它們用于評定它們的編碼的CR1片段結(jié)合C3b或C4b的能力。結(jié)合測定這樣進(jìn)行;即觀測由通過在其細(xì)胞表面上表達(dá)一個全長CR1分子或者一個CR1缺失突變型(瞬時表達(dá))的COS細(xì)胞結(jié)合C3b或C4b包被的紅細(xì)胞而引起的紅細(xì)胞玫瑰花結(jié)。在20℃下，用在0.02ml中有2-6×108/ml的載有C3或C4的紅細(xì)胞與1-4×106/ml的轉(zhuǎn)染細(xì)胞一起孵育60分鐘。用顯微鏡評定形成玫瑰花結(jié)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，將一個至少附著有五個紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)染細(xì)胞計為一個玫瑰花結(jié)。其結(jié)果示于表Ⅲ。
表Ⅲ表達(dá)CR1的重組形式的COS細(xì)胞轉(zhuǎn)染子和載有C3(ma)或C4(ma)的羊紅細(xì)胞之間玫瑰花結(jié)的形成形成玫瑰花結(jié)的轉(zhuǎn)染子%具有抗CR1的熒光轉(zhuǎn)染子%COS細(xì)胞轉(zhuǎn)染子 EC3(ma)＊ EC4(ma)＃piABCD 109(3)π62(2)piAD 8(3) 107(2)piBD 107(3) 12(2)piCD 127(3) 32(2)piD 0(3) 0(2)piA/D 11(2) 83(2)piE-2 1(1) 102(1)＊每個紅細(xì)胞中的C3(ma)數(shù)目，在采用這種中間體的三次試驗中分別為60，000、350，000和900，000。
＃每個紅細(xì)胞中的C4(ma)數(shù)目，在采用這種中間體的二次試驗中分別為160，000和140，000。
π試驗次數(shù)。
在三次單獨試驗的每一次中，根據(jù)用YZ1單克隆抗CR1抗體或者兔抗CR1抗血清免疫熒光評定表明(表Ⅲ)，與EC3(ma)形成玫瑰花結(jié)的表達(dá)全長piABCD結(jié)構(gòu)的COS細(xì)胞的比例與具有可檢測的重組受體的百分率相似。反之，表達(dá)piD的細(xì)胞不形成玫瑰花結(jié)，這表明C3結(jié)合位點一定存在于或者要求有LHR-A、-B或-C的存在。通過論證表達(dá)piBD或piCD結(jié)構(gòu)的細(xì)胞與EC3(ma)形成玫瑰花結(jié)，說明一個位點同時存在于LHR-B和LHR-C中。表達(dá)piAD、piA/D或piE-2的細(xì)胞并不具有相等的C3結(jié)合功能。由于piE-2結(jié)構(gòu)與piCDM不同僅在具有LHR-A的SCR-1和-2而不是LHR-C的開頭二個SCRs，故LHR-C中C3結(jié)合位點的功能必須要求這些NH2末端的SCRS。
與EC4(ma)形成玫瑰花結(jié)的表達(dá)全長piABCD重組子的COS細(xì)胞的比例小于與EC3(ma)呈玫瑰花結(jié)的百分率，也許這反映了每個紅細(xì)胞中C4(ma)較少(表Ⅲ)或者每個受體中C4結(jié)合位點較少。具有全部或部分LHR-A的缺失突變型piAD、piA/D和piE-2結(jié)構(gòu)與EC4(ma)的結(jié)合優(yōu)于缺失突變型piBD和piCD;piD缺少這種功能。因此，CR1的C4結(jié)合位點主要存在于LHR-A中，雖然二級位點可以存在于LHR-B和-C中。piE-2結(jié)構(gòu)相對于piCD具有較高呈玫瑰花結(jié)能力，說明LHR-A的SCR-1和-2與C4結(jié)合位點有關(guān)。
放射性免疫測定指出表達(dá)piABCD、piAD、piBD和piCD結(jié)構(gòu)的COS細(xì)胞與YZ1單克隆抗CR1抗體的結(jié)合是顯著的(表Ⅳ)。用由LHR-A的五個NH2末端SCRs和LHR-D的三個COOH末端SCRs組成的piD或piA/D轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并不與YZ1抗CR1抗體結(jié)合，雖然這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物與多克隆抗CR1抗血清結(jié)合(表Ⅳ)。因此，YZ1表位在LHR-A、-B和-C中重復(fù)出現(xiàn)，但不存在于LHR-A的NH2末端SCRs中，也不存在于或者在LHRD中是不可接近的。
表Ⅳ單克隆和多克隆抗CR1抗體對表達(dá)CR1重組形式的COS細(xì)胞轉(zhuǎn)染子的結(jié)合COS細(xì)胞 結(jié)合的YZ1 結(jié)合的兔的轉(zhuǎn)染子 單克隆抗體＊ 多克隆抗體＊piABCD 2362 12277piAD 2879 19891piBD 3646 21922piCD 2189 19926piA/D 410 23052piD 404 16386CDM8 428 4886＊在0℃下，用3μg/ml YZ1 Ig G1抗CR1 mAb(Changelian，P.S.，et al.，1985，J.Immunol.1341851)或者用90μg/ml兔的IgG抗CR1抗體與3×105轉(zhuǎn)染細(xì)胞的重復(fù)樣品在含有1%牛血清白蛋白和0.02%疊氮化鈉的0.1ml磷酸鹽緩沖液中孵育60分鐘。細(xì)胞經(jīng)洗滌且重新懸浮在含有1-2μci/ml125I-F(ab’)山羊抗小鼠IgG或者125I-蛋白A的0.1ml緩沖液中。在0℃下1-2小時之后，洗滌細(xì)胞且測定125I。所示的數(shù)值為二次測定的平均值，每3×105COS細(xì)胞中的cpm。
9.2.討論在每個LHR中第一個SCR的編碼順序中間找到的保守的BsmI位點使得精密地相應(yīng)于LHRs的界面的一系列缺失突變型的構(gòu)建有可能，并保持了開放性閱讀框架和保留了形成推測的二硫鍵所必需的四個半胱氨酸的合適的位置(圖16)。這些缺失突變型的C3(ma)和C4(ma)結(jié)合功能的比較不僅識別了具有這些特異性的LHRs，而且識別了那些對確定配位體特異性致關(guān)重要的SCRs。故而，受體的piAD、piA/D和piE-2形式(但不是piD形式)在介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞和EC4(ma)之間的玫瑰花結(jié)形成方面的能力表明，LHR-A的NH2末端的二個SCRs包含一個與這種補(bǔ)體蛋白質(zhì)相互作用的位點(表Ⅲ)。這個位點對C4(ma)僅相對專一，因為表達(dá)piAD和piA/D的轉(zhuǎn)染子還能夠結(jié)合EC3(ma)(表Ⅲ)。由玫瑰花結(jié)測定和因子I-輔因子對C3(ma)的酶切作用證明的由piBD和piCD結(jié)構(gòu)編碼的受體的C3(ma)結(jié)合功能(表Ⅲ;圖18)指出在這些LHRs的開頭二個SCRs中存在著對C3(ma)的專一性位點。這些位點也能夠與C4(ma)相互作用(表Ⅲ)。因此，在LHR-A、-B和-C中具有優(yōu)先的但是重疊的C4和C3結(jié)合活性。
另外，表達(dá)piBD和piCD結(jié)構(gòu)的COS細(xì)胞結(jié)合EC4(ma)的能力可能是編碼NH2末端36氨基酸的核苷酸從LHR-A的SCR-1經(jīng)過BsmI片段的連接轉(zhuǎn)到LHR-B和-C形成的。然而，這些36氨基酸單獨并不使piD產(chǎn)物具有與C4形成玫瑰花結(jié)的功能。我們不可能排除LHR-D在這些反應(yīng)中的輔助作用，因為這種LHR存在于所有用于測定功能的結(jié)構(gòu)中。在CR1中發(fā)現(xiàn)三個性質(zhì)不同的配位體識別位點，對C3b為二個和對C4b為一個(圖19)，這表明，每個受體分子能夠有效地結(jié)合帶有多價C4b和C3b分子的復(fù)合體，盡管它們對單價配位體具有較低的親和性(Arnaout，M.A.，et al.，1983，Im-munology 48229)。這種發(fā)現(xiàn)還為可溶性C4b不能阻止在帶有C3b的紅細(xì)胞和人類B類淋巴母細(xì)胞株系之間形成玫瑰花結(jié)提供一種解釋(Gaither，T.A.，et al.，1983，J.Immunol.131899)。CR1特別適合的可能的配位體可能是分子復(fù)合體C4b/C3b和C3b/C3b，它們分別在經(jīng)典和旁路的途徑的激活過程中產(chǎn)生。因為四個LHRs中的三個中有不同的結(jié)合位點，所以其LHRs數(shù)目不同的CR1結(jié)構(gòu)異型可能具有由配位體結(jié)合位點的數(shù)目變化而引起的重要的功能差異。雖然，在體外研究中尚未報導(dǎo)過F，S和F’(分別為A、B和C)異型的不同結(jié)合活性，但是推測僅有三個LHRs的較小的F’異型可能具有一種削弱的清除免疫復(fù)合體的能力。據(jù)報道，F(xiàn)’異型可能與全身性紅斑狼瘡有關(guān)(Van Dyne，S.，et al.，1987，Clin.Exp.Immunol.68570)。
10.實例因子I-輔因子活性的證明有人證明，在細(xì)胞表面和可溶形式中的重組CR1蛋白質(zhì)及其特定的片段具有C3b因子I-輔因子活性。
用改進(jìn)的一種公開發(fā)表的方法進(jìn)行因子I-輔因子活性的測定(Fearon，D.T.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.765867)。
為測定可溶CR1和片段的因子I-輔因子的活性，用Nonidet P-40使細(xì)胞表面CR1蛋白質(zhì)和片段溶解，再用偶聯(lián)在瓊脂糖珠上的抗CR1單克隆抗體YZ-1免疫沉淀裂解液。接著用SepharoseUPC10抗果聚糖和Sepharose-YZ-1免疫沉淀1×106的轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞的去垢劑處理的裂解液。然后，通過用0.5μg125I-C3(ma)和200ng因子I，在37℃下與洗滌過的珠在0.05mlPBS，0.5%NP-40中孵育60分鐘，測定免疫沉淀物的因子I-輔因子活性。孵育之后，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影術(shù)分析含有放射性標(biāo)記的C3(ma)的上清液。放射自顯影照片上的，由因子I蛋白分解功能產(chǎn)生的C3(ma)的α鏈的低分子量形式的出現(xiàn)表明了因子I-輔因子的活性。
為了測定細(xì)胞表面CR1和片段的因子I-輔因子活性，用0.5μg125I-C3(ma)和0.2μg因子I孵育帶有CR1表達(dá)載體(如上所述的piABCD、piAD、piBD、piCD或piD)的轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(Fearon，D.T.，1977，J.Immunol.1191248)且按上述分析。
細(xì)胞表面重組CR1的因子I-輔因子活性示于圖15。因子I僅僅在有免疫制動的重組CR1或者因子H的情況下才使C3(ma)的α鏈分解成分子量為76，000和46，000的片段(圖15)。自凝膠中切去相應(yīng)于放射自顯影照片上的帶的區(qū)域，測定125I以確定分解的α鏈的數(shù)量。在因子H存在下，91%的α鏈被分解，而在重組CR1的數(shù)量逐漸增加的情況下，則分解分別為26%、41%和55%。雖然，只用CDH8載體轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞具有一些內(nèi)源的因子I-輔因子活性，但是用piABCD、piBD和piCD轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，這種功能會增大(圖18)。在用piAD或piD轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞的情況下，未見125I-C3(ma)的分解增大。因此，在這些結(jié)構(gòu)中，只有給COS細(xì)胞提供了結(jié)合C3能力的缺失突變型piBD和piCD具有分解C3的因子I輔因子活性。
用CR1及其片段的細(xì)胞表面和溶解形式測定因子-輔因子活性的結(jié)果示于表Ⅴ。
表ⅤCR1及其片段的細(xì)胞表面和溶解形式及CR1片段的因子I-輔因子活性因子I-輔因子活性b質(zhì)粒a細(xì)胞表面溶解的piABCD + +piAD - -piBD + NDcpiCD + +piD - NDda編碼測定的CR1蛋白質(zhì)或片段，為表達(dá)轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞。
b(+)表示輔因子活性在只用CDM8載體轉(zhuǎn)染時所觀測的內(nèi)源水平以上的增量。
c未測定d未測定，由于在LHR-D中缺少用抗CR1單克隆抗體YZ1識別的表位。
如表Ⅴ所示，piABCD(編碼-全長CR1蛋白質(zhì))、piBD(編碼LHR-B和-D)或者piCD(編碼LHR-C和-D)表達(dá)形成一種具有C3b因子I-輔因子活性的產(chǎn)物。這樣，表Ⅴ的數(shù)據(jù)提供了CR1蛋白質(zhì)或其一個片段可以促使補(bǔ)體失活的證據(jù)。
11.實例可溶性CR1重組子的表達(dá)用重組DNA方法修飾CR1 cDNA，以便形成CR1或CR1片段的可溶性形式(sCR1)。在能從細(xì)胞中分泌表達(dá)蛋白質(zhì)的哺乳動物系統(tǒng)中表達(dá)sCR1結(jié)構(gòu)。與膜結(jié)合形式的CR1蛋白質(zhì)不同，形成大量可溶性的多肽，不必為了獲得溶液中的多肽而使它們?nèi)芙狻?br> 11.1材料和方法11.1.1.酶切根據(jù)制備者的建議(New England Biolabs，Inc，Beverley，MA)進(jìn)行所有的限制性內(nèi)切酶酶切，接頭連接以及T4 DNA連接酶和E.Coli DNA聚合酶反應(yīng)。用Morrison，D.A.，1979.Meth，Enzymol 68326-331中的方法，使E.Coli DH1或DH5α成感受態(tài)細(xì)胞。按照Maniatis，T，.et al.，1982.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York的方法，用DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞。用堿性裂解或者用沸騰法(上述的Maniatis，T.，et，al)以純化質(zhì)粒。
11.1.2.DNA片段分離如下所示，用瓊脂糖凝膠(BioRad，Richmond，CA)純化DNA片段。用刀片從凝膠中切除合適的DNA帶，并且把瓊脂糖塊置于一片石蠟?zāi)?parafilm)上，切成較小的片再轉(zhuǎn)移到一片新的石蠟?zāi)ど?。搗碎瓊脂糖片，把瓊脂糖轉(zhuǎn)移到1.5ml試管中。加入等體積苯酚(超純級，BRL，Gaithersburg，MD)，使混合物振蕩，然后在-70℃下冷凍10分鐘，再離心10分鐘。水相用苯酚/氯仿(1∶1)提取兩次，再用氯仿提取兩次。爾后，用乙醇沉淀DNA，洗滌沉淀物，經(jīng)真空干燥，重新懸浮在10mM鹽酸三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris-Hcl)，pH7.0，1mM EDTA中。
如下所述，由低熔點膠瓊脂糖中分離DNA片段(FMC，Corp.，Rockland，ME)。將瓊脂糖凝膠中切出來的合適的DNA帶置于1.5ml試管中，在65℃下熔融15分鐘。用含有0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS，超純級，BRL，Garthersburg，MD)的苯酚提取液化凝膠。水相再用苯酚-SDS提取一次，用氯仿提取兩次。然后，在2.0M乙酸銨中乙醇沉淀DNA，經(jīng)干燥并重新懸浮在水中。
11.1.3.轉(zhuǎn)染入哺乳動物的細(xì)胞中通過CaPO4沉淀和Graham和Van der Eb的甘油刺激方法(1973，Virology 52456-467)，把DNAs轉(zhuǎn)染入哺乳動物細(xì)胞中。在用DNA磷酸鈣制劑培養(yǎng)4-6小時之后，通過以吸氣法去除生長培養(yǎng)基和1分鐘內(nèi)加入5ml20%甘油DMEM培養(yǎng)基，使DUX B11CHO細(xì)胞受甘油刺激。然后，在完全的αMEM中洗滌兩次且在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。
11.1.4.CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)使DUX B11 CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染子在DHFR(二氫葉酸還原酶)選擇性培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng)基由沒有核苷的αMEM培養(yǎng)(Gibco)組成。補(bǔ)充有10%經(jīng)透析的胎牛血清(Gibco)和4mML-谷氨酰胺。通過提高氨甲蝶呤(Sigma，＃A-6770，Amethopterin)的濃度使細(xì)胞生長進(jìn)行擴(kuò)增(Kaufman，R.J.et al.，1985，Molec.Cell Biol.51750-1759)。
11.1.5.可溶的CR1濃度水平測定的酶連接免疫吸附劑試驗(ELISA)11.1.5.1 CR1標(biāo)準(zhǔn)把無血紅蛋白的紅細(xì)胞(RBC)血影細(xì)胞去污劑裂解液用作ELISA(enzyme-liked immunosorbent assay)中的CR1標(biāo)準(zhǔn)。血影細(xì)胞按上所述制備(Wong，WW，and Fearon D.T.1987.Meth，Enzymol 150579-585)。簡言之，由紅十學(xué)會獲得死亡后的全血。紅細(xì)胞用PBS洗滌三次，然后裂解在6份體積的低滲的裂解緩沖液(10mM Tris pH8，0.1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)，0.1mM TPCK(甲苯基亞磺酰氨基氯甲基酮)，aprotonin，2mM EDTA)中。血影細(xì)胞用裂解緩沖液洗滌幾次，用紅細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)、分裝并在70℃下冷凍待用。對于CR1 ELISA來說，在溶解性緩沖液(10mM Tris pH8，50mM KCl，0.2% NP4O，0.3% DOC，6.2mM PMSF，0.2mM碘乙酰胺，aprotonin，0.1mM TPCK，2mMEDTA，0.3%NaN3)中把血影細(xì)胞稀釋到1.6×108血影細(xì)胞/ml，接著稀釋到2.5×106血影細(xì)胞/ml，用作ELISA的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)繪出490nm下的吸收度的曲線，任何未知的樣品參照該曲線可得到相當(dāng)血影細(xì)胞/ml。
