本發(fā)明屬于飼料添加劑生產(chǎn)領(lǐng)域，涉及一種可降解草酸的富硒乳酸菌制劑的制備方法和應(yīng)用，所述的富硒乳酸菌制劑專用于動物保健品的生產(chǎn)，可用作犬糧添加劑，能發(fā)揮有機硒抗氧化和乳酸菌降解草酸的雙重作用，預(yù)防犬草酸鈣尿石癥的發(fā)生。

背景技術(shù)：

尿結(jié)石是動物和人體內(nèi)一種常見病，動物尿路結(jié)石中大約有70％～80％是草酸鈣結(jié)石。由于草酸鈣的低溶解性，目前治療草酸鈣結(jié)石的方法仍主要是以手術(shù)移除為主，這給患者帶來了極大的痛苦，對于動物養(yǎng)殖而言，增加了飼養(yǎng)成本。草酸鈣結(jié)石形成需要三個條件：第一，高濃度的草酸尿；第二，存在形成結(jié)石的晶核；第三，高鈣尿癥。鈣離子濃度增高，會提高草酸鈣的飽和度，鈣離子也會與尿路結(jié)石抑制劑結(jié)合。在人臨床上，大約三分之一的草酸鈣結(jié)石患者有高鈣尿和體內(nèi)鈣代謝紊亂的癥狀。有研究報道稱在草酸鈣結(jié)石的形成過程中，草酸吸收和代謝異常所起的作用較鈣大，它的輕微變化就能導(dǎo)致草酸鈣結(jié)晶的產(chǎn)生。體內(nèi)的草酸來自內(nèi)源性的代謝