T細胞受體的制作方法
【專利說明】T細胞受體
[0001] 本發(fā)明涉及結(jié)合衍生自甲胎蛋白（AFP)的HLA-A2限制的FMNKFIYEI (158-166)肽 表位的T細胞受體（TCR)。本發(fā)明的某些優(yōu)選的TCR顯示對該AFP表位的出色結(jié)合性質(zhì)和 特異性概況。
[0002] AFP在胎兒發(fā)育期間表達并且是胎兒血清的主要成份。在發(fā)育期間，該蛋白 由卵黃囊和肝臟以高水平產(chǎn)生并且在之后被抑制。AFP表達經(jīng)常在肝細胞癌中再激活 (Butterfield 等，J Immunol.，2001 年 4 月 15 日；166 (8) :5300-8)并且高水平的該蛋白質(zhì) 被用作疾病的診斷標(biāo)志物。
[0003] 在美國，肝細胞癌是報告5年存活率最低的所有惡性腫瘤之一，總的每年發(fā)病為 120萬，并且由于乙型肝炎和丙型肝炎的流行而可能上升。治療一般包括手術(shù)，然而，這只是 在疾病的早期進行時有益。因此，需要新的治療。
[0004] 存在4種已知的衍生自AFP的表位：AFP158、AFP137、AFP325和 AFP542 (Butterfield 等，J Immunol·，2001 年4月 15 日；166 (8) :5300-8 和Butterfield 等，Cancer Res. 1999,59 :3134-3142) DHLA-A2 限制的 AFP158 表位 FMNKFIYEI (SEQ ID No: 1)提供了新型免疫治療介入的合適靶標(biāo)；該肽經(jīng)天然加工并從IfepG2(HLA-A2陽性）干細 胞系中洗脫并通過質(zhì)譜檢測（Butterfield等，J Immunol.，2001年4月15日；166(8): 5300-8)。已經(jīng)針對 AFP158 (和 AFP137)生成 T 細胞克?。≒ichard 等，J Immunother. 2008 年4月；31 (3) :246-53)。然而，還未報道識別這種肽的T細胞受體。
[0005] 按照本發(fā)明的第一個方面，提供了一種非天然產(chǎn)生和/或純化和/或工程改造的 T細胞受體（TCR)，其具有結(jié)合FMNKFIYEI (SEQ ID No: 1)HLA-A2復(fù)合物的性質(zhì)并且包含至 少一個TCRa鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或至少一個TCR β鏈可變結(jié)構(gòu)域，
[0006] a鏈可變結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID No :2的氨基酸殘基1-112的序列有至少90%相 同性的氨基酸序列，和/或
[0007] β鏈可變結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID No :3的氨基酸殘基1-112的序列有至少90%相 同性的氨基酸序列。
[0008] 在本發(fā)明的一些實施方式中，a鏈可變結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID No :2的氨基酸殘基 1-112 至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 的序列相同性。
[0009] β鏈可變結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID No :3的氨基酸殘基1-112至少91 %、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列相同性。
[0010] 使用國際免疫遺傳學(xué)（MGT) TCR命名描述TCR并且連接到TCR序列的頂GT公共 數(shù)據(jù)庫。天然α-β異二聚體TCR具有a鏈和β鏈。廣泛地，各鏈包含可變、連接和恒定 區(qū)，并且β鏈通常含有可變區(qū)和連接區(qū)之間的短多變區(qū)，但是該多變區(qū)通常被認(rèn)為是連接 區(qū)的部分。各可變區(qū)包含包埋于構(gòu)架序列中的3個CDR(互補決定區(qū)），一個是稱為CDR3的 高變區(qū)。存在幾種類型的a鏈可變區(qū)（Va)和幾種類型的β鏈可變區(qū)（Vi3)，它們通過它 們的構(gòu)架、⑶Rl和⑶R2序列，以及通過部分限定的⑶R3序列區(qū)分。V a型在頂GT命名中由 獨特的TRAV數(shù)指代。因此，"TRAV21"定義具有獨特構(gòu)架和⑶Rl以及⑶R2序列和⑶R3序 列的TCR V a，該⑶R3部分被氨基酸序列定義，該氨基酸序列在TCR之間保守，但是其也包 含TCR之間變化的氨基酸序列。以相同的方式，"TRBV5-1"定義了具有獨特的構(gòu)架與CDRl 和⑶R2序列，但是僅僅有部分定義的⑶R3序列的TCR V β區(qū)。