11.1.5.2.CR1 ELISA用PBS中0.4μg/ml濃度的抗CR1單克隆抗體(克隆J3 D3，AMAC IOT17)(Cook，J.，et al.，1985，Molec.Immunol.22531-538)以100μl/井包被Immulon-Ⅱ試驗板且在4℃培養(yǎng)過夜。然后丟棄抗體溶液，再通過添加封阻緩沖液(PBS中有1.0%BSA)，以300μl/井封阻試驗板，在37℃下培養(yǎng)2小時。封阻之后。立即使用試驗板或者在4℃貯存待用。
用含有0.05%Tween-20的PBS洗滌試驗板三次。以100μl/井添加樣品且在37℃下培養(yǎng)2小時(平行作兩份)如需要，用溶解緩沖液稀釋樣品。在每塊試驗板上包含標(biāo)準(zhǔn)的RBC血影細(xì)胞。在樣品培養(yǎng)之后，洗滌試驗板三次，加100μl/井的以50%FCS，50%封阻緩沖液按1∶8000稀釋的辣根過氧化物酶(HRPhorseradish peroxi-dase)(wilson，M.B.and Nakane，P.K.，1978，Immunofluorescence and Related Staining Techniques，NorthHollandBiomedical press，pp.215-224)和單克隆抗體YZ1(Changelian，p.s.，et al.，1985，J，Im-munol.1841851-1858)的結(jié)合物。在37℃下培養(yǎng)2小時之后，再用含有0.05%Tween-20的PBS洗滌試驗板三次。每井加入100μl0.2%濃度底物鄰苯二胺(OPD)，底物緩沖液為0.36%檸檬酸H2O，1.74%Na2HPO4·7H2O，0.1%乙基汞硫代水楊酸鈉，0.4%H2O，pH6.3。在室溫下20分鐘后用50μl/井2NHSO4停止反應(yīng)。記錄490nm下的吸收度。
11.2.CR1編碼順序的基因修飾CR1 cDNA由大約6，951核苷酸堿基對組成(如上圖1，6，7節(jié))。不然cDNA的轉(zhuǎn)譯終止信號是位于6145堿基對。蛋白質(zhì)是一種膜結(jié)合受體分子，由暴露在細(xì)胞膜外表面上的四個長同源重復(fù)(LHRs)組成的加上一種約為25氨基酸的跨膜區(qū)，緊接為一延伸到細(xì)胞質(zhì)中的羧基末端區(qū)，這種細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)區(qū)由43氨基酸組成。我們所采用的生產(chǎn)可溶性CR1分子(SCR1)的方法是去除把蛋白質(zhì)固定在細(xì)胞膜上的跨膜區(qū)，然后把切斷的結(jié)構(gòu)表達(dá)為分泌出來的多肽。
11.2.1.pBSCR1c的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒pBSABCD(上述實例8)含有核苷酸1-6860中的CR1cDNA，缺少3’到6860核苷酸處的EcoRV位點的未翻譯順序。CR1cDNA在堿基對5914處具有唯一的BalI限制性的核酸內(nèi)切酶識別位點，離跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)起始點有29堿基對。首先用BalI酶切pB-SABCD，以形成一個具有平頭的線型分子，然后用TDNA連接酶把它連接到由兩股具有以下順序的38核苷酸互補(bǔ)鏈組成的合成的寡核苷酸上
5’CCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTtaaCTCGAG3’GGTTTACATGGAGAGACGTGTACTACGAATTGACCTC所得的分子具有一個恢復(fù)的BalI位點和一個經(jīng)過改變的順序，它再現(xiàn)了天然CR1順序一直到并且包含在跨膜區(qū)起始點的丙氨酸殘基。此外，緊跟在丙氨酸之后引入一轉(zhuǎn)譯終止信號(在下面情況和以上劃線部分)，接著為一個XhoI限制性位點，以促進(jìn)形成亞克隆改變的cDNA。
這個質(zhì)粒(稱之pBSCR1c)的XhoI酶切，是切割在cDNA上的加了寡核苷酸的XhoI位點和在CR1 cDNA的5’末端上pBSKS+多克隆部位中的XhoI位點，去除了cDNA插入部分(稱之SCR1c)。pB-SCR1c含有下列C末端順序堿基No.5911CTGGCCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTAACTCGAG氨基酸L A K C T S R A H D A END XhoIsite11.2.2.pBSCR1s的結(jié)構(gòu)如下所示，形成了缺少跨膜區(qū)的第二個sCR1結(jié)構(gòu)。用SacI酶切pBSABCD，該酶在CR1 cDNA中5485核苷酸堿基對處唯一的SacI位點和宿主質(zhì)粒的多克隆部位中的SacI位點處被切割，該位點位于CR1 cDNA的3’末端上。這一酶切導(dǎo)致在cDNA的3’末端切除DNA順序中的1375核苷酸。然后電泳去除這種片段。用T4DNA聚合酶修平所得到的含有殘余SCR1 cDNA的質(zhì)粒的暴露末端，再進(jìn)行平末端連接。該連接中還包括Pharmacia的廣譜轉(zhuǎn)譯終止子(catalog＃27-4890-01)，Pharmacia，Inc.，piscataway，NJ)，一在全部三個閱讀框架中均含有轉(zhuǎn)譯終止信號的自補(bǔ)寡聚體。連接時，插入的寡聚體為SCR1 cDNA提供了一個新的轉(zhuǎn)譯終止信號。
11.2.3.pBM-CR1c的結(jié)構(gòu)pBMT3 X是一種真核表達(dá)載體(Krystal，M.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad Sci USA 832709-2713)，它含有人類金屬硫因-1A基因，它使細(xì)胞具有抵抗重金屬諸如鎘含量增加的能力。該載體還含有小鼠金屬硫因-1基因，它含有一個位于Mt-1蛋白質(zhì)的起始密碼子前的構(gòu)建的XhoI位點。XhoI位點作為在小鼠Mt-I啟動子控制下表達(dá)基因的插入部位。
用XhoI從pBSCR1上c切下SCR1c插入部分(約為5.9kb)，然后連接到載體pBMT3X的唯一的XhoI位點上。用限制性酶切確定pBMT3X中SCR1插入部分的正確定向(Maniatis，T.，et al.，1982.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。所得質(zhì)粒稱之pBM-CR1c。
11.2.4.缺失型突變體pT-CR1c1、pT-CR1c2、pT-CR1c3、pT-CR1c4和pT-CR1c5的構(gòu)建SCR1 cDNA缺失特定的部分可以構(gòu)建各種不同的缺失型突變體(圖20)。每種缺失型突變體均缺少全長度cDNA的跨膜區(qū)，所以突變體的表達(dá)會產(chǎn)生可溶性多肽。
11.2.4.1.pT-CR1c1用SmaI酶切pBSCR1c，獲得大小分別為2.5kb和7.3kb的兩個片段。它們用瓊脂糖凝膠電泳分離，再純化7.3kb片段，然后自身連接。使E.coli DH52細(xì)胞成感受態(tài)(Morrison，D，A.，1979.Meth.En-zymol，68326-331)，然后用連接混合物轉(zhuǎn)化。所得質(zhì)粒稱之pBL-CR1c1。這種結(jié)構(gòu)去除了CR1c插入部分的38%LHR-B、100%LHR-C及51%LHR-D。此外，在連接處2335/4894bp上重新形成SmaI位點，保持了正確的轉(zhuǎn)譯框架。用XhoI酶切pT-CR1C1，把CR1插入部分與pBlueseript載體分離。然后，將分離的CR1片段插入到表達(dá)載體pTCSgpt上唯一的XhoI位點中，形成質(zhì)粒pT-CR1c1。
11.2.4.2.pT-CR1C2用ClaI和BalI酶切pBSCR1C，得到大小為3.96kb和5.9kb的兩個片段，這兩個片段用瓊脂糖凝膠純化。用ClaI和BalI酶切質(zhì)粒pBR322，純化2.9kbpBR322片段且連接到pBSCR1c中的5.9kb片段上。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α細(xì)胞，所得的質(zhì)粒稱之pBR8.8。用XbaI酶切該質(zhì)粒，形成大小為7.45kb和1.35kb的兩個片段。由瓊脂糖凝膠純化7.45kb片段，然后再自身連接。所得的質(zhì)粒pBR7.45用ClaI和BalI酶切，把分離得的含有SCR1 cDNA的4.5kb片段連接到pBSCR1c中的3.96kb片段上，得到質(zhì)粒pBL-CR1c2。這種結(jié)構(gòu)去除了SCR1插入部分中90%LHR-B，在連接處1637/2987bp重新形成XbaI位點，且保持了正確的閱讀框架。用XhoI酶切pBL-CR1c2，使SCR1插入部分與pBluescript載體分離。然后，將分離的SCR1片段插入到表達(dá)載體上pTCSgpt上唯一的XhoI位點中，形成質(zhì)粒pT-CR1c2。
11.2.4.3.pT-CR1c3用NsiI酶切pBSCR1c，得到大小為1.09kb、1，35kb和7.46kb的三個片段。由瓊脂糖凝膠純化7.46kb片段，再自身重連接，由此形成質(zhì)粒pBL-CR1c3。這種結(jié)構(gòu)去除了SCR1插入部分中77%LHR-A和100%CHR-B。在連接處463/2907bp重新形成NsiI位點，同時保持了正確的閱讀框架。用XhoI酶切pBL-CR1c3，使SCR1插入部分與pBluescript載體分離。然后，將分離的SCR1片段插入到表達(dá)載體pTCSgpt中唯一的XhoI位點上，形成質(zhì)粒pT-CR1c3。
11.2.4.4.pT-CR1c4用PstI酶切pBSCR1c。在把CR1 cDNA連接到該載體pBluescript上的過程中，去除了pBluescript的多聚接頭區(qū)中的PstI位點(上述的實例8.1)。用凝膠電泳分離所得的大小為1.35kb和8.5kb的片段，純化8.5kb片段，再自身連接，形成質(zhì)粒pBL-CR1c4。這種結(jié)構(gòu)去除了SCR1插入部分的31%LHR-A和69%LHR-B。在連接處1074/2424bp重新形成PstI位點，由此保持了正確的閱讀框架。用XhoI酶切pBL-CR1c4，使SCR1插入部分與pBlueseript載體分離。然后，把分離的SCR1片段插入到表達(dá)載體pTCSgpt中唯一的XhoI位點上，形成質(zhì)粒pT-CR1c4。
11.2.4.5.pT-CR1c5用SmaI酶切pBL-CR1c1，由此在唯一的SmaI位點上使質(zhì)粒線性化。使該質(zhì)粒去磷酸化，再連接到含有一無義密碼子的經(jīng)磷酸化的NheI接頭上(New England Biolabs，Beverley，MA。)這類接頭含有一個在所有三個可能的閱讀框架中的均有的轉(zhuǎn)譯終止密碼子，并且還包含-NheI限制位點，這便于確認(rèn)SCR1 cDNA中存在無義接頭。所得的質(zhì)粒稱之pBL-CR1C5，它保留了SCR1 cDNA的LHR-A和62%LHR-B。用XhoI酶切pBL-CR1C5，使SCR1插入部分與pBluescript載體分離。然后，把分離出來的SCR1片段插入到表達(dá)載體pTCSgpt上唯一XhoI位點中，形成質(zhì)粒pT-CR1c5。
11.3.可溶性CR1的表達(dá)如本文所述，可以從細(xì)胞中以高產(chǎn)量分泌的CR1的可溶形式的表達(dá)(ⅰ)不限于用于缺失或切斷的CR1 cDNA中一個精確的位點，(ⅱ)也不限于應(yīng)用一種特殊的表達(dá)載體(參見上述)。可以兩個不同的表達(dá)系統(tǒng)來說明形成分泌SCR1的能力。
11.3.1.表達(dá)載體的pTCS系列的構(gòu)建所用的pTCS系列表達(dá)載體由三個質(zhì)粒組成，每個均具有一插入cDNA的唯一XhoI克隆位點(圖21)。由一組串聯(lián)啟動子驅(qū)動插入的cDNA的轉(zhuǎn)錄。SV40早期啟動子位于腺病毒的主要晚期啟動子(AD2 MLP)的上游。腺病毒的三聯(lián)前導(dǎo)順序處于cDNA開頭和AD2MLP之間。經(jīng)轉(zhuǎn)錄的mRNAs由位于XhoI cDNA克隆位點下游的鼠類免疫球蛋白卡巴(Igk)順序提供的多腺苷化信號終止。通過插入pSV 2gpt，pSV 2dhfr或pSV 2neo中的相應(yīng)的標(biāo)記，分別提供了可選擇的標(biāo)記黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)、二氫葉酸還原酶(dhfr)或者新霉素抗性(neor)。這些質(zhì)粒還是細(xì)菌復(fù)制起點和抗氨芐青霉素的β-內(nèi)酰胺酶基因的來源。一般來說，對載體的選擇取決于什么樣的選擇標(biāo)記或組合標(biāo)記對選擇重組子是較好的。
人們已經(jīng)知道腺病毒2(Ad2)、SV40、pSV 2cat(Gorman，c，1985，DNA Cloning，Volume Ⅱ，A Practical Approach，ed.D.M.Glover，IRL Press，pp.143-190)以及鼠類免疫球蛋白卡巴的全部DNA順序。這些順序在基因庫(GenBank) 數(shù)據(jù)庫和National Biomedical Research注解和參考文獻(xiàn)中。這些中的任何一些還用作pTCS載體的適當(dāng)部分的來源。
由中間質(zhì)粒pEAXgpt和pMLEgpt構(gòu)建的載體pTCSgpt、pTCS-neo和pTSdhfr如下11.3.1.1.pEAXgpt的構(gòu)建步驟1從M13mp9/MLP中得到Ad2MLP DNA片段(Concino，M.F.，et al.，1983，J.Biol.Chem.2588493-8496)。這個質(zhì)粒含有腺病毒2的核苷酸5778(XhoI位點)到6231(Hind Ⅲ位點)的順序，其中包括核苷酸6069上的PvuⅡ限制位點和核苷酸5791上的SacⅡ位點(參見NBRL核酸數(shù)據(jù)庫，保藏號＃Gdad2)。把XhoI到HindⅢ片段克隆到M13mp)的HindⅢ和SalI位點中，產(chǎn)生質(zhì)粒M13mp9/MLP。
用EcoRI和Hind Ⅲ酶切質(zhì)粒M13mp9/MLP，分離出較小的含MLP片段。再用EcoRI和Hind Ⅲ酶切pUC質(zhì)粒(Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ)，然后，把該質(zhì)粒中較大的片段連接到EcoRI到HindⅢ的MLP片段上。結(jié)果形成一個具有pUC質(zhì)粒骨架的含MLP的新質(zhì)粒。用SamI酶切該質(zhì)粒，連接到SalI接頭上，再重新環(huán)化。然后，用PvuⅡ酶切這個新質(zhì)粒，質(zhì)粒的PvuⅡ位點位于腺病毒2插入順序中＃6069位置上。把所得的線型片段連接到XhoI接頭上，再重新環(huán)化。爾后，用XhoI和SalI酶切該質(zhì)粒，分離出含有MLPDNA的較小的片段(片段＃1)。
步驟2用PvuⅡ酶切質(zhì)粒pSV 2gpt(American Type Culture Col-lection(ATCC)保藏號37145)，連接到SalI接頭上，再用SalI酶切。最終產(chǎn)物為線型pSV2gpt片段(片段＃2)。它可作為gpt基因的來源。
步驟3用HaeⅢ和AvaⅡ酶切鼠類免疫球蛋白Igk片段(Hieter，P.A.，et al;1980.Cell 22197-207)，分離含有多腺苷化順序的片段。在可由NBRF核酸數(shù)據(jù)庫(入藏號＃Kcms)中得到的鼠類Ig卡巴順序中，Ig終止密碼子在1296位上，緊接的是1306上的AvaⅡ位點、1484上的AATAAA多腺苷化位點以及1714上的HacⅢ位點。用E.coli DNA聚合酶修平該片段的突出末端，然后把片段連接到XhoI接頭上，再用XhoI酶切。這個片段(片段＃3)用作多腺苷化位點的主源。
步驟4片段1、2和3與T4 DNA連接酶一起連接，形成一環(huán)狀質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶分析證實該質(zhì)粒中的片段的正確定向。XhoI cDNA克隆位點的下游是鼠類卡巴多腺苷化位點，該位點的更下游是SV40啟動子和gpt基因。XhoI位點的上游是MLP啟動子，該啟動子的更上游是細(xì)菌復(fù)制起點和氨芐青霉素基因。然后，用SalI酶切該質(zhì)粒，用E.coli DNA聚合酶修平突出末端。使所得的補(bǔ)平末端片段連接到EcoRI接頭上，用T4DNA連接酶重新環(huán)化。這個最終質(zhì)粒稱之pEAXgpt。
11.3.1.2.pMLEgpt的構(gòu)建步驟1質(zhì)粒pMLPCAT(Lee，R.F.，et al.，1988.Virology，16551-56)是一個具有pML載體骨架的表達(dá)質(zhì)粒，它含有腺病毒2MLP和三聯(lián)前導(dǎo)順序，5’到CAT基因。用XhoI和SacⅡ酶切pMLPCAT;XhoI的酶切位點在CAT基因和三聯(lián)前導(dǎo)順序的L3區(qū)之間，SacⅡ的酶切位點在除MLP的5’以外的腺病毒DNA中的＃5791位上。由此AD2 MLP和三聯(lián)前導(dǎo)順序位于這個小的XhoI到SacⅡ的片段上(片段＃4)。
步驟2用XhoI和SacⅡ酶切質(zhì)粒pEAXgpt，除去含有MLP的較小片段。分離較大的片段(片段＃5)。使均具有SacⅡ和XhoⅠ末端的片段4和5連接，形成質(zhì)粒pMLEgpt。
11.3.1.3.pTCSgpt的構(gòu)建步驟1用SacⅡ酶切pMLEgpt，用T4 DNA聚合酶修平末端，得到一補(bǔ)平末端的片段(片段＃6)。這個SacⅡ位點是位于腺毒2順序中MLP三聯(lián)前導(dǎo)順序5’的核苷酸5791上。
步驟2用Hind Ⅲ和Pvu Ⅱ酶切pSV 2dhfr(ATCC保藏號37146)。用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段修平含有SV40早期啟動子的較小的342核苷酸片段(片段＃7)的末端。用T4DNA連接酶連接片段6和7。限制性酶的分析證實了這些片段定向正確，在XhoI cDNA克隆位點的上游有兩個前后排列的啟動子，每個啟動子能啟動在相同方向上的RNA合成。這一質(zhì)粒稱之pTCSgpt(圖22)。
11.3.1.4 pTCSdhfr的構(gòu)建步驟1 Hind Ⅲ和PvuⅡ酶切pSV 2dhfr，然后用瓊脂糖凝膠純化較大的片段(片段＃8)。舍棄較小的含有SV40早期啟動子的片段。
步驟2用EcoRI酶切pTCSgpt，然后用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段填充，形成補(bǔ)平末端。再用Hind Ⅲ酶切這種線型片段，分離含有SV40啟動子、MLP、三聯(lián)前導(dǎo)順序物、XhoI cDNA克隆位點、鼠類Igλ順序以及第二SV40啟動子的pTCS轉(zhuǎn)錄單元的片段(大約1600核苷酸)(片段＃9)。該片段具有一平末端和-HindⅢ突末端。連接片段8和9形成質(zhì)粒pTCSdhrf。
11.3.1.5.pTCSneo的構(gòu)建步驟1用Hind Ⅲ和BamHI酶切pSV 2neo(ATCC保藏號37149)，再分離較大的片段(片段＃10)。該片段含有質(zhì)粒骨架和neo基因。
步驟2用Hind Ⅲ和BamHI酶切pTCSdhfr，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳之后，分離出pTCS轉(zhuǎn)錄單元(片段＃11)。連接片段10和11形成質(zhì)粒pTCSneo。