[0011] 類似地，TCR的連接區(qū)由獨特頂GT TRAJ和TRBJ命名所定義，并且恒定區(qū)由頂GT TRAC和TRBC命名所定義。
[0012] β鏈多變區(qū)在頂GT命名中以縮寫TRBD提及并且如上所述，級聯(lián)的TRBD/TRBJ區(qū) 通常一起被認(rèn)為是連接區(qū)。
[0013] α β TCR的α和β鏈一般被認(rèn)為各自具有稱為可變和恒定結(jié)構(gòu)域/區(qū)的2個"結(jié) 構(gòu)域"或"區(qū)"。術(shù)語"結(jié)構(gòu)域"和"區(qū)"在本文中可互換使用。可變結(jié)構(gòu)域由可變區(qū)和連接 區(qū)的級聯(lián)組成。在本申請的說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語"TCRa可變結(jié)構(gòu)域"因此是指TRAV 和TRAJ區(qū)的級聯(lián)，并且術(shù)語TCR α恒定結(jié)構(gòu)域是指胞外TRAC區(qū)或者是指C-末端截短的 TRAC序列。類似地，術(shù)語"TCRf3可變結(jié)構(gòu)域"是指TRBV和TRBD/TRBJ區(qū)的級聯(lián)，并且術(shù)語 TCR β恒定結(jié)構(gòu)域是指胞外TRBC區(qū)或者是指C-末端截短的TRBC序列。
[0014] 由頂GT命名定義的獨特序列是TCR領(lǐng)域工作人員廣泛熟知并可得的。例如，可在 頂GT公共數(shù)據(jù)庫中檢索到它們?！鼎臣毎荏w資料手冊》（Τ cell Rec印tor Factsbook)， (2001) LeFranc 和 LeFranc，學(xué)術(shù)出版社（Academic Press)，ISBN 0-12-441352-8 也公開了 由頂GT命名定義的序列，但是由于其出版日期和隨后的時間延遲，其中的信息有時需要通 過參考頂GT數(shù)據(jù)庫來確認(rèn)。
[0015] SEQ ID NO :2和3分別是在本文中稱為"親本"AFP TCR的α和β鏈胞外序列。 親本AFP TCR具有以下的α和β鏈：
[0016] α 鏈：TRAV12_2*02/TRAJ41*01/TRAC (圖 1 給出 了親本 AFP TCRa 鏈的胞外序列 (SEQ ID No:2))。由 SEQ ID N0:2 的氨基酸 27-32(CDRl)、50-55(CDR2)和 90-101(CDR3) 定義CDR。
[0017] β 鏈：TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2(圖 2 給出 了親本 AFP TCRa 鏈的 胞外序列（SEQ ID No:3))。由 SEQ ID N0:3 的氨基酸 27-31(CDRl)、49-54(CDR2)和 92-102 (CDR3)定義 CDR。
[0018] (注：術(shù)語"*01"和"*02"表示該序列如頂GT命名所示存在超過一種等位基因變 體，并且是在上述的TCR克隆中存在的*01/*02變體。也請注意沒有限定符表示相關(guān) 序列僅已知一種等位基因。）
[0019] 出于提供可與本發(fā)明的突變TCR的結(jié)合概況比較的參考TCR的目的，使用具有圖 3給出的AFP TCRa鏈的胞外序列（SEQ ID No :4)和圖4給出的AFP TCRβ鏈的胞外序列 (SEQ ID Νο:5)是便利的。該TCR在本文中稱為"參考TCR"或"參考AFP TCR"。注意到 SEQ ID No :4與親本α鏈胞外序列SEQ ID No :2相同，除了 C159已被Τ159所取代（即， TRAC的T48)。類似地，SEQ ID No :5與親本β鏈胞外序列SEQ ID No :3相同，除了 C169 已被S169(即，TRBC2的S57)所取代，A187已被C187所取代并且D201已被N201所取代。 這些與親本AFPa和β鏈胞外序列相關(guān)的半胱氨酸取代能夠形成鏈間二硫鍵，其使得重折 疊的可溶性TCR穩(wěn)定化，即通過重折疊胞外α和β鏈形成的TCR。使用穩(wěn)定的二硫鍵連接 的可溶性TCR作為參考TCR能夠更方便地評價結(jié)合親和性和結(jié)合半衰期。