11.3.2.含有可溶性CR1編碼順序的哺乳動物表達(dá)載體質(zhì)粒pBSCRlc、pBSCRls和pBM-CR1c表達(dá)和鑒定11.3.2.1在CR1 cDNA中的不同位置上切斷的CR1結(jié)構(gòu)的表達(dá)構(gòu)建質(zhì)粒pBSCRlc和pBSCRls，它們保存了除跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)之外的大部分cDNA編碼區(qū)(上述的11.1.節(jié))(圖20)。pBSCRls比pBSCRlc短，因為它缺失了pBSCR1c中所含有的LHR-D和SCRS29及30部分。將這些質(zhì)粒的SCR1部分插入到pTCSgpt中，接著如上所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染和表達(dá)。
pBSCRlc/pTCS gpt的構(gòu)建用XhoI酶切pBSCRlc，得到5.9kb的插入部分，SCRlc。將SCRlc插入到pTCSgpt的XhoI cDNA克隆位點中，產(chǎn)生pBSCRlc/pTCSgpt。
pBSCRls/pTCSgpt的構(gòu)建用XhoI和PvuI酶切pBSCRls得到SCRls插入部分。用T4DNA聚合酶修平插入部分的末端。用瓊脂糖凝膠純化該插入部分。用XhoI酶切載體pTCSgpt，用E.coli DNA聚合酶Ⅰ填平XhoI突末端。接著，把SCRls插入部分連接到末端補(bǔ)平的載體上，形成pBSCRls/pTCSgpt。
用FspI酶切質(zhì)粒pBSCRlc/pTCS gpt和pBSCRls/pPTCSgpt，與質(zhì)粒pSV 2dhfr經(jīng)磷酸鈣共沉淀，把所得的線型DNA’s轉(zhuǎn)染到dhfr基因為突變體的中國倉鼠卵巢(ChineseHamsterOvary)細(xì)胞中(CHODUX B11細(xì)胞)。讓它們在DHFR選擇性培養(yǎng)基上生長而選擇轉(zhuǎn)染子。用ELISA鑒定轉(zhuǎn)染子克隆的培養(yǎng)上清中分泌的SCR1。鑒定50個pBSCRlc/pTCSgpt重組子的培養(yǎng)上清，并且通過在把它們提高的氨甲喋呤濃度中培養(yǎng)的擴(kuò)增方法獲得陽性重組子。此外，通過每管共同培養(yǎng)8個pPBSCRlc/pTCSgpt轉(zhuǎn)染子并且使它們經(jīng)相同的擴(kuò)增方法，制備數(shù)管轉(zhuǎn)染子。擴(kuò)增的結(jié)果示于表Ⅵ。
表ⅥpBSCRlc/pTCSgpt的表達(dá)分泌的可溶性CR1(μg/ml)CLINE OMTX 20nMMTX 50nMMTX 100nMMTX 500nMMTX2＊ 0.7 3.4 11 10.94 0.04 0.16 0.049 0.0210 0.211 0.1212 0.1413 0.0714 0.215 0.45 1.1 7.3 9.021 0.0730 0.27 ＜0.02 ＜0.0235＊+ 0.82 6.3 8.4 10.9 10.940 0.0541 0.0550 0.1252 0.12POOLA 0.02B 0.04C 0.23D ＜0.02 ＜0.02E 0.27 1.1F 3.6 5.8 9.1G 0.27H 0.04
＊選擇克隆2和35以大規(guī)模生產(chǎn)SCR1。
+通過有限稀釋將克隆35進(jìn)行亞克隆，測定每種亞克隆形成的可溶性CR1。
pBSCRc/pTCSgpt-克隆35.6的產(chǎn)量最高，為17.7μg/ml sCR1。
MTX氨甲喋呤(methotrexate)用ELISA鑒定pBSCRls/pTCSgpt的12個重組子形成的可溶性CR1。所有12個鑒定物都顯示分泌可檢測水平的SCR。最好的生產(chǎn)者產(chǎn)生的SCR1的水平可與最好的pBSCRlc/pTCSgpt轉(zhuǎn)染子產(chǎn)生的相比。
pBSCRlc/pTCSgpt和PBSCRls/pTCSgpt重組子產(chǎn)生具有相似水平的可溶性CR1。這表明，產(chǎn)生可溶性CR1多肽的能力并不取決于CR1 cDNA中的一個確切的切斷點。
在超過500nM氨甲喋呤的條件下擴(kuò)增細(xì)胞系克隆35.6的最初努力是失敗的。因此，在表Ⅵ中所示的欄內(nèi)尋找替代的細(xì)胞系。與克隆35比較，候選者是在表達(dá)的基礎(chǔ)上加以選擇的。在表達(dá)開始達(dá)到平穩(wěn)時期的氨甲喋呤水平，對細(xì)胞系進(jìn)行亞克隆，并在上清液中檢測sCR1的濃度。在此基礎(chǔ)上選擇出抗50nM氨甲喋呤的細(xì)胞系15。它被亞克隆，得細(xì)胞系15.19，使表達(dá)增加到35.6水平。然后，在含有不同濃度氨甲喋呤的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15.19，只有2500nM氨甲喋呤可得到提高的sCR1表達(dá)水平，比35.6增加分泌63%。這細(xì)胞系命名為15.192500，然后通過限制稀釋進(jìn)行亞克隆，得到細(xì)胞系15.192500.07，15.192500.10，及15.192500.65。這些細(xì)胞系依次比35.6每毫升多產(chǎn)生143%，119%及103%的sCR1。
11.3.2.2在兩種不同的表達(dá)系統(tǒng)中sCRlc的表達(dá)將切斷的CR1 cDNA插入部分，sCRlc插入至表達(dá)載體pTCS gpt中，并如上所述進(jìn)行表達(dá)。它還被插入至表達(dá)載體pBMT3X中，如上面的11.2.3章節(jié)中所描述，產(chǎn)生pBM-CR1c。這兩種表達(dá)載體都具有非常強(qiáng)的啟動子。在兩種系統(tǒng)中測試可溶性CR1的表達(dá)以確定是否有一個系統(tǒng)可以獲得較好產(chǎn)量的分泌多肽。
采用磷酸鈣方法(Graham，F(xiàn).L.和Van derEb，A.J.1973，Virol-ogy 52456-467)，用pBM-CRlc轉(zhuǎn)染C127I鼠細(xì)胞(ATCC保藏號.CRL 1616，Rockville，Maryland)。經(jīng)甘油刺激后，用含有10%胎牛血清和2mML-谷氨酰胺的D-MEM培養(yǎng)基恢復(fù)細(xì)胞，在37℃下培養(yǎng)48小時。然后，用胰酶消化細(xì)胞，分成1∶5和1∶10的比例加入完全DMEM培養(yǎng)基+10μm氯化鎘中，10天內(nèi)出現(xiàn)耐鎘菌落。采用克隆圓筒將10個菌落取出，將每個菌落都轉(zhuǎn)移到含有完全D-MEM培養(yǎng)基的陪替氏培養(yǎng)皿中，在37℃，5%CO下培養(yǎng)直至細(xì)胞融合。然后，對每一個培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，并分裝入三個60mm的培養(yǎng)皿中用于制備冰凍細(xì)胞原種，RNA抽提物，并用于采用ELISA，法測試細(xì)胞培養(yǎng)基中是否存在分泌sCRlc。
當(dāng)從每一個融合的陪替氏培養(yǎng)皿中移出細(xì)胞培養(yǎng)基并進(jìn)行ELISA分析時，發(fā)現(xiàn)被測試的所有pBM-CRlc克隆對生產(chǎn)可溶性CR1均為陽性。將來自pBM-CRlc重組子的分泌sCR1的量與來自pBSCRlc/pTCSgpt重組子的那些進(jìn)行比較。結(jié)果表明高產(chǎn)量地生產(chǎn)分泌sCR1多肽的能力并不依賴于僅使用某些啟動子或表達(dá)系統(tǒng)。
11.3.3含有可溶性CR1編碼順序的哺乳動物表達(dá)載體，pT-CRlc系列，質(zhì)粒pT-CR1c1，pT-CR1c2，pT-CR1c3，pT-CR1c4和pT-CR1c5的表達(dá)和測試。
pT-CR1c系列缺失突變體缺失跨膜和胞質(zhì)區(qū)，和pBSCR1c和pBSCR1s的結(jié)構(gòu)一樣。此外，缺失突變體還包括相當(dāng)大量的CR1 cD-NA的各種LHR區(qū)的缺失(見圖20)。將缺失突變體在CHODUXB11細(xì)胞中表達(dá)，并測定其產(chǎn)生的可溶性CR1多肽的量。
對于每一種缺失結(jié)構(gòu)，選出40種不同管的克隆進(jìn)行ELISA分析以確定是否產(chǎn)生了可溶性CR1多肽。通過ELISA或通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中檢查其功能活性的存在，發(fā)現(xiàn)所有5種pT-CR1c結(jié)構(gòu)中四種在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)分泌sCR1。用5種pT-CR1c結(jié)構(gòu)中的3種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液中所產(chǎn)生的sCR1，通過溶血分析測定認(rèn)為是功能性的(見表Ⅶ和下面的13.2章節(jié))。
表Ⅶ功能性sCR1片段的制備＊結(jié)構(gòu) ELISA 溶血分析pT-CR1c1 - +pT-CR1c2 + +pT-CR1c3 - -pT-CR1c4 + 未測定pT-CR1c5 - +＊用于ELISA測試或溶血分析的上清液是從生長在T75燒瓶或24井培養(yǎng)板中培養(yǎng)物中獲得。因為在這些條件下，不同量的可溶CR1都可以累積于培養(yǎng)上清中，所顯示的結(jié)果是定性的。(+)表示由所指定的分析法檢測，產(chǎn)生了功能性的sCR1。
缺失突變體也能夠產(chǎn)生可溶性CR1的事實進(jìn)一步顯示了表達(dá)sCR1的能力不依賴于CR1 cDNA的一種確切的遺傳修飾。象刪除跨膜區(qū)后，所有的結(jié)構(gòu)均能制備可溶性多肽。
12實例可溶性的CR1的制備和純化大量的sCR1在空心纖維生物反應(yīng)器系統(tǒng)中制備。所獲得的sCR1的量與接種的重組子克隆的相應(yīng)產(chǎn)量成正比。為了獲得最佳的純化效果，選用血清培養(yǎng)基，在缺乏大量的外源加入的胎牛血清多肽的情況下，仍可獲得高生產(chǎn)水平的sCR1。
12.1可溶性CR1的大規(guī)模制備與Ⅳ-L型空心纖維生物反應(yīng)器(30KD分子量中止)相配的細(xì)胞-PharmTM細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)Ⅰ(CD Medical Inc，MiamiLakes，F(xiàn)L)在無菌條件下裝配。將兩個克隆(pBSCR1c/pTCSgpt的克隆2和克隆35)擴(kuò)展至8個T-225燒瓶中。當(dāng)融合時，用胰酶消化細(xì)胞，洗滌和制丸，并將其重懸浮于培養(yǎng)基中。約5×108個克隆2的細(xì)胞和10×108個克隆35的細(xì)胞接種到兩個分開的空心纖維生物反應(yīng)器中。采用一個20升的料液藏器，其中盛有α-MEM+10%胎牛血清，8mM L-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素鏈霉素和適當(dāng)濃度的氨甲蝶呤(對于克隆2為50nM，而對于克隆35為500nM)。預(yù)先混合的氣體(含5%CO2的空氣)通過氧氣發(fā)生器向貯藏器中的培養(yǎng)基鼓泡以維持pH。調(diào)整培養(yǎng)基的重復(fù)循環(huán)，替換和氣體流速以獲得最大的產(chǎn)量。將接種的部分在1000rpm下離心10分鐘，通過0.22μM孔徑的過濾而收集樣品，純化前保持于4℃。收集的體積和頻率從25ml，培養(yǎng)初期為每星期3次起逐漸增加，至40ml，2-3個月后每星期5次。通過CR1 ELISA來測試所產(chǎn)生的sCR1。接種后第一個月，克隆2和克隆35的產(chǎn)量分別為66μg/天和1060μg/天。產(chǎn)量隨著培養(yǎng)株的形成而增加。
12.1.1在無血清培養(yǎng)基中sCR1的制備對兩種商業(yè)上可購得的無血清培養(yǎng)基支持細(xì)胞生長和sCR1產(chǎn)生的能力進(jìn)行測試。pBSCR1c/pTCS gpt克隆35的T75燒瓶中的融合物被分裝入2個T75燒瓶中。一個瓶子用補(bǔ)充有10%胎牛血清，L-谷氨酰胺，抗生素和500nM氨甲喋呤的α-MEM培養(yǎng)。另一個瓶則在α-MEM+L-谷氨酰胺，抗生素，500nM氨甲蝶呤+HB CHO生長添加劑(Hana Biologics，Inc.Alameda，CA)中培養(yǎng)并逐步減少胎牛血清，從5%，1%，0.5%至無牛胎血清。比較兩個瓶中細(xì)胞的生長和sCR1生產(chǎn)水平。在無血清的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞不會達(dá)到融合。sCR1生產(chǎn)產(chǎn)量列于表Ⅷ中。在每一種情況下，當(dāng)細(xì)胞在10%的胎牛血清中生長時，sCR1的生產(chǎn)水平是最高的。比較發(fā)現(xiàn)，在14天時，無血清培養(yǎng)基中的產(chǎn)量是1.4×1010個血影細(xì)胞/ml，而在補(bǔ)充10%胎牛血清的培養(yǎng)基中則為4.2×1010個血影細(xì)胞/ml。
表Ⅷ在補(bǔ)充CHO生長補(bǔ)充劑的無血清培養(yǎng)基和含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中sCR1的產(chǎn)生＊第4天 第7天 第11天 第14天瓶1CHO生長補(bǔ)充劑+ 5%FCS 1%FCS 0.5%FCS 0%FCS2.6 2.4 2.95 1.4瓶210%FCS 4.8 3.85 4.3 4.2＊以1010個血影細(xì)胞/ml表示。
采用第二種來源的無血清培養(yǎng)基(CHO-1，Ventrex Laboratories，Inc.Protland，ME)測試重組子中細(xì)胞的生長和sCR1的產(chǎn)生。因為不需要在該培養(yǎng)基中逐步去掉細(xì)胞生長的血清，所以，細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中直接解凍和培養(yǎng)。該培養(yǎng)基由DME-12堿和生長添加劑組成。將相等數(shù)量的細(xì)胞解凍并接種入24-井培養(yǎng)板中各個井孔中。細(xì)胞附著后，除去培養(yǎng)基，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基或無血清的培養(yǎng)基加入至適當(dāng)?shù)木字?。每一種情況都進(jìn)行二次。與先前所測試的無血清培養(yǎng)基的情況不同，CHO-1，Ventrex Laboratories培養(yǎng)基可產(chǎn)生與含有牛胎血清的培養(yǎng)基相似水平的細(xì)胞生長。
12.1.2.結(jié)論上述結(jié)果表明產(chǎn)生sCR1 CHO細(xì)胞可以維持在一定的無血清的培養(yǎng)基中。這就減少了大規(guī)模生產(chǎn)所花費的培養(yǎng)基的成本。另一個優(yōu)點是簡化了從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化sCR1，因為不需要除去胎牛血清蛋白質(zhì)。
12.2可溶性的CR1的純化隨著專一性抗CR1抗體的出現(xiàn)，用簡化的二步法來代替制備純化的CR1所需的多步層析法就成為可能了。這樣也增加了CR1蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，每5.9×1013個紅細(xì)胞可獲得約1-5mgCR1(Wong，W.W等人，1985，J.Immunol.Methods 82303-313)。但是，因為所報導(dǎo)的純化是與膜結(jié)合形式的CR1的純化，所以總是需要用去垢劑溶解含CR1的物質(zhì)。
用重組轉(zhuǎn)染子所制得的可溶性CR1不必要用去垢劑溶解再純化;它已經(jīng)是可以溶解的。盡管可溶性CR1可以通過抗CR1抗體層析法純化(見下面)，但該過程本身不適宜于大量制備。擴(kuò)大產(chǎn)量的程度受到可以得到的用于制備抗體純化柱的抗體基質(zhì)的抗CR1抗體的量的限制。此外，對于CR1具有高結(jié)合親和力的抗體，如YZ-1意味著相當(dāng)苛刻的條件，如必須達(dá)到pH12.2以從抗體基質(zhì)中去除結(jié)合的sCR1產(chǎn)物(Wong，W.W.等人，1985，J.Immunol.Meth-ods 82303-313)。
為了具備純化很大量可溶性CR1的能力，形成了包括HPLC柱在內(nèi)的純化方法。這些HPLC柱可以容易地擴(kuò)大以生產(chǎn)相當(dāng)大量的純化的可溶性CR1。此外，它們不需要在苛刻的條件下洗脫和復(fù)原sCR1。
12.2.1.抗體親和柱純化12.2.1.1.方法為了進(jìn)行sCR1的抗體親和純化，根據(jù)制造商的說明，將100mg單克隆抗體YZ-1以共價偶聯(lián)到7mg Affi Gel-10(BioRad，Richmond，CA)上。在瓶中用固定的YZ-1孵育來自于細(xì)胞培養(yǎng)物的含有CR1的上清液，在4℃振蕩過夜。將物質(zhì)傾注入玻璃柱中，用10mM Hep-es，0.1M Nacl，pH7徹底沖洗，用20mM磷酸鈉，0.7M Na Cl，pH12洗脫sCR1(Yoon.S.H和Fearon D.T.1985，J.Immunol.1343332-3338)。用Biorad蛋白質(zhì)分析儀(BioRad，Richmond，CA)來檢驗洗脫的級分中蛋白質(zhì)的存在。將含有蛋白質(zhì)的樣品馬上收集起來并在0.1MHepes，pH7(2×11)中，于4℃透析過夜。然后在PBS中透析樣品。通過CR1 ELISA分析存在的sCR1。
12.2.1.2.結(jié)果將由轉(zhuǎn)染子pBSCR1c/pTCSgpt克隆2所制得的含有sCR1的細(xì)胞培養(yǎng)上清液加到抗CR1抗體親和層析柱上，收集峰值sCR1級分。將一組這種純化的物質(zhì)在4-20%的SDS-PAGE凝膠上走電泳(DAIICHI;Inc.，聚丙烯酰胺凝膠，modified procedure of Laemmli，U.K.，1970，Nature.227680-685)。在還原條件下，可溶的CR1的表觀分子量是約224，000道爾頓(圖24)。該純化的CR1分子具有抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血作用，同樣也抑制C5a和C3a產(chǎn)生，這也表明它是具有活性的(下面第13章節(jié))。
12.2.2.采用HPLC的CR1純化12.2.2.1.方法12.2.2.1.1.原料當(dāng)培養(yǎng)物在生物反應(yīng)器中剛剛形成時，sCR1的生產(chǎn)水平低于培養(yǎng)物已生長了幾個月的時候。通常，在細(xì)胞在生物反應(yīng)器中達(dá)到融合和產(chǎn)生最大產(chǎn)量的sCR1以前，有一個幾個星期的周期。含有少量sCR1的細(xì)胞培養(yǎng)上清液在純化前可通過硫酸銨沉淀或超濾法而濃縮。用60～80%飽和的硫酸銨分級分離上清液，所沉淀的sCR1呈現(xiàn)基本相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)量。將沉淀物以最小的體積溶解并在用于陽離子交換HPLC的初始緩沖液中透析?；蛘撸梢猿瑸V濃縮CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液并透析到用于陽離子交換層析的初始緩沖液中。
因為生物反應(yīng)器中產(chǎn)生了較高濃度的可溶性CR1，從這些培養(yǎng)物中得到的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液可直接透析至用于陽離子交換層析的初始緩沖液中。
12.2.2.1.2.陽離子交換HPLC過程將樣品透析至初始緩沖液中(0.02M磷酸鈉，0.06N氯化鈉，pH7.0)，然后通過一個0.2μm過濾器過濾以除去所有的粒狀物質(zhì)。然后，將樣品加到陽離子交換高壓液相色譜柱上(10cm×10mm，Hyd ropore-SCX HPLC柱，Rainin)。洗滌該色譜柱，并用0.02M磷酸鹽，0.5N Na Cl pH7.0形成的氯化鈉梯度洗脫。約在0.06N和0.25N NaCl之間將SCR1洗脫下來。通過280nm處吸收和ELISA監(jiān)測洗脫。
12.2.2.1.3.陰離子交換HPLC過程如果需要的話，可以由陰離子HPLC對陽離子HPLC純化的sCR1進(jìn)一步純化。將陽離子HPLC的峰值級分透析至陰離子HPLC的初始緩沖液中。上樣后用0.01M磷酸鹽，pH7.5洗滌(Hydropore-AX，Rainin)。采用0.01M磷酸鹽，0.5N Na Cl，pH7.5形成的(NaCl)梯度洗脫該柱(采用一系列的步驟)。約在0.0N和0.3NNa-Cl之間將sCR1洗脫下來。如前面對于陽離子交換HPLC一樣監(jiān)測洗脫情況。所給出的陽離子和陰離子HPLC柱緩沖液的濃度和pH只是一些例子。其它濃度的緩沖液，鹽的條件或pH條件也可以采用。
12.2.2.1.4.Western印跡法分析Western印跡法采用Towbin H.等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，764350-4354的修改方法而進(jìn)行。簡而言之，將純化的sCR1在4-20%SDS-PAGE上凝膠上電泳，再將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用抗CR1抗體(鼠mAbYZ-1或J3D3)專一探查，并用與堿性磷酸酯酶連接的山羊抗鼠抗體檢測。
12.2.2.2.結(jié)果就一個典型循環(huán)而言，將50-100ml取自生物反應(yīng)器培養(yǎng)物的上清液透析至初始緩沖液中，并加到10cm×10mm陽離子交換HPLC上。通過在280nm處吸光值和ELISA法確定峰值級分，并收集。通過280nm處吸光值(ε值1%)在280nm處＝10，如對于CR1c氨基酸成分估計)而測定收集物中蛋白質(zhì)的濃度。從100ml擴(kuò)大培養(yǎng)的上清液中純化得到幾十毫克產(chǎn)品。
在一個實例中，當(dāng)采用陽離子HPLC純化時，通過在280nm處的吸光值的測定100ml來自轉(zhuǎn)染子pBSCR1c/pTCSgpt克隆2的培養(yǎng)物上清液產(chǎn)生22mg純化的sCR1，當(dāng)采用陽離子HPLC純化時，通過在280nm處的吸光率而測定(圖24)。當(dāng)用CR1 ELISA檢驗時，計算得到產(chǎn)率為202%，另外13%是在流過的或柱的洗滌級分中。產(chǎn)率大于100%可能反映了ELISA分析中的基質(zhì)的影響。
給定培養(yǎng)物上清液從生物反應(yīng)器中抽出的速率，在該水平的氨甲蝶呤擴(kuò)增下，每個生物反應(yīng)器每周可生產(chǎn)約100mg純化的可溶性CR1。該水平的生產(chǎn)能力可以增加的一些方法包括在接種到生物反應(yīng)器前，用氨甲蝶呤將初始反應(yīng)物擴(kuò)增到最大，增加任何一次生產(chǎn)中生物反應(yīng)器的數(shù)量，和采用較大容量的HPLC柱。
12.2.2.3.純化的可溶CR1的特性從陽離子HPLC得到的含有sCR1的峰值級分在陰離子HPLC中進(jìn)一步純化(圖24)。通過SDS-PAGE對于在不同的步驟中的sCR1物質(zhì)的純度進(jìn)行測試(圖25)。在這些高負(fù)載凝膠上可看到的較小的帶代表sCR1片段，如通過采用抗CR1單克隆抗體，YZ1或J3D3的Western印跡法所測定的。在大多數(shù)制備中，未觀察到sCR1片段色帶。
純化的sCR1的功能活性通過濃度為0.25μg/ml的純化的sCR1可以抑制50%經(jīng)典的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血作用的能力而測試。在5μg/ml時，純化的可溶性CR1也能夠抑制50%經(jīng)典的補(bǔ)體C5a的產(chǎn)生，而在13μg/ml時，則可抑制50%C3a的產(chǎn)生(見下面第13章節(jié))。
12.2.2.4.結(jié)論如上所述，我們建立了一種純化可溶性CR1的改進(jìn)的方法，所述的可溶性CR1可以容易地擴(kuò)大以生產(chǎn)大量治療應(yīng)用所需的sCR1。該方法的基本要點包括已經(jīng)溶解的起始原料，這樣，就不需要用去垢劑來溶解與膜結(jié)合的CR1。在生物反應(yīng)器培養(yǎng)基中胎牛血清濃度的減少和/或在培養(yǎng)中采用另一種培養(yǎng)基排除了在隨后的純化過程中從含有sCR1的原料中去除高濃度外源蛋白質(zhì)的需要。此外，用HPLC方法進(jìn)行純化提供了大規(guī)模純化的方法。陽離子HPLC或先陽離子HPLC，然后陰離子交換HPLC結(jié)合的方法均可用于純化。采用這種方法，只以1或2個步驟就可以高產(chǎn)率地獲得基本純的可溶的sCR1。
13.實例可溶性CR1體外活性的實驗13.1.抑制嗜中性粒細(xì)胞的氧化突增。
在心肌梗塞中遭受損害的組織的重輸注損傷模型中，活化的補(bǔ)體組分誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞的粘連和活化，活化的嗜中性粒細(xì)胞經(jīng)歷氧化突增形成劇毒氧基，這些和其它一些潛在的毒素在嗜中性粒細(xì)胞脫粒時釋放出來，破壞周圍的組織?？扇苄訡R1可通過阻止在嗜中性細(xì)胞活化中產(chǎn)生C3a和C5a以及補(bǔ)體組分而減小被破壞的組織的區(qū)域。
為了檢驗可溶性CR1阻止在體外補(bǔ)體激活中產(chǎn)生C5a的能力，采用一種生物分析法，它可以對在C5a誘導(dǎo)的氧化突增過程中由嗜中性細(xì)胞所產(chǎn)生的氧基進(jìn)行定量(Bass，D.A.等人，1983，J.Immunol.1301910-1917)。該分析中采用二氯二乙酸熒光素酯(DCFDA)，一種可進(jìn)入細(xì)胞中并殘留下來的脂溶性分子，氧化時可發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。
13.1.1.材料和方法13.1.1.1.材料采用新鮮的全血，人體補(bǔ)體來源(Beth Israel Hospital，Boston，MA)，干燥的Baker's酵母，具有0.1%明膠和5mM葡萄糖的PBS，100mMEDTA，在HBSS中的10mM DCFDA，(Kodak)，紅血細(xì)胞(RBC)溶解緩沖液(Ortho Diagnostics)，純化的C5a(Sigma Chemical CO.St.Louis，MO)，和可溶性CR1。
13.1.1.2.嗜中性粒細(xì)胞的制備采用Bass(1983，J.Immunol.1301910-1917)所描述的方法來制備嗜中性粒細(xì)胞。將2.0ml全血在PBS-明膠-葡萄糖中洗滌3次，再懸浮于5ml在HBSS中的10μM的DCFDA+5ml PBS-明膠-葡萄糖中，于37℃下孵育15分鐘，然后離心分離細(xì)胞并重新懸浮于2.0mlPBS-明膠-葡萄糖+5mMEDTA中。
13.1.1.3酵母顆粒的制備將干燥的Baker's酵母重懸浮于H2O中，洗滌2次并沸騰30分鐘。將顆粒再在H2O中洗滌2次，并以0.5g/ml重懸浮于水中，(Simpson P.J.等人，上述的)。
13.1.1.4.用純化的C5a來活化嗜中性粒細(xì)胞用RBC溶解緩沖液處理100μl載有DCFDA的細(xì)胞，在PBS-明膠-葡萄糖-EDTA中洗滌1次，并重懸浮于1.0mlPBS-明膠-葡萄糖中。將50μl200ng/ml的純化的C5a或?qū)φ瘴镌?7℃加入0.5ml靶細(xì)胞中，在不同的時間間隔下，用流式細(xì)胞光度計進(jìn)行分析。
13.1.1.5.用人血清或血漿中的純化C5a激活嗜中性粒細(xì)胞用50μl在人血清或肝素化的血漿中(100ng/ml)以1∶1稀釋的C5a或?qū)φ瘴镌?7℃下與100μl載有DCFDA的細(xì)胞一起孵育30分鐘。RBC被溶解出來，用流式細(xì)胞光度計分析嗜中性粒細(xì)胞。
13.1.1.6.用酵母顆?；罨娜搜寤蜓獫{活化嗜中性粒細(xì)胞在37℃下，25μl酵母顆粒與425μl新鮮冰凍的血清和血漿+50μl sCR1或?qū)φ瘴镆黄鸱跤?0分鐘。然后，將激活的補(bǔ)體或?qū)φ諛悠冯x心分離以除去酵母顆粒。每一個這種樣品都在PBS-明膠-葡萄糖-EDTA中進(jìn)行10次2倍的稀釋。將50μl每一種稀釋后的對照和活化的血清和血漿加入50μl載有DCFDA的靶細(xì)胞中，在37℃下孵育30分鐘。然后，溶解出RBC's，用流式細(xì)胞光度計分析嗜中性粒細(xì)胞。
13.1.2.結(jié)果13.1.2.1.可用DCFDA測定的C5a誘導(dǎo)的人體嗜中性粒細(xì)胞中的氧化突增圖26顯示了用純化的C5a刺激后，人體嗜中性粒細(xì)胞的熒光強(qiáng)度迅速增加。在加入C5a(最終濃度為20ng/ml)后4分鐘內(nèi)，嗜中性粒細(xì)胞比載有DCFDA的對照嗜中性粒細(xì)胞亮10倍。到20分鐘時，嗜中性細(xì)胞的亮度則是對照的亮度的20倍。這個分析似乎是C5a的靈敏檢測器。
13.1.2.2.人體血清可阻斷純化的C5a對于嗜中性粒細(xì)胞的氧突增作用在與用人血清稀釋的純化C5a一起孵育的，并載有DCFDA的嗜中性粒細(xì)胞中沒有觀察到熒光強(qiáng)度的增加。這個效應(yīng)可能是由于在血凝過程中從血小板中釋放出來的血小板衍生生長因子(PDGF)作用的結(jié)果。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，低水平的PDGF可以抑制C5a誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞的活化(Wilson E.等人，1987，Proc Natl.Acad.Sci.USA 842213-2217)。
13.1.2.3.肝素化的血漿不阻滯C5a對嗜中性粒細(xì)胞的作用在肝素化的血漿中1∶1稀釋的C5a誘導(dǎo)載有DCFDA的嗜中性粒細(xì)胞的氧突增。盡管不如在緩沖液中由C5a引起的作用劇烈，在用該嗜中性粒細(xì)胞培養(yǎng)30分鐘后，熒光強(qiáng)度增加了10倍。減弱的信號可能是由于在靜脈放血或血漿分離中釋放的PDGF所引起。更溫和及迅速地從血液細(xì)胞組分中分離出血漿可使PDGF的釋放最小并可得到較好的C5a功能。
13.1.2.4.存在于補(bǔ)體活化過程中的sCR1阻止C5a的產(chǎn)生在可溶性CR1的存在下，酵母多糖引起人類補(bǔ)體的活化，當(dāng)用DCFDA測試時發(fā)現(xiàn)減少了C5a的活性。如圖27所示，在sCR1存在下被活化的人類血漿的1∶16稀釋液所產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞中的熒光密度的增加比不存在sCR1時被活化的血漿的1∶16稀釋液少70%。這意味著sCR1對C5a產(chǎn)生抑制作用。對DCFDA測定法及血漿的收集作進(jìn)一步的改進(jìn)，可以獲得一個測定可溶性CR1活性的更高效和更為敏感的方法。
13.2.對補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血作用的抑制13.2.1方法對補(bǔ)體抑制能力的測試是通過測定對補(bǔ)體介導(dǎo)的紅細(xì)胞溶胞(溶血作用)的抑制來進(jìn)行的。對溶血作用的抑制是可溶性CR1溶液的一個功能。將sCR1樣品在0.1M Hepes緩沖劑(0.15NNa Cl，pH7.4)中稀釋以進(jìn)行測定，在V形底的微量滴定板上的每個井中加入50μl，一般同一樣品重復(fù)3次。將作為補(bǔ)體來源的人類血清用Hepes緩沖液稀釋成1∶125，在每個井加入50μl。接著，采用商業(yè)上可獲得的具有抗綿羊抗體的綿羊紅細(xì)胞(Diamedix Cat.No.789-002)，每井中加入100μl，以起始補(bǔ)體的溶血作用途徑。滴定板在37℃下孵育60分鐘，隨后，在500xg下離心10分鐘。移取上清液并置于一個平底的微量滴定板上。溶血作用的程度是通過樣品在410nm處的吸收值來測定的。將僅含人類血清的紅細(xì)胞樣品的吸光值A(chǔ)s減去僅含紅細(xì)胞的樣品的吸收值A(chǔ)o，得到最大吸收值(相應(yīng)于最大的溶血作用)Amax。即Amax＝As-Ao。既含有人類血清又含有sCR1的紅細(xì)胞樣品的吸收值與僅含有sCR1的細(xì)胞樣品的吸收值之間的差值被稱為A樣品。抑制率IH用比值(Amax-A樣品/Amax)表示，而IH50為IH＝1/2時的sCR1的濃度。在監(jiān)測層析的分部時，未將無血清的對照包括在內(nèi)，而抗-補(bǔ)體活性是以樣品在410nm處吸收值的降低而作定性監(jiān)測的。
上述的溶血測試也用于評價人類重組sCR1通過其他種的動物(諸如豚鼠及大鼠)的補(bǔ)體而對綿羊紅細(xì)胞胞溶進(jìn)行抑制的能力。對于各種物種，可用新鮮冷凍的血清或新鮮冷凍干燥的血清或血漿作為補(bǔ)體來源。有時血清可以購得(Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo)。
首先對血清溶解活化的紅細(xì)胞的能力進(jìn)行滴定，選樣至少達(dá)到最大紅細(xì)胞解的80%的最大程度的稀釋液，以評價加入的人類sCR1的作用。隨后如上所述，進(jìn)行測試，并在較佳的稀釋度時用動物血清替代人血清。
13.2.2.結(jié)果如圖28所述，純化的sCR1在濃度為0.12μg/ml時，抑制了50%的經(jīng)典的補(bǔ)體-介導(dǎo)的胞溶。將抗體親和純化的sCR1抑制血細(xì)胞胞溶的能力與使用未純化的材料(含有細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的sCR1)的情況作比較。純化的sCR1的活力與未純化的sCR1的活力相比，兩者在溶血測試中在1.6×108血影細(xì)胞/ml時均有50%抑制作用。這就表明，純化步驟未使最終sCR1產(chǎn)物的功能性活力明顯地下降。
為了確定純化的sCR1是否能冷凍保藏，將一份貯于-70℃達(dá)一周。當(dāng)用CR1 ELISA測定及在280nm下測定吸收值時，經(jīng)冷凍的sCR1的濃度與未經(jīng)冷凍者相同，對血細(xì)胞溶解抑制的測定表明冷凍過的sCR1的活力也與未經(jīng)冷凍者相同。
表Ⅸ羅列了人類重組sCR1對于來源于多種物種的補(bǔ)體所介導(dǎo)的血細(xì)胞胞溶的抑制能力。
表Ⅸ采用來源于多種動物血清的補(bǔ)體時，對于致敏的綿羊RBC的血細(xì)胞溶解作用動物 采用血清的 sCR1的 抑制作用IH＊＊ IH＊＊最終濃度 抑制作用 (血影細(xì)胞/ml) (血影細(xì)胞/ml)豚鼠＊ 1∶500 是 66%(2.6×109) 1.0×109人 1∶500 是 94%(2.5×109) 2.0×108人 1∶312 是 94%(1.2×109) 1.0×107大鼠 1∶200 是 85%(2.6×109) 2.4×108大鼠＊ 1∶200 是 77%(3.8×109) 1.0×109狗 1∶50 否兔＊ 1∶20 否小鼠＊ 1∶5 否＊購得的冷凍干燥的血清(Sigma Chemical Co.，St.L ouis，Mo.)＊＊如上文所述(第13.2章節(jié))無論是豚鼠或是大鼠的補(bǔ)體都顯示出被人類sCR1所抑制。對于其他的物種沒有明顯的抑制作用可能反映了(a)在測試系統(tǒng)中采用兔抗體及綿羊紅細(xì)胞不合適，或者(b)在這個系統(tǒng)中血細(xì)胞胞溶需要高濃度的血清。
13.3.C3a及C5a產(chǎn)生的抑制作用13.3.1.方法對補(bǔ)體的抑制能力也可通過對C3a和C5a產(chǎn)生的特異性抑制作用的測試來測定。在所有的實施例中，采用同一個瓶中的人類血清作為補(bǔ)體的來源并分成若干份置于-70℃冷凍。人類IgG(免疫球蛋白G)被熱凝集后，分成若干份置于-70℃下冷凍。在每一個實驗中，每一份血清用要測定的不同濃度的sCR1于37℃進(jìn)行平衡。加入凝集的人類IgG引發(fā)補(bǔ)體作用途徑。每次都包括不含IgG的對照樣品。經(jīng)過15分鐘固定的反應(yīng)時間(這是由先前進(jìn)行的反應(yīng)時間的研究所確定的，這段時間內(nèi)C5a或C3a的產(chǎn)生近乎完全，即大于90%)后，用改良的方法，使用購得的放射免疫測定(RIA)盒(C5aRIA，Amersham Cat NO.RPA.520;C3aRIA，Amersham Cat.NO.RPA.518)用放射免疫測定法對釋放的補(bǔ)體肽(C5a或C3a)的濃度水平進(jìn)行測定。
因為采用的是競爭性的免疫測定法，補(bǔ)體肽(C5a及C3a)濃度和所得計數(shù)呈反比，樣品中結(jié)合的計數(shù)(counts bound(CB)被定作總計數(shù)(每分鐘計數(shù)，cpm)，是在小丸中測定的。
圖29中的y軸代表抑制率。抑制率等于某一“樣品”的結(jié)合計數(shù)(CB)，減去“沒有SCR1樣品”的CB，再除以“無免疫球蛋白對照”的(CB)減去“無SCR1樣品”的CB。
抑制率＝ ([(樣品的CB)-(沒有sCR1的CB)])/([(無IgG的CB)-(無sCR1的CB)])13.3.2.結(jié)果純化的sCR1的活性是通過測試其在一個活化的人類血清樣品中抑制C5a及C3a產(chǎn)生能力來測定的。
如圖29所示，在測試條件下，純化的sCR1可最大程度抑制100%的C5a的產(chǎn)生，60%的C3a的產(chǎn)生。對C5a的產(chǎn)生，當(dāng)sCR1的濃度為5μg/ml時，而對C3a的產(chǎn)生，當(dāng)sCR1的濃度為15-20μg/ml時，可觀察到有50%的抑制作用。這一結(jié)果表明重組sCR1對于C5轉(zhuǎn)化酶的抑制比對C3轉(zhuǎn)化酶的抑制為更有效。
14.例子可溶性CR1在體內(nèi)治療活性中的功能的演示14.1.在反相被動阿圖斯氏反應(yīng)中進(jìn)行可溶性CR1的體內(nèi)功能的演示阿圖斯(Arthus)氏反應(yīng)是一個經(jīng)典的免疫學(xué)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通過局部地注射抗原，隨后在循環(huán)中與抗體反應(yīng)。主要的生物反應(yīng)的特征為，免疫復(fù)合物沉積、補(bǔ)體結(jié)合、多形態(tài)核(PMN)白細(xì)胞浸潤、溶菌酶的釋放、作用于血管的胺的釋放，及局部的組織損傷(參見Uriuhura，T.and Movat，H.Z.，1966，Exp.Mol.Pathol.5539-558;Cochrane，C.G.，1968，Adv.Immunol.997-162)。作為經(jīng)改良的直接的阿圖斯氏反應(yīng)，反相被動阿圖斯反應(yīng)(RPAR)已在確定抗炎癥劑方面用作模型(參見Pflum，L.R.and Graeme，M.L.，1979，Agents and Actions 9184-189)。在RPAR中，局部注射抗體，而抗原存在于循環(huán)中。
當(dāng)在大鼠RPAR模型中測定時，可溶性sCR1可以阻止局部炎癥反應(yīng)。該可溶性CR1在體內(nèi)的這一功能的作用機(jī)制可能是通過抑制補(bǔ)體途徑的酶而介導(dǎo)的抑制。
14.1.1.材料及方法對體重在100-125克范圍內(nèi)的五周齡的Sprague Dawley大鼠(CD株)(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)腹膜內(nèi)注射0.1至0.3ml的三溴乙醇使之麻醉。該溶液為用1克三溴乙醇溶于15mlAmel乙醇中而形成的原液經(jīng)1∶2稀釋而成的。剃去大鼠背部的毛，接著，使鼠尾發(fā)熱，先用熱水后用發(fā)熱的燈泡。采用一個1ml的注射管，將濃度為5mg/ml的溶于0.15M磷酸緩沖鹽的卵白蛋白0.35ml(Calbiochem Corp.，San Diego，CA)在距尾端大約1至2英寸處靜脈注射注入鼠尾靜脈。五分鐘之后，對大鼠皮膚注射0.08ml的濃度為20mg/ml的兔1g，它是抗-卵白蛋白抗體，抗體效價為4mg/ml(Organon TeknikaCorp.，Cappel Division，West Chester，PA)或注射0.08ml 20mg/ml的兔IgG(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)，或注射PBS。每次注射均同樣地施于兩只大鼠，注射區(qū)域用記號筆劃出。隨后在1、4及18小時對大鼠進(jìn)行監(jiān)視。24小時之后，將大鼠埋于干冰中3分鐘而殺死。將注射位點處的皮膚樣品割下，相同的兩個樣品中的一個置于10%福爾馬林固定以供石蠟包埋，而另一個則冷凍以作冰凍切片。制成的組織切片用蘇木素及曙紅染色。
14.1.2.結(jié)果皮膚內(nèi)注射抗卵白蛋白抗體3至5小時之后，才開始可見有微弱的RPAR反應(yīng)(例如水腫及紅斑)。反應(yīng)強(qiáng)度逐漸地加劇，直到24小時之后，反應(yīng)區(qū)域直徑達(dá)到3-5mm(見圖30b)。僅注射非免疫兔IgG或PBS的大鼠皮膚上無反應(yīng)。
在顯微鏡下對取自受損部位的組織切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在真皮上，特別是在血管周圍有許多急性炎癥細(xì)胞(見圖31b)。這都是典型的血管炎及血管周炎所具有的。被觀察的組織顯現(xiàn)了典型的炎癥情況，即在血管外有廣泛的PMN浸潤、結(jié)締組織中存在紅細(xì)胞、及膠原纖維的疏松等。
14.1.3.皮內(nèi)施用可溶性CR1的效果將40μl的0.75mg/ml sCR1與等體積的抗-卵白蛋白或正常兔IgG或PBS混合而制成純化的sCR1混合物。將sCR1抗-卵白蛋白混合物或sCR1兔IgG混合物、或sCR1PBS混合物通過皮內(nèi)注射入已經(jīng)靜脈注射了卵白蛋白的大鼠內(nèi)。僅在注射了sCR1加上抗-卵白蛋白抗體的注射部位出現(xiàn)了可見的損傷(見圖30a)。正如所料，在注射了sCR1兔IgG或sCR1PBS的部位未發(fā)生損傷。當(dāng)用顯微鏡觀察sCR1抗-卵白蛋白注射位點四周的組織切片時，沿血管四周可見PMN簇及單核細(xì)胞簇，但是卻沒有廣泛的PMN浸潤或紅細(xì)胞的外滲(見圖31a)。這些數(shù)據(jù)表明，施用可溶性CR1可引起對內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)的抑制作用。
為了測定在上述的卵白蛋白大鼠模型中，阻止RPAR所必需的sCR1的最低有效數(shù)量，分別地將0.75mg/ml SCR1原液十倍地系列稀釋(即原液、1/10、1/100、1/1000及1/10，000)進(jìn)行測定。對每個sCR1稀釋液與等體積的抗-卵白蛋白抗體的原液或二分之一稀釋液混合。每個注射部位的注射總量為80μl。sCR1抑制RPAR的能力是劑量依賴性的，每個注射位點施用300毫微克時，可明顯地觀察到水腫的減少(見表Ⅹ)。
表ⅩsCR1的劑量對RPAR抑制作用的影響sCR1(微克/位點) RPAR殘留的程度30 +/-3 +/-0.3 +/-0.03 ++0.003 ++++0 ++++14.2.體內(nèi)施用sCR1的藥物動力學(xué)如下對sCR1的體內(nèi)的生物半衰期進(jìn)行測定。對相似周齡(六周)及體重(110-125克)的大鼠，通過靜脈注射含250μg sCR1的注射液0.35ml。分別于注射后2分鐘、5分鐘、10分鐘、60分鐘、及24小時，將大鼠殺死，并用靜脈腔穿刺取出血液。在1800rpm下離心10分鐘，從每只鼠獲得1-2ml血清，用CR1 ELISA對每一樣品中的sCR1的量進(jìn)行測定。將1μg/ml純化sCR1的二倍稀釋液加入對照大鼠血清或無血紅蛋白的血影細(xì)胞(1.6×108個血影細(xì)胞/毫升)的去垢劑胞溶物中作為CR1的標(biāo)準(zhǔn)物。結(jié)果示于表Ⅺ。
表Ⅺ隨時間變化的注射入sCR1的血清濃度變化的藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)靜脈注射后的時間 sCR1濃度(μg/ml)對照 0.012分鐘 0.175分鐘 0.8010分鐘 1.01
60分鐘 0.3824小時 0.49這些數(shù)據(jù)表明，sCR1在靜脈注射后24小時還可被測出。在24小時，sCR1在血清中的水平為注射后10分鐘所觀察到的峰值的一半。
在Sprague Dawley大鼠和Cynomolgus猴(表Ⅻ)中進(jìn)行了附加的研究以進(jìn)一步描述體內(nèi)給藥sCR1的藥物動力學(xué)特征。每個動物接受一次動脈內(nèi)注射，或者單獨注射125I標(biāo)記sCR1(對大鼠為14-28million cpm，對猴為126-153million cpm)，或者注射未標(biāo)記(約1mg/kg)和125I標(biāo)記sCR1的混合物。在2-431研究中，在猴中還測試了1mg/kg或10mg/kg劑量未標(biāo)記sCR1。在表Ⅻ中指明的試樣時間的幾個時間點上從每個動物收集血。在大鼠和猴血中sCR1的清除為二相圖。第一相(α)具短的半衰期，用分鐘測量。此半衰期依賴于劑量，就如猴子研究2-431中，1mg/kg劑量給出t1/2α為9.13分，10mg/kg劑量給出t1/2α為29分。第二相(β)表示出較長的半衰期，用小時表示(見表Ⅻ和圖22)。猴中實驗結(jié)果表明，單次靜脈內(nèi)注射給藥，劑量為1.0和10mg/kg，在猴中沒有觀察到毒性作用的臨床跡象。
表ⅫTP10-HD的藥物動力學(xué)研究2-378 2-592 2-709 2-403 2-431種類 大鼠 大鼠 大鼠 猴 猴數(shù)目 12 4 4 2 2TP10-HD 只有熱的 熱+冷 熱+冷 熱+冷 只有冷的試樣時間 5分鐘- 1- 1- 1分鐘- 1分鐘-72小時 30分鐘 60分鐘 24小時 24小時半衰期 t1/2α＝307 t1/2α＝3.9 t1/2α＝4.3 t1/2α＝6- t1/2α＝9.13小時 分鐘 分鐘 11分鐘 分鐘
(1mg/kg)t1/2α＝4- t1/2α＝29.04.3小時 分鐘(10mg/kg)半衰期由y＝mx+b測定，其中y＝t1/2，時的值，m＝斜率，b＝外推的t。
14.3.sCR1減小大鼠重新輸注(REPERFUSED)梗塞心肌的梗塞區(qū)的大小如上所述的在體外試驗中具有抑制補(bǔ)體途徑C3/C5轉(zhuǎn)化酶活性的能力的sCR1也可在體內(nèi)用于大鼠心肌梗塞模型，可以減少受重新輸注損傷的程度。
大鼠的心肌梗塞可以通過結(jié)扎冠狀血管而引起。如在心肌梗塞發(fā)生后頭幾個小時后進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)重新輸注(reperfusion)可減小梗塞區(qū)大小，改善左心室的功能，因而減少死亡率(參見Braun-wald，E.and Kloner，R.A.，1985，J.Clin.Invest.761713-1719)。然而，重新輸注至已嚴(yán)重局部缺血但并非不可逆的損傷的心肌，其本身可能產(chǎn)生或擴(kuò)大損傷。重新輸注(reperfusion)引起損傷的機(jī)理包括，由于氧自由基及細(xì)胞鈣過載而引起損傷等。白細(xì)胞單獨地或與微血管內(nèi)皮細(xì)胞一起作用可能對可這種損傷起作用。這一過程可能涉及補(bǔ)體的激活(參見Rossen，R.D.，et al.，1985，Cir.Res.57119-130;Crawford，M.H.，et al.，1988，Circulation 781449-1458)。
14.3.1 sCR1抑制大鼠中補(bǔ)體激活及心肌重新輸注損傷(my-ocardial reperfusion injury)給瞬間心肌缺血隨后重新輸注的大鼠服用sCR1。局部缺血，但不是不可逆轉(zhuǎn)地?fù)p傷，重新輸注的心肌的損傷機(jī)制涉及白細(xì)胞依賴性炎癥反應(yīng)(Romson et al.，1983，Circulation 671016;Martin etal.，1988，Circ.Res.63483;Kraemer ＆ Mullane，1989，J.Pharma-col.Exp Therap.251620;Litt et al.，1989，Circulation 801816;Ambrosio et al.，1989，Circulation 801846)，該反應(yīng)也許需要補(bǔ)體激活(Maroko et al.，1978，J.Clin.Invest.61661;Crawfoud et al.，1988，Circulation 781449)。隨機(jī)將動物分組，并給動物靜脈內(nèi)注射單獨的磷酸緩沖鹽水(n＝29)或含1毫克sCR1的磷酸緩沖鹽水(n＝31)，緊接著縫結(jié)使左冠狀動脈閉塞。35分鐘后，拆去縫線，閉合胸腔，將動物放回到籠子中去，7天后，殺死動物，并測量心肌梗塞程度(Weisman et al.，1988，Circulation 78186);7天的間隔可以可靠地評估梗塞區(qū)大小及分析sCR1對梗塞愈合可能有的副作用。在甲氧氟烷(methoxyflurane)麻醉下，將從大鼠中切除下的心臟主動脈插上套管，首先向冠狀動脈輸注Krebs Henseleit溶液，隨后輸注30mMKC1以舒張停搏的心臟。通過冠狀動脈內(nèi)輸注及浸入10%緩沖的福爾馬林固定后，通過計數(shù)正常的全部梗塞的和透壁性(transmurally)梗塞的左心室心肌，以組織學(xué)上分析心臟的橫切片。所有切片的分?jǐn)?shù)區(qū)域的總值可用來計算心肌梗塞大小和透壁性壞死對總壞死的比例。對動物的所有操作和護(hù)理均按照學(xué)院準(zhǔn)則進(jìn)行。僅給予緩沖液組中的大鼠的存活率(29個中24個)和給sCR1處理組中大鼠的存活率(31個中25個)是相似的，在冠狀動脈結(jié)扎后立即死亡在對照大鼠中總共只有一只大鼠。在每組中22個大鼠的冠狀動脈結(jié)扎被認(rèn)為是成功的，它們都符合以下準(zhǔn)則直接心電圖改變與局部缺血一致，前左心室壁青紫;死后有心肌壞死的組織學(xué)上證據(jù)。此結(jié)構(gòu)在所有大鼠中除了二個用sCR1處理的動物外都成功地發(fā)行。對所有存活者，包括沒實行重新輸注的兩個大鼠的分析證明用sCR1處理減少了心肌梗塞大小，在對照大鼠中左心室梗塞大小平均數(shù)為16±2%，在sCR1組中為9±2%(P＜0.01)。在sCR1處理組中透壁性梗塞頻率(25中6個)也比對照大鼠(24個中12個)低(P＜0.04)。
用sCR1處理所有大鼠心臟四部分的心肌梗塞片段厚度總和為7.8±0.4mm，與未處理動物的7.3±0.4mm沒有顯著的區(qū)別，但比這兩組大鼠心臟的遙遠(yuǎn)未梗塞室間隔的要小(sCR1大鼠，9.3±0.2mm，未處理大鼠，9.4±0.2mm)。這兩組的心室內(nèi)腔大小也沒有區(qū)別(sCR1大鼠，64.9±3.6mm3，未處理大鼠，68.9±2.6mm3)。因此，sCR1抑制心肌梗塞大小，但不干擾愈合，其形式是引起心室擴(kuò)張和左心室壁變薄，如在梗塞后一周對心臟所觀察到的。
為測定sCR1抑制組織損傷是否與局部心肌缺血造成抑制補(bǔ)體激活有關(guān)，對另一組緩沖液處理(n＝7)和sCR1處理大鼠(n＝8)也用了同樣的缺血-重新輸注方案。對心臟的評估有通過氮藍(lán)四唑(NBT)染色在(Lillie，R.D，1965，Histopathologic Technic and Practi-cal Histochemistry，Mc GrawHill，New York ed3378)以從存活心肌中描繪出不可逆損傷的區(qū)域，還可通過免疫過氧化物酶染色(DeLeUis，in Basic Techniques of Immunohistochemistry，DeLellis，Ed.，Masson，New York，1981)，用鼠單克隆抗體對大鼠C5b-9膜攻擊復(fù)合物(Schulze et al.，1989，Kidney Int，3560)。如前所述用鼠過氧化物酶-抗過氧化物酶(DAP)系統(tǒng)進(jìn)行免疫染色。這方法所有步驟進(jìn)行前都需先在0.05M Tris緩沖鹽水中洗滌3次，每次10分鐘。切片在丙酮中固定，用0.5%H2O2-甲醇溶液處理5分鐘，4%熱-未激活山羊血清處理1小時;它們?nèi)缓箜槾卧谑覝嘏c2μg/ml初級鼠單克隆抗體孵育18小時，與親和純化F(ab’)2山羊抗鼠抗體抗血清(Organon-Tecknika，West Chester，PA)孵育60分鐘。與鼠PAP孵育60分鐘。切片然后在3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四氫化氯中展開，用Gill’s蘇木精3復(fù)染色。在對照大鼠(N＝7)NBT陰性梗塞區(qū)域中，C5b-9復(fù)合物主要出現(xiàn)在毛細(xì)管和小靜脈內(nèi)皮周圍，而不是在心肌纖維中。相反，在接受SCR的大鼠(n＝8)中，NBT陰性區(qū)域在大小上減少許多，在這些區(qū)域中經(jīng)檢測沒有或有很少C5b-9復(fù)合物，如所示代表性切片所例證。
在這些系列切片中的白細(xì)胞數(shù)量(Ambrosio et al.，1989，Circu-lation 801846)顯示在對照大鼠的梗塞區(qū)域，每平方毫米中有195±28個白細(xì)胞(150高能力區(qū);n＝3)，它們幾乎全部在毛細(xì)管和小靜脈中。接受sCR1的大鼠心臟的相應(yīng)切片中每平方毫米只有83±3白細(xì)胞(n＝4;P＝0.006)，從而表明補(bǔ)體激活的抑制與此型炎癥細(xì)胞的聚集減少有關(guān)。
C5b-9復(fù)合物沿著在內(nèi)皮表面上的位點提示這些細(xì)胞可能是在缺血心肌回流損傷致病中補(bǔ)體激活的初級位點，與冠狀動脈閉塞后24小時后補(bǔ)體蛋白在梗塞心肌上更擴(kuò)散地分布相反(McManus et al.，1983，Lab，Invest，48436)。當(dāng)后者可能簡單地反映壞死組織激活補(bǔ)體的功能時，前者可能表明缺血性緊張內(nèi)皮需要有補(bǔ)體激活功能。內(nèi)皮細(xì)胞對補(bǔ)體激活將是有力的刺激使中性細(xì)胞早期定位到缺血心肌上，C5a激活血管內(nèi)白細(xì)胞及引起它們很快地調(diào)節(jié)起包括CR1和CR3的細(xì)胞受體(Fearon ＆ Collins，1983，J.Immunol.130370;Arnaout et al.，1984，J.Clin Invest.741291)。后者受體表現(xiàn)出促進(jìn)嗜中性細(xì)胞接附到帶有CR3，iC3b配位體的補(bǔ)體激活內(nèi)皮細(xì)胞上(Marks et al.，1989，Nature 339，314)。因此，sCR1抑制補(bǔ)體激活也許可以解釋明顯粘附于內(nèi)皮細(xì)胞的嗜中性白細(xì)胞數(shù)目的減少。
溶血栓劑(thrombolytic agent)重新輸注到缺血心肌減少了梗塞區(qū)大小，改進(jìn)左心室功能，并減少了死亡率，如果該死亡是在冠狀動脈閉塞后幾小時內(nèi)發(fā)生的(Guerci et al.，1987，N，Engl.J.Med.3171613;ISIS-2 Collaborative Group，1988，Lancet ii49;Van de Wenf ＆ Arnold，1988，Br.Med.J.2791374)。但是，也許不可能完全達(dá)到重新輸注的潛在優(yōu)點，因為回流到嚴(yán)重缺血但不是不可逆損傷的心肌可能減少壞死(Becker ＆ Ambrosio，1987，Prog，Cardiovasc，Dis，3023;Braunwald ＆ Kloner，1985，J.Clin.Invest.76713)。認(rèn)為與壞死因果相關(guān)的兩個事件是嗜中性細(xì)胞血管內(nèi)堆積和微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷(VanBenthuysen et al.，1987，J.Clin.Invest.79265)，這兩個都可能是補(bǔ)體激活的結(jié)果?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的sCR1的心肌保護(hù)作用支持補(bǔ)體的中心作用的可能性，延伸了以前補(bǔ)體被眼鏡蛇毒因子排除的研究，并且提供了一種方法以提高溶血栓治療法的不傷害組織潛力。
14.3.2.結(jié)論結(jié)果表明，sCR1處理對于減輕體內(nèi)重新輸注(reperfusion)損傷是有效的，具有可以改善心肌梗塞的病癥的效果。甚至可以在一定程度上改善重新輸注的(reperfusion)損傷，被挽救的心肌的絕對數(shù)量可以增加，而且可以延長重新輸注(reperfusion)在臨床上是用用的時間。用sCR1治療應(yīng)該是伴隨于對急性梗塞時所作的溶血栓處理，如下所述，或囊冠狀血管成形術(shù)治療中的有用的輔助療法。
15.實例可溶性補(bǔ)體受體1(sCR-1)與對甲氧苯?；祟愌w維蛋白溶酶原-鏈激酶-激活劑復(fù)合物(APSAC)的共同制劑將如12.2節(jié)中所述制備的純化sCR-1(0.93毫克在無菌Dulbec-co磷酸緩沖鹽水中，1.0毫升)加入在無菌水(4.0毫升)中復(fù)蘇的一小瓶APSAC中。APSAC制劑具以下成分APSAC 30單位D-甘露醇 100毫克人類血清白蛋白E.P. 30毫克對氨基苯基p’茴香酸鹽·HCl 0.15毫克L-賴氨酸·HCl 35毫克6-氨基己酸 1.4毫克(所有數(shù)字都經(jīng)過一般分析方差)溶液充分混和，用固體CO2使小瓶在-78℃冷凍。產(chǎn)物在2-3毫巴/-60℃(壓縮溫度)真空冷凍干燥24小時，小瓶重新塞住，在-70℃保存。復(fù)蘇時，將小瓶溶于0.1M Hepes，0.15M NaCl pH7.4(1.0毫升)，并置于冰上。測試用的稀釋液也用此Hepes緩沖液制備。作為對照，一瓶單獨的APSAC(同一批)用同樣方式復(fù)蘇，一種新鮮解凍的sCR-1樣品(同一批)也作為對照進(jìn)行了測試。根據(jù)13.2.1節(jié)中所述的方法，測定樣品對補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血的抑制作用，結(jié)果示于下面的表ⅩⅢ。
表ⅩⅢSCR-1/APSAC，APSAC和sCR-1抗溶血活性的比較對照溶血的抑制百分?jǐn)?shù)稀釋液 最終sCR1濃度 sCR-1/APSAC sCR-1 APSAC(ng/ml)1500 465 97.5(1.1) 96.8(1.2) 012500 93 90.9(0.7) 90.6(1.3) 015000 46.5 81.5(2.3) 82.6 ND112500 18.6 54.6(2.4) 51.4(2.6) 0150000 4.65 11.0(2.4) 13.2(0.6) 0＊在括號內(nèi)的數(shù)字是四次重復(fù)測定的標(biāo)準(zhǔn)誤差表Ⅻ中的彎曲排列的數(shù)字給出50%抑制溶血的sCR-1的濃度值，對sCR-1/APSAC為15.7±3.0ng/ml，對單獨SCR-1為16.0±2.9ng/ml。這些數(shù)字沒有差異，結(jié)果表明與一個APSAC藥物劑型的共同制劑并不影響sCR-1的活性。
16.實施例人類CR1的F’異型的分子學(xué)解釋丟失一個C3b結(jié)合位點與改變的功能有關(guān)人類CR1是由編碼分開的C3b或C4b結(jié)合位點的銜接長同源重復(fù)(LHR)片段組成。不等交換的同源重組被假設(shè)成為引起CR1等位基因中LHR總數(shù)不同的遺傳機(jī)制。F異型具有四個LHR，從5’到3’，稱作LHR-A，-B，-C，-D。在LHR-A中的位點優(yōu)先結(jié)合C4b，而在LHR-B和-C中的那些位點優(yōu)先結(jié)合C3b。先前的研究已揭示存在著與LHR-B相似順序的第五個LHR，及在具更高分子量的S異型中的第三個C3b結(jié)合位點。在現(xiàn)今研究中，與較低分子量的F’異型表達(dá)有關(guān)的一個18kb EcoR V片段與一個獨特型cDNA及對LHR-C有特異性的內(nèi)含子探針雜交。LHR-B和一個C3b結(jié)合位點的缺失被假設(shè)成此F’特異性片段出現(xiàn)的機(jī)制。F’異型與SLE相關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制的研究是通過對含一個、二個或三個C3b結(jié)合位點的可溶性sCR1作功能上的比較進(jìn)行的。雖然這三個變異體在作為輔助因子用于切割單體C3b(monomeric C3b)的能力上不表現(xiàn)有顯著的區(qū)別，但它們與兩聚體配位體的相對結(jié)合能力相差有100倍以上。另外，只具有一個C3b結(jié)合位點的變異體在抑制旁路途徑C3和C5轉(zhuǎn)化酶上有效性至少少10倍。這些觀察結(jié)果表明F’異型在其能力上可能已受到破壞，這些能力包括結(jié)合受調(diào)理素作用的免疫復(fù)合物的能力，抑制旁路途徑C3和C5轉(zhuǎn)化酶形成的能力，也許還有介導(dǎo)其它CR1依賴性細(xì)胞應(yīng)答的能力。它們還證明增加C3b結(jié)合位點的價數(shù)可能會促進(jìn)CR1分子的某些功能。
16.1簡介本發(fā)明描述了四種CR1異型體，它們在大小上有30到50KD增加量的區(qū)別。與每個異型有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在增加量上也有約1.4Kb的不同，從而表明它們初級順序中LHR數(shù)目不同(Wong et al.，1983，J.Clin.Invest.72685;Dykman et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.801698;Dykman et al，1984，J.Exp.Med.159691;Dyk-man et al，1985，J.Immunol.1341787;Wong et al.，1986，J.Exp.Med.1641531;Holers et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.842459)。在約250KD的F(或A)異型中，有四個LHR，依次從5’到3’叫作LHR-A，-B，-C，-D(實施例6到7，以上;Wong et al.，1989，J.Exp.Med.169847)。在LHR-A中的頭二個SCR決定其與C4b結(jié)合的能力，而在LHR-B和-C中的相應(yīng)單位決定其與C3b有更高的親和性(實施例9，以上)。用基因組噬菌體克隆的限制性圖譜分析編碼約290KD較大S(或B)異型的基因，發(fā)現(xiàn)存在著第五個LHR，它是LHR-B的5’半部分和LHR-A的3’半部分的嵌合體，并且預(yù)測它含第3個C3b結(jié)合位點(Wong et al.，1989，J.Exp.Med.169847)。在SLE病人中及多重狼瘡家族病人中發(fā)現(xiàn)約210KD的CR1最小F’(或C)異型具較高發(fā)生率(Dykman et al.，1984，J.Exp.Med 159691;Van Dyne et al.，1987，Clin.Exp.Immunol.68570)，此異型可能是由于缺失一個LHR而形成的，其有效結(jié)合包有補(bǔ)體片段的免疫復(fù)合體的能力可能受到損害。以下的數(shù)據(jù)通過用對LHR專一性的內(nèi)含子探針分析表達(dá)此異型的個體中存在的CR1的EcoRV限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)而解釋此F’等位基因的分子基礎(chǔ)。為提供F’異型與SLE之間明顯聯(lián)系的解釋，具有1個，2個或3個C3b識別位點的可溶性sCR1變異體分別對應(yīng)于F’，F(xiàn)，S異型的預(yù)測結(jié)構(gòu)，比較它們結(jié)合二聚配體，作為切割C3b的輔因子，及抑制旁路途徑和經(jīng)典途徑的C3和C5轉(zhuǎn)化酶的能力。
16.2材料和方法DNA的分析從外周血白細(xì)胞制備基因組DNA，用EcoRV酶切，電泳并如前所述用Southern blot分析(Wong et al.，1986，J.Exp.Med.1641531)。CR1 cDNA探針1-1與所有LHR的SCR-4到-7雜交，而探針1-4專一性地與LHR-B和-C的SCR-1和-2雜交(Klickstein et al，1988，J.Exp.Med.1681699;Wong et al.，1989，J.Exp.Med.169847)。非編碼探針PE與在編碼LHR-B和-C的SCR-2的兩個外顯子之間的內(nèi)含子雜交。PX與在編碼LHR-A和-B的SCR-6的兩個外顯子之間的內(nèi)含子雜交，HE與在LHR-A和-B的SCR-7的5’的內(nèi)含子雜交(Wong et al.，1989，J.Exp.Med.169847)(圖34)。通過使跨越整個編碼順序的cDNA探針與F等位基因為純合子的個體得到的基因庫雜交而篩選CR1克隆。如前所述，對含F(xiàn)等位基因的重迭噬菌體克隆作限制性圖譜(Wong et al.，1989，J.Exp.Med.169847)。
表達(dá)載體的構(gòu)建和可溶性SCR1的純化從含整個CR1的F異型的編碼順序的質(zhì)粒pBSABCD中分離得PstⅠ片段，該片段從LHR-A的SCR-5延伸到LHR-B的相應(yīng)位置(實施例8.1，以上)。將它插入已用PstⅠ部分消化而線性化的piABCD中(實施例8.2，以上)，結(jié)果產(chǎn)生了編碼順序與LHR-B一致的第五個LHR。通過限制性酶切圖譜選擇出具有框架內(nèi)插入的一個叫piAB-BCD的克隆。編碼整個細(xì)胞外區(qū)的片段用XhoⅠ和ApaLⅠ消化剪切，并用DNA多聚酶Klenow片段處理。此鈍末端片段與聯(lián)結(jié)子5’-TGAGCTAGCTCA-3’相接，用NheⅠ消化，并插入表達(dá)載體AprM8的XbaⅠ位點處，該載體是CDM8的衍生物(Seed，1987，Nature 329840)。此質(zhì)粒命名為pasecABBCD，在第37個SCR后插入了終止密碼子，并缺乏編碼跨膜和胞質(zhì)區(qū)的順序。質(zhì)粒pasecABCD是用相同的方法將F異型的四個LHR從pBSABCD轉(zhuǎn)入AprM8而做成的。第三個質(zhì)粒只含3個LHR并稱作pasecACD，是通過在框架內(nèi)丟失從LHR-A的SCR-5延伸到LHR-8相應(yīng)位點處的PstⅠ片段而形成的。用30到60微克的上述質(zhì)粒的每一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2×107COS-1細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，洛克維爾，MD)，轉(zhuǎn)染是在400微克/毫升DEAE-葡聚糖，及100μM氯喹存在下，在含高葡萄糖(DMEM)(Hazelton，Lenexa，KS)和10%Nuserum(Collaborative Research，Bed-ford，MA)的Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基中在37℃進(jìn)行4小時。在移去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基后，細(xì)胞于室溫和10%DMSO在無二價陽離子的HBSS中震搖3分鐘(Ausubel et al.，1987，in Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆ Sons and Greene Asso.，New York)，洗滌并培養(yǎng)在DMEM和10%FCS中。在10天內(nèi)每隔48小時收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞殘片，在-70℃冷凍。在解凍上清液時，PMSF和疊氮化鈉依次加入至最終濃度為5mM和0.2%。如前所述在mAbYZ-1-瓊脂糖上通過親和層析純化sCR1，但洗滌緩沖液中不含去垢劑(Wong et al.，1985，J.Immunol.Meth.82303;Example 12.2.1，supra)。純化了的蛋白質(zhì)在1，000體積的PBS中透析二次，以小的等分物在-70℃冰凍。用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)通過Micro BCA試劑盒(Pierce，Rockford，IL)測定出這方法按常規(guī)產(chǎn)生150-200微克sCR1。通過SDS-PAGE在含5%-15%丙烯酰胺線性梯度的凝膠上分析此蛋白質(zhì)。
sCR1的輔助因子活性純化的人類C3(Tack ＆ Prahl，1976，生物化學(xué)154512)用0.5%的TPCK-胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，Mo)在37℃處理5分鐘，加入四倍摩爾過量的大豆胰蛋白酶抑制劑停止該反應(yīng)。用125Ⅰ標(biāo)記C3b，至用Iodogen(Pierce，Rockford，IL)測得比活性為5×105cpm/μg。通過使200ng C3b，100ng因子I(Fearon，1977，J.Immunol.1191248)與不同量的sCR1在20微升PBS在37℃孵育1小時以估計sCR1的輔助因子活性(Wong et al.，1985，J.Immunol.Meth.82303;實施例11，以上)。使樣品在等體積含0.1M二硫蘇糖醇的SDS-PAGE樣品緩沖液中沸騰而停止反應(yīng)。電泳和放射自顯影后，切下對應(yīng)于α’鏈位點處的干膠區(qū)域，用Beckman伽馬計數(shù)器測量放射活性量(Wong et al.，1985，J.Immunol.Meth.82303)。在沒有CR1存在的情況下與α’鏈有關(guān)的計數(shù)做為100%對照。
sCR1與二聚體C3b結(jié)合的能力用二甲基軟木酰亞胺鹽(dimethyl suberimidate)(Sigma，St.Louis，Mo)(Wilson et al.，1982，New Engl.J.Med.307981)或1，6-雙馬來酰亞氨基己烷(1，6-bismaleimidohexane)(Pierce，Rockford，IL)(Weisman et al.，1990，科學(xué)249146)交聯(lián)C3b，通過在含4.5%到30%線性梯度蔗糖的PBS中沉淀以選擇二聚體(Wilson et al.，1982，New Engl.J.Med.307981)。兩個方法中的任一個都產(chǎn)生與紅細(xì)胞CR1結(jié)合的二聚體，聯(lián)合常數(shù)(Ka)在1到3×108M-1之間。300ng125I-C3b二聚體(4×106cpm/μg)與2×108紅細(xì)胞在200微升含0.1%BSA的HBSS中孵育，在增加量的未標(biāo)記單體或二聚體C3b，或不同溶解型的sCR1的存在或不存在下(Weisman et al.，1990，249146)。在冰上置放1小時后，通過鄰苯二甲酸二丁酯離心紅細(xì)胞將結(jié)合細(xì)胞的配體與未結(jié)合材料分離開(Wilson et al.，1982，New En-gl.J.Med.307981)。在過量兔IgG抗CR1存在下，二聚體C3b結(jié)合數(shù)作為非比活性背景，在無任何抑制劑存在下，結(jié)合的比活性計數(shù)作為100%對照。在所有結(jié)合實驗中，用從一個正常個體來的紅細(xì)胞。這些細(xì)胞對F異型是同源的，具有相對較高量的CR-1(約800YZ-1mAb結(jié)合位點)。
對旁路途徑和經(jīng)典途徑的轉(zhuǎn)化酶抑制作用為評估旁路途徑的活化作用，使25%人血清與5×106酵母聚糖顆粒(Dr.Joyce Czop的禮物，Harvard Medical School，Boston，MA)在具有2mM MgCl2和8mM EGTA的佛緊那緩沖鹽溶液中在增加量的sCR1存在或不存在下孵育。為評估經(jīng)典途徑的活化，用60μg/ml熱聚集兔IgG替代酵母聚糖，反應(yīng)在含0.5mM MgCl2和0.15mM CaCl2的佛羅那緩沖鹽溶液中進(jìn)行(Weisman et al.，1990，科學(xué)249146)。在37℃孵育40分鐘后，加入10mM EDTA中止反應(yīng)，用放射免疫分析試劑盒(Amersham，Chicago，IL)測定C3a和C5a切割數(shù)。
16.3結(jié)果CR1的F’等位基因的結(jié)構(gòu)我們在前面已提到過，當(dāng)用EcoRV消化表達(dá)約210KD CR1 F’異型的個體的DNA時，用CR1 cDNA探針1-1進(jìn)行Southern blot時發(fā)現(xiàn)一個附加的18Kb片段(Wong et al.，1986，J.Exp.Med.1641531)(圖33)。此探針原來是從LHR-B的SCR-3到SCR-7衍生而來的，但此順序具有足夠的同源性，能與其它LHR的第四到第七個SCR雜交(實施例6到7，以上;Klickstein et al.，1987，J.Exp.Med.1651095;Klickstein et al.，1988，J.Exp.Med.1681699;Wong et al.，1989，J.Exp.Med.169847)。為了分配每個片段到一個LHR中，跨越整個F等位基因的重迭基因組克隆用EcoRV作圖譜(圖34)。9.4Kb和22Kb的片段依次對應(yīng)于那些預(yù)料來自LHR-A和-D的片段，通過使9.4Kb而不是22Kb片段與內(nèi)含子探針PX和HE雜交而確證了這點(圖33)。因為LHR-B中沒有EcoRV位點，所以在印跡的頂端與所有探針雜交的最大片段代表跨越LHR-B和大部分LHR-C的約32Kb片段(圖33和34)?？缭较惹八鲱愃艭R1假基因的基因組克隆的限制性酶切圖譜(Wong et al.，1989，J.Exp.Med.169847)表明20Kb和15Kb的片段是從此區(qū)域衍生出來的(圖33)。
與F’異型表達(dá)有關(guān)的18Kb EcoRV片段與cDNA探針1-4及內(nèi)含子探針PE雜交，表明它含有LHR-B或-C的5’一半部分。此片段不與內(nèi)含子探針PX和HE雜交，表明它缺失LHR-B的3’一半部分(圖33)。從約32Kb EcoRV片段去除LHR-B或相似長度的另一片段將產(chǎn)生18Kb的片段，它從LHR-A 3’大部分EcoRV位點延伸到LHR-C 5’大部分EcoRV位點(圖34)。預(yù)測此片段僅與探針1-4，PE和1-1雜交，這與圖33中的發(fā)現(xiàn)是一致的。因為任何包含LHR-B的PX和HE位點的約15Kb的缺失必然包括含在LHR-B或-C中的C3b結(jié)合位點的至少一個外顯子，所得的3個LHR的等位基因?qū)⒅痪幋a一個C3b結(jié)合位點。
質(zhì)粒構(gòu)建和可溶性sCR1的純化沒有直接比較CR1異型對受調(diào)理素作用的免疫復(fù)合體或多聚配位體的親和性，因為還沒有對F’異型是純合子的個體進(jìn)行鑒定。完整CR1 cDNA順序的有效性及基因組分析的結(jié)果使我們可以生產(chǎn)具有預(yù)測為不同多態(tài)變異體的結(jié)構(gòu)的sCR1。為估計每個異型的個體CR1分子與C3b二聚體二價相互作用的能力，將終止密碼子插在3’大部分SCR末端和跨膜區(qū)開始部分制得可溶性CR1的cDNA構(gòu)建體。這方法消除了二聚體C3b和分離的，鄰近的膜結(jié)合CR1分子相互作用的可能性。另外，用可溶性CR1可避免干擾酶測定，因為維持膜衍生的制劑的可溶性所需要的去垢劑可能干擾酶測定。用于插入或缺失一個LHR策略是利用保守限制性位點以保存閱讀框架。被插入或缺失的PstⅠ片段編碼LHR-A的SCR-5，-6，-7和LHR-B的SCR-1，-2，-3和-4(圖35)。因為第3個到第7個SCR的氨基酸順序在LHR-A和-B中是一致的(圖35)(實施例6和7，以上)，這些步驟將導(dǎo)致相當(dāng)于LHR-B順序的插入或缺失。質(zhì)粒pasecACD，pasecABCD和pasec ABBCD(圖35)將依次編碼含1個，2個或3個C3b結(jié)合位點的蛋白。
在YZ-1-瓊脂糖上層析可從用CR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分離得可溶性重組CR1。每個sCR1蛋白大于95%純度，三型在SDS-PAGE上在非還原情況下呈現(xiàn)約30kd的增加的Mr區(qū)別，同天然發(fā)生異型所觀察到的相似(圖36)。僅用載體AprM8轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞用35S-半胱氨酸生物合成標(biāo)記，在YZ-1瓊脂糖上不表現(xiàn)CR1類似蛋白質(zhì)的吸收。另外，可溶性sCR1與從125I標(biāo)記紅細(xì)胞分離的CR1的Mr相似，與每個分子僅缺失70氨基酸一致。在含從pase-cABBCD-或pasecABCD-轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離的sCR1的欄中，觀察到具有與較小型相似的Mr的少量蛋白質(zhì)(圖36，欄2和3)。這些可能代表在轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞內(nèi)同時產(chǎn)生的同源重組的產(chǎn)品。
sCR1的輔助因子活性不同型sCR1的功能完整性在輔因子檢測中進(jìn)行測量，其中放射標(biāo)記C3b被轉(zhuǎn)化成iC3b和C3dg片段。50%因子-Ⅰ-介導(dǎo)的C3bα’鏈的切割所需的sCR1量對pasec ABBCD衍生的蛋白質(zhì)為3.5nM，對pasec ACD衍生的蛋白質(zhì)為8nM，對三型只有很小的區(qū)別(圖37)。另外，加入10nM到20nM所有sCR1型可見C3b轉(zhuǎn)化為C3dg。所以可溶性重組CR1，不管其C3b結(jié)合位點數(shù)，保留了結(jié)合C3b的天然分子的能力，并作為因子-Ⅰ切割的輔因子。
sCR1結(jié)合二聚體C3b的能力為評估在結(jié)合C3b包覆靶時具不同LHR-B數(shù)的作用，用sCR1變異體抑制紅細(xì)胞CR1攝取125I-C3b二聚體。50%抑制所需的濃度反應(yīng)了與配位體或細(xì)胞結(jié)合受體的相對結(jié)合。在圖38所示的實驗中，對于125I-C3b二聚體和紅細(xì)胞CR1之間的相互作用的50%抑制作用，需要10nM未標(biāo)記的C3b二聚體。受體與單體C3b的相互作用要弱得多，需要1μM，或多于100倍的此配位體來達(dá)到相似的抑制作用(圖38)。此單體相互作用的低結(jié)合力表示在這些情況下不利于通過二聚C3b配位體的兩個分離的可溶性CR1分子的交聯(lián)而且有效的競爭需要占據(jù)二個分子內(nèi)結(jié)合位點。此兩價相互作用通過50%抑制依次需要10nM和100nM pasec ABCD-和pasec ACD-衍生的sCR1而確定。有趣的是，具有3個C3b結(jié)合位點的pasec ABBCD衍生的sCR1只需要1nM以達(dá)到相似的作用(圖38)。因此具有一個，二個或三個結(jié)合位點的可溶性CR1型在結(jié)合二聚C3b上有區(qū)別，而結(jié)合此配位體的單體時沒區(qū)別，該配位體在因子Ⅰ切割中被用作底物(圖37)。
抑制旁路途徑和經(jīng)典途徑轉(zhuǎn)化酶可溶性CR1變異體阻斷旁路和經(jīng)典途徑轉(zhuǎn)化酶的能力是通過測量用酵母聚糖或聚集IgG孵育人血清時釋放的C3a和C5a而加以比較。旁路途徑C3和C5轉(zhuǎn)化酶活性抑制達(dá)到50%只需要1到2nMpasec ABBCD或pasec ABCD衍生的sCR1，而達(dá)到相似的作用需要多于30倍的pasec ACD sCR1(圖39A和40A)。這與SCR1變異體結(jié)合C5轉(zhuǎn)化酶中C3b同聚體上有區(qū)別的預(yù)測是一致的(Kinoshita et al.，1988，J.Immunol.1413895)。對C3轉(zhuǎn)化酶可見同樣的作用，這表明與備解素穩(wěn)定C3b Bb復(fù)合物有關(guān)的C3b多重分子的存在。相反，觀察到sCR1變異體抑制經(jīng)典途徑C3和C5轉(zhuǎn)化酶的能力上沒有很大的區(qū)別(圖39B和40B)，這表明它們與C4bC2a復(fù)合物中C4b分子或C5轉(zhuǎn)化酶的C4b/C3b異聚體相似地結(jié)合(Takata et al.，1987，J.Exp.Med.1651494)。另外，除了pasec ACD衍生的分子外，抑制經(jīng)典途徑的酶相對于旁路途徑需多于2到10倍的重組CR1，這也許反映了sCR1對含C4b的轉(zhuǎn)化酶結(jié)合較低。
16.4討論由與每個異型有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本中約1.3kb區(qū)別預(yù)測人類CR1的每個多態(tài)變異體由不同數(shù)目的LHR編碼(Wong et al.，1986，J.Exp，Med，1641531;Helers et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA842459)。在CR1基因的不同LHR的編碼區(qū)域同源性及相應(yīng)非編碼區(qū)域的同源性之間的平行使我們可以根據(jù)基因組克隆的限制性圖譜預(yù)測編碼順序。因此，預(yù)測具有類似于LHR-B的5’半部分及類似于LHR-A的3’半部分的S等位基因中的第5個LHR編碼S異型中對C3b的第3個結(jié)合位點(Wong et al.，1989，J.Exp.Med 169847)。因為EcoRV是十九個中唯一的一個可揭示與F’異型有關(guān)的RFLP的限制性內(nèi)切酶(Wong et al.，1986，J.Exp.Med.1641531)，此等位基因中的一個缺失明顯地涉及一高度同源性區(qū)域。在此研究中，與表達(dá)F’異型個體有關(guān)的18Kb EcoRV片段(Wong et al.，1986，J.Exp Med 1641531)與對LHR-C呈專一性的外顯子及內(nèi)含子衍生的探針的組合雜交。此形式僅與缺失LHR-B或一個同等的區(qū)域而丟失一個C3b結(jié)合位點一致。我們不能肯定這18Kb片段的出現(xiàn)將伴隨有從LHR-B和-C衍生的約30Kb片段在Southern blot上的消失，因為沒有可用來比較的F’等位基因為純合子的個體。雖然通過任意剪切可能產(chǎn)生此異型的較小轉(zhuǎn)錄本(Wong et al.，1986.J.Exp.Med.1641531;Holers et al.，1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842459)，但是，這些機(jī)制不能解釋所觀察到的EcoR Ⅴ RFLP。
F’異型與SLE的相關(guān)聯(lián)是與這變異體可能消除了結(jié)合受調(diào)理素作用的免疫復(fù)合物能力的提議一致(DyKman et al.，1984，J.Exp.Med.159691;Van Dyne et al.，1987，Clin.Exp.Immunol 68570)。我們比較了LHR-B數(shù)目不同的sCR1的功能性能力。在最近的研究中可溶性CR1有效競爭C3b二聚體攝取表明可能發(fā)生串聯(lián)的結(jié)合位點的占據(jù)(Weisman et al.，1990，科學(xué)249146)，因此可以直接測定每個受體分子與此二價配位體的結(jié)合。我們的方法在插入終止密碼子的位點處及所用的可溶性CR1上均不同，該CR1是從用編碼含1個，2個或不含LHR-B的CR1分子的質(zhì)粒充分轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中純化的(圖35)。50%抑制放射標(biāo)記二聚C3b同紅細(xì)胞結(jié)合所需的單體或二聚C3b和pasec ABCD衍生的重組CR1的量與較早的一個報道中的那些一致(Weisman et al.，1990，科學(xué)249146)。而且，純化的sCR1與二聚C3b的結(jié)合隨著增加一個C3b結(jié)合位點而增加10倍，從而導(dǎo)致從pasecACD或pasecABBCD衍生的sCR1分子中間相差100倍的區(qū)別(圖38)。與以前觀察到的在LHR-A中的C3b結(jié)合位點保留了對C3b的低的親和力一致(Klickstein et al.，1988，J.Exp Med 1681699)，僅有LHR-A和-C的pasec ACD衍生的sCR1在阻斷攝取放射標(biāo)記二聚體上比C3b單體更有效(圖38)。所觀察到的pasec ABBCD衍生的sCR1相對于pasec ABCD衍生的分子更高的結(jié)合相似地提示有兩對結(jié)合位點的接合(圖38)，并且確定了以前的假設(shè)，即這樣的LHR的串聯(lián)排列有利于多價相互作用(Klickstein et al.，1988，J.Exp.Med.1681699;Wong et al.，1989，J.Exp.Med.169847)。因為對單體C3b的CR1結(jié)合相對低(圖38)，在此(圖37)及其研究中(Seya et al.，1985，J.Immunol.1352661)，不同sCR1型在輔助因子能力上缺少明顯的區(qū)別表明所用的這條件不利于單聚配位體同時占據(jù)多于一個的活性位點。
可溶性CR1變異體在阻斷旁路途徑C3和C5轉(zhuǎn)化酶上的有效性的不同與它們對C3b同二聚體的差別親和力一致(Kinoshita et al.，1988.J.Immunol.1413895)。實際上，在此檢測中，具有2個或更多個C3b結(jié)合位點的sCR1變異體比只有一個位點的那些至少有效性多30倍(圖39A和40A)。但是，pasec ABBCD衍生的sCR1不比從pasec ABCD衍生的更有效(圖39A和40A)，雖然其結(jié)合在液相試驗中更高(圖38)。這樣，在此試驗中它的全部功能可能受活性表面轉(zhuǎn)化酶位點的局部分布的限制。因為所有研究的三個變異體保留了一個C4b位點和至少一個鄰近的C3b位點，它們的結(jié)構(gòu)與它們抑制經(jīng)典途徑轉(zhuǎn)化酶的類似能力一致(圖39B和40B)(Takata et al.，1987，J.Exp.Med.1651494)。我們的發(fā)現(xiàn)與另一個實驗的那些之間不同，這可用以前所用的是更不穩(wěn)定的液相轉(zhuǎn)化酶和F(或A)及F’(或C)異型的混合物，而不是純化型的來解釋(Seya et al.，1985，J.Im-munol，1352661)。另一個解釋是那個實驗中用的F’變異體具有不同的LHR組合物。
雖然由CR1攝取免疫復(fù)合物的有效性是通過此受體在紅細(xì)胞上簇聚而提高(Paccaud et al.，1988，J.Immunol.1413889;Chevalier ＆ Kazatchkine，1989，J.Immunol.1422031)，具有較少CR1數(shù)目的個體可能具有更少簇的此受體，及每簇更少受體分子(Paccaud et al.，1988，J.Immunol.1413839)。這樣在SLE病人中F’異型及低數(shù)量的CR1存在可能導(dǎo)致總數(shù)更少的C3b和C4b結(jié)合位點，以及在循環(huán)中清除免疫復(fù)合物時降低的效率(Dykman et al.，1984，J.Exp.Med.159691;Van Dyne et al.，1987，Clin.Exp.ImmunoI.68570;Wilson et al.，1987，Immunol.Res.6192;Miyakawa et al.，1981，Lancet ii493;Schifferli et al.，1988，J.Immunol.140899)。所觀察到的sCR1對經(jīng)典途徑轉(zhuǎn)化酶較低的親和力(圖39和40)表明沉積在可溶性免疫復(fù)合物上的C4b和C3b的相對量對CR1依賴性攝取和加工可能是關(guān)鍵的。在某些情況下，中性白細(xì)胞中預(yù)簇集CR1的缺乏(Paccaud et al.，1990，Eur.J.Immunol 20283)提示誘導(dǎo)受體聚集的機(jī)制對激發(fā)有核細(xì)胞中的生物反應(yīng)是重要的(Daha et al.，1984，J.Immunol.1321197);Bacle et al.，1990，J.Immunol.144147)。更短的CR1異型可能進(jìn)一步減少這種作用的有效性，并且導(dǎo)致?lián)p害在組織炎性部位處受體介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
17.微生物保藏帶有質(zhì)粒piABCD且編碼全長CR1蛋白質(zhì)的E.coli菌株DK1/P3(稱之pCR1-piABCD)已于1988年3月31日保藏在美國伊利諾斯州、皮奧里亞、農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物收集處(NRRL)。保藏號為B-18355。
帶有編碼可溶性CR1分子的質(zhì)粒pBSCR1c/PTCSgpt克隆35.6的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系DUXB11已于1989年3月23日由美國、馬里蘭州，羅克維萊的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏，保藏號為CRL10052。
本發(fā)明并不限于由保藏的微生物所規(guī)定的范圍，因為具體保藏的微生物為本發(fā)明的一方面的一個實例，而功能上等同的任何微生物均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。當(dāng)然，除了本文中所說明和敘述的之外，自上述的說明書和附圖得出的本發(fā)明的各種改進(jìn)對于本技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，這樣一些改進(jìn)均包括在以下的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
還應(yīng)指出，文中所給核苷酸的所有堿基對大小均是近似的且用于敘述的目的。
這里引用了各種參考資料，本申請結(jié)合參考資料已全文公開。
權(quán)利要求
1.一種核酸順序，其特征在于它包括一基本如圖1所示的編碼整長度CR1蛋白的核苷酸順序，從核苷酸號28到6147。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的順序，其特征在于它包括-DNA順序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的順序，其特征在于它包括RNA順序。
4.一種重組核酸載體，其特征在于它包括權(quán)利要求1的順序。
5.一種重組核酸載體，其特征在于它包括權(quán)利要求2的順序。
6.一種重組DNA載體，其特征在于它包括pABCD。
7.一種重組DNA載體，其特征在于它包括由NRRL保藏的，保藏號為B-18355的piABCD。
8.一種重組表達(dá)載體，其特征在于它包括權(quán)利要求1的順序。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其特征在于它能夠在細(xì)菌中表達(dá)順序。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其特征在于它能夠在一個哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)順序。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體，其特征在于它包括由NRRL保藏，保藏號為B-18355的piABCD。
12.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括權(quán)利要求1的順序。
13.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括一含有權(quán)利要求4的核酸載體的細(xì)胞。
14.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括一含有權(quán)利要求5的核酸載體的細(xì)胞。
15.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括一含有權(quán)利要求8的核酸載體的細(xì)胞。
16.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括一含有權(quán)利要求10的核酸載體的細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求12、13或14所述的重組細(xì)胞，其特征在于它包括一種細(xì)菌。
18.一種大腸桿菌(Escherichia coli)，由NRRL保藏，保藏號為B-18355。
19.一種核酸順序，其特征在于它包括基本上如圖1所示的從核苷酸編號28到1533的順序。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸順序，其特征在于它編碼一基本缺乏跨膜區(qū)的蛋白。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的核酸順序，其特征在于CR1分子由在其中表達(dá)的細(xì)胞分泌。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸順序，其特征在于經(jīng)測試體外抑制嗜中性粒細(xì)胞的氧化突增、補(bǔ)體介導(dǎo)溶血作用或者C3a和C5a產(chǎn)生的能力，該CR1分子是功能性的。
23.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21所述的核酸順序，其特征在于它包括-DNA順序。
24.根據(jù)權(quán)利要求19、20或21所述的核酸順序，其特征在于它包括RNA順序。
25.一種重組核酸載體，其特征在于它包括權(quán)利要求19或20的順序。
26.一種重組核酸載體，其特征在于它包括權(quán)利要求21或22的順序。
27.一種重組表達(dá)載體，其特征在于它包括權(quán)利要求19的順序。
28.一種重組表達(dá)載體，其特征在于它包括權(quán)利要求20的順序。
29.一種重組表達(dá)載體，其特征在于它包括權(quán)利要求21的順序。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的重組表達(dá)載體，其特征在于它是從由pBSCR1c、pBSCR1s、pBM-CR1c、pBSCR1c/PTCSgpt以及pBSCR1s/pTCSgpt組成的組中選出來的。
31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的表達(dá)載體，其特征在于它是從由pT-CR1c1、pT-CR1c2、pT-CR1c3、pT-CR1c4以及pT-CR1c5組成的組中選出來的。
32.一種重組DNA載體，其特征在于它包括由ATCC保藏，保藏號為CRL10052的質(zhì)粒pBSCR1c/pTCSgpt。
33.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括權(quán)利要求19、20或21的順序。
34.如權(quán)利要求33所述的重組細(xì)胞，其特征在于它包括細(xì)菌。
35.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括一含有權(quán)利要求25的載體的細(xì)胞。
36.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括一含有權(quán)利要求26的載體的細(xì)胞。