[0020] 本發(fā)明的TCR可被轉(zhuǎn)化到T細胞中，使它們能夠破壞呈遞AFP HLA-A2復(fù)合物的細 胞，用于給予處于稱為過繼性療法的治療過程中的患者。處于該目的，將希望如果該TCR對 肽-HLA復(fù)合物有比對該復(fù)合物有特異性的天然TCR有更高的親和性和/或較低的解離速 率。親和性的顯著增加已與TCR基因修飾的CD8T細胞中抗原特異性的損失關(guān)聯(lián)，其可能導(dǎo) 致這些TCR-轉(zhuǎn)染的CD8細胞的非特異性激活。因此，對肽-HLA復(fù)合物具有比對該復(fù)合物 具有特異性的天然TCR稍高的親和性和/或稍低的解離速率，而不是對肽-HLA復(fù)合物具有 比天然TCR明顯高的親和性和/或明顯低的解離速率的TCR將優(yōu)選用于過繼性療法（參見 Zhao 等，（2007) J Immunol. 179 :5845-54 ;Robbins 等，（2008) J Immunol. 180 :6116-31 ;和 W02008/038002)。
[0021] 本發(fā)明的實施方式包括相對于親本AFP TCR突變的TCR。突變的TCR可包含α鏈 可變結(jié)構(gòu)域，參考SEQ ID No :2所示的編號，其在對應(yīng)于310、323、94〇、953、966、97￥和98八 的氨基酸的一個或多個中包含突變。例如，α鏈可變結(jié)構(gòu)域可具有以下突變中的一個或多 個：
[0023] 上述使用的編號與圖1所示的相同（SEQ ID No :2)。
[0024] α 鏈可變結(jié)構(gòu)域可包含與 SEQ ID No :6、SEQ ID No :7、SEQ ID No :8、SEQ ID No : 9、SEQ ID No :10、SEQ ID No :11、SEQ ID No :12、SEQ ID No :13、SEQ ID No :14、SEQ ID No : 15、SEQ ID No: 16、SEQ ID No: 17、SEQ ID No: 18、SEQ ID No :19 和 SEQ ID No :20 中任意 的殘基 1-112 有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的 相同性的氨基酸序列，并且優(yōu)選地，該氨基酸序列也與SEQ ID No :2的殘基1-112具有至少 90%相同性。圖5中帶下劃線的氨基酸可以是非變異的。
[0025] 在一個實施方式中，TCR包含α鏈可變結(jié)構(gòu)域，該α鏈可變結(jié)構(gòu)域包含ID No : 11、SEQ ID No:12或SEQ ID No:13的Ql至H112,和/或β鏈可變結(jié)構(gòu)域，該β鏈可變 結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :3的Dl至Tl 12。
[0026] 可使用任意合適的方法進行突變，包括但不限于，基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)、基 于限制性酶的克隆或連接獨立克?。↙IC)法的那些方法。這些方法在許多的標(biāo)準(zhǔn)分子生 物學(xué)教科書中有詳細描述。對于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)和基于限制性酶的克隆的進一步詳 述，參見Sambrook和Russell，（2001)《分子克隆-實驗室手冊》（Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第3版），CSHL出版社。關(guān)于連接獨立克?。↙IC)過程的其他信息 可在 Rashtchian，（1995)Curr Opin Biotechnol 6(1) :30_6 中發(fā)現(xiàn)。
[0027] 本文所述的任意TCR的表型沉默變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文所用的術(shù)語"表 型沉默變體"理解為是指具有在本文下述的K d和結(jié)合半衰期范圍內(nèi)的對FMNKFIYEI (SEQ ID No :1)HLA-A2復(fù)合物的&和/或結(jié)合半衰期的那些TCR。例如，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可 能產(chǎn)生與上文詳述的那些TCR相比在其恒定區(qū)和/或可變結(jié)構(gòu)域摻入變化而沒有改變與 FMNKFIYEI (SEQ ID No :1)HLA-A2復(fù)合物的相互作用所需的親和性的TCR。這類試驗變體 包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。其中已經(jīng)進行一個或多個保守取代的那些TCR也形成本發(fā)明的部 分。
[0028] 可能能夠在其C-末端和/或N-末端提供的序列截短1、2、3、4、5或更多個殘基， 而不顯著影響TCR的結(jié)合性質(zhì)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的。本發(fā)明包括了所有 這類試驗變體。
[0029] 天然TCR以異二聚體α β或γ δ的形式存在。然而，之