37.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括一種含有權(quán)利要求27的載體的細(xì)胞。
38.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括一含有權(quán)利要求28載體的細(xì)胞。
39.一種重組細(xì)胞，其特征在于它包括一含有權(quán)利要求29的載體的細(xì)胞。
40.一種中國倉鼠卵巢細(xì)胞DUXB11，其特征在于它帶有由ATCC保藏，保藏號為CRL10052的質(zhì)粒pBSCR1c/pTCSgpt。
41.一種蛋白質(zhì)，其特征在于它包括基本上如圖1所示的氨基酸順序。
42.一種權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)片段，其特征在于它有結(jié)合C3b的能力。
43.一種權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)片段，其特征在于它有結(jié)合C4b的能力。
44.一種權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)片段，其特征在于它有能夠結(jié)合C3b和結(jié)合C4b的能力。
45.一種權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)片段，其特征在于它具有因子Ⅰ輔助因子活性。
46.一種權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)片段，其特征在于它能抑制C3轉(zhuǎn)化酶活性。
47.一種權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)片段，其特征在于它能抑制C5轉(zhuǎn)化酶活性。
48.根據(jù)權(quán)利要求41所述的蛋白質(zhì)或其含24個氨基酸的片段，其特征在于它是糖基化的。
49.根據(jù)權(quán)利要求41所述的蛋白質(zhì)，其特征在于它未被糖基化。
50.根據(jù)權(quán)利要求41所述的蛋白質(zhì)，其特征在于它表達(dá)為一細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。
51.一種蛋白質(zhì)，包括基本上如圖1所示從編號28到1533的核苷酸編碼的氨基酸順序。
52.一種核酸順序，其特征在于它編碼權(quán)利要求51的蛋白質(zhì)。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的蛋白質(zhì)，其特征在于它基本上缺乏一跨膜區(qū)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的蛋白質(zhì)，其特征在于它由表達(dá)它的細(xì)胞所分泌。
55.一種CR1分子，其特征在于它基本上缺少一跨膜區(qū)。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的CR1分子，其特征在于它在細(xì)胞中表達(dá)并被此細(xì)胞所分泌。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的CR1分子，其特征在于它未被糖基化。
58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的CR1分子，其特征在于它是糖基化的。
59.根據(jù)權(quán)利要求55所述的CR1分子，其特征在于經(jīng)檢測其體外抑制嗜中性粒細(xì)胞的氧化突增、補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血作用或者C3a和C5a產(chǎn)生的能力，表明它是功能性的。
60.根據(jù)權(quán)利要求55所述的CR1分子，其特征在于它是從由pBSCR1c、pBSCR1s、pBM-CR1c、pBSCR1c/pTCSgpt以及pBSCR1s/pTC-Sgpt組成的組中選擇出來的一種核酸載體所編碼。
61.根據(jù)權(quán)利要求55所述的CR1分子，其特征在于它是從由pT-CR1c1、pT-CR1c2、pT-CR1c3、pT-CR1c4以及pT-CR1c5組成的組中選擇出來的一核酸載體所編碼。
62.根據(jù)權(quán)利要求55所述的CR1分子，其特征在于它由帶有由ATCC保藏，保藏號為CRL10052的質(zhì)粒pBSCRIC/pTCSgpt的一中國倉鼠卵巢細(xì)胞DUXB11表達(dá)。
63.一種重組細(xì)胞，其特征在于它在其表面上表達(dá)權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)。
64.一種重組細(xì)胞，其特征在于它表達(dá)權(quán)利要求42、43或45的蛋白質(zhì)。
65.一種重組細(xì)胞，其特征在于它表達(dá)權(quán)利要求51的蛋白質(zhì)。
66.一種重組細(xì)胞，其特征在于它表達(dá)權(quán)利要求55的蛋白質(zhì)。
67.一種重組細(xì)胞，其特征在于它表達(dá)權(quán)利要求56的蛋白質(zhì)。
68.一種重組細(xì)胞，其特征在于它表達(dá)權(quán)利要求41的包括24個氨基酸的蛋白質(zhì)片段，這片段由該細(xì)胞分泌。
69.一種CR1蛋白質(zhì)或其片段的純化方法，其特征在于它包括(a)獲得含有CR1蛋白質(zhì)或片段的樣品;(b)使所說的樣品經(jīng)陽離子交換高壓液相層析;(c)從高壓液相層析柱洗脫所說的蛋白質(zhì)或片段。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于在步驟(c)之后還包括(d)使所說的蛋白質(zhì)或片段經(jīng)陰離子交換高壓液相層析;(e)從步驟(d)的高壓液相層析柱洗脫所說的蛋白質(zhì)或片段。
71.根據(jù)權(quán)利要求91或92所述的方法，其特征在于CR1蛋白質(zhì)或片段基本上缺少一跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。
72.一種CR1分子的純化方法，其特征在于它包括(a)在培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)一種基本上缺少跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)的CR1分子，并使它分泌;(b)獲得含有CR1分子的細(xì)胞培養(yǎng)液的樣品;(c)使所說的樣品經(jīng)陽離子高壓液相層析;(d)從高壓液相層析柱上洗脫所說的CR1分子。
73.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于在步驟(c)之后還包括(d)使所說的分子經(jīng)陰離子交換高壓液相層析;(e)從步驟(d)的高壓液相層析柱洗脫所說的分子。
74.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求12的細(xì)胞生長。
75.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求13的細(xì)胞生長。
76.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求14的細(xì)胞生長。
77.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求15的細(xì)胞生長。
78.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求33的細(xì)胞生長。
79.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求34的細(xì)胞生長。
80.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求35的細(xì)胞生長。
81.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求36的細(xì)胞生長。
82.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求37的細(xì)胞生長。
83.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求38的細(xì)胞生長。
84.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求39的細(xì)胞生長。
85.一種產(chǎn)生CR1分子的方法，其特征在于它包括使權(quán)利要求40的細(xì)胞生長。
86.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補(bǔ)體活性的疾病的病人的治療方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)或其包含24個氨基酸的片段。
87.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補(bǔ)體活性的疾病的病人的治療方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求42或43的片段。
88.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補(bǔ)體活性的疾病的病人的治療方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求40、41或45的片段。
89.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補(bǔ)體活性的疾病的病人的治療方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求51、53或54的片段。
90.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補(bǔ)體活性的疾病的病人的治療方法，其特征在于它包含給病人權(quán)利要求55的分子。
91.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補(bǔ)體活性的疾病的病人的治療方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求56的分子。
92.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補(bǔ)體活性的疾病的病人的治療方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求59的分子。
93.一種患有免疫性疾病或者涉及不希望有的或不合適的補(bǔ)體活性的疾病的病人的治療方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求62的分子。
94.一種治療或防止心肌梗塞對病人造成損傷的治療方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)或其含24個氨基酸的片段。
95.一種治療或預(yù)防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求55的分子。
96.一種治療或預(yù)防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求56的分子。
97.一種治療或預(yù)防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求59的分子。
98.一種治療或預(yù)防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求60或61的分子。
99.一種治療或預(yù)防心肌梗塞引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求62的分子。
100.一種治療或預(yù)防由于炎癥所引起的病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求41的蛋白質(zhì)或其包括24個氨基酸的片段。
101.一種治療或預(yù)防由于炎癥所引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求55的分子。
102.一種治療或預(yù)防由于炎癥所引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求56的分子。
103.一種治療或預(yù)防由于炎癥所引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求59的分子。
104.一種治療或預(yù)防由于炎癥所引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求60或61的分子。
105.一種治療或預(yù)防由于炎癥所引起病人損傷的方法，其特征在于它包括給病人權(quán)利要求62的分子。
106.一種分子，其特征在于它包括權(quán)利要求42、43或44的片段。
107.一種分子，其特征在于它包括權(quán)利要求45、46或47的片段。
108.一種分子，其特征在于它包括權(quán)利要求55、56或59的片段。
109.一種分子，其特征在于它包括權(quán)利要求60、61或62的片段。
110.一種藥物組合物，其特征在于它包含有效量的權(quán)利要求42、43或45的蛋白質(zhì)或片段，及藥理學(xué)上合格的載體。
111.一種藥物組合物，其特征在于它包含有效量的權(quán)利要求55、56或59的蛋白質(zhì)或片段，及藥理學(xué)上合格的載體。
112.一種藥物組合物，其特征在于它包含有效量的權(quán)利要求60、61或62的蛋白質(zhì)或片段，及藥理學(xué)上合格的載體。
113.一種治療人類和動物中血栓形成疾病的方法，其特征在于它包括給需要的人或動物有效量的可溶性CR1蛋白質(zhì)，及有效量的溶血栓劑。
114.根據(jù)權(quán)利要求113的方法，其中可溶性CR1蛋白質(zhì)和溶血栓劑是同時給藥的。
115.根據(jù)權(quán)利要求113的方法，其特征在于CR1蛋白質(zhì)是由從由pBSCR1c，pBSCR1s，pBM-CR1c，pBSCR1c/pTCSgpt，和pBSCR1s/pTCSgpt組成的組中選出的核酸載體編碼的。
116.根據(jù)權(quán)利要求113的方法，其中溶血栓劑是血纖維蛋白溶酶原激活劑。
117.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其特征在于溶血栓劑是從下列組中選出的，包括組織血纖維蛋白激活劑或其突變蛋白質(zhì)，單鏈尿激酶，雙鏈尿激酶，鏈激酶，及血纖維蛋白活性雜合蛋白質(zhì)，該雜合蛋白質(zhì)包括雙鏈蛋白酶中的一條鏈與另一不同雙鏈蛋白酶的一條鏈結(jié)合，其中至少有一條鏈來自血纖維蛋白溶解活性蛋白酶，這樣雜合蛋白質(zhì)有對血纖維蛋白溶解活性重要的催化位點，它可任意地被可移動的阻斷基團(tuán)所阻滯。
118.根據(jù)權(quán)利要求113的方法，其特征在于溶血栓劑是一種體內(nèi)被可逆性阻斷的血纖維蛋白溶解酶，其中對血纖維蛋白溶解活性重要的催化位點被一基團(tuán)所阻斷，當(dāng)水解準(zhǔn)一級速率為10-6/秒至10-3/秒，在等滲含水介質(zhì)中，pH7.4，37℃時，該基團(tuán)可被移動。
119.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其特征在于該溶血栓劑是甲氧苯甲?；溂っ?血纖維蛋白溶酶原-激活劑復(fù)合物(APSAC)。
120.一種藥物組合物，其特征在于它包括可溶性CR1蛋白，一溶血栓劑，以及藥理學(xué)上合格的載體或賦形劑。
121.根據(jù)權(quán)利要求120的藥物組合物，其特征在于溶血栓劑是甲氧苯甲?；溂っ?血纖維蛋白溶酶原激活劑復(fù)合物(APSAC)。
122.根據(jù)權(quán)利要求120所述的一種藥理學(xué)組合物，其特征在于可溶性CR1蛋白質(zhì)由中國倉鼠卵巢細(xì)胞DUX B11表達(dá)，該細(xì)胞含有在ATCC保藏，保藏號為CRL 10052的質(zhì)粒pBSCR1c/pTCSgpt。
123.一種分子，其特征在于它包括部分基本如圖1所示氨基酸順序的分子，該部分能結(jié)合C3b，該分子至少包括2個LHR-B順序拷貝。
124.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其特征在于該病人是非人類動物。
125.根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其特征在于該病人是非人類動物。
126.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于該病人是非人類動物。
127.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其特征在于該病人是非人類動物。
128.根據(jù)權(quán)利要求100所述的方法，其特征在于該病人是非人類動物。
129.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其特征在于該病人是非人類動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及C3b/C4b受體(CR1)基因及其編碼的蛋白質(zhì)。還涉及CR1核酸順序及其含70核苷酸的片段和其編碼的含24氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了CR1蛋白質(zhì)及其片段的表達(dá)。本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)用于涉及補(bǔ)體活性的疾病、各種免疫系統(tǒng)或炎癥疾病的診斷和治療。本發(fā)明實施例敘述全長CR1cDNA及其片段的克隆、核苷酸順序及推斷的氨基酸順序、CR1蛋白質(zhì)及其片段的表達(dá)，以及缺少跨膜區(qū)的分泌CR1分子表達(dá)。該分泌CR1分子可減少炎癥引起的損傷，減小心肌梗塞的大小及防止重輸注損傷。
文檔編號C12N15/12GK1060112SQ90109580
公開日1992年4月8日 申請日期1990年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1989年9月26日
發(fā)明者道格拉斯·T·費, 勞慢德·B·克里克斯特, 溫尼·W·王, 熱拉爾德·R·卡森, 邁克爾·F·孔奇諾, 斯蒂芬·H·Ip, 薩瓦斯·C·C馬克里德斯, 亨利·C·馬奇·Jr 申請人:約翰斯霍普金斯大學(xué), 布里格姆和婦女醫(yī)院T細(xì)胞科學(xué)集團(tuán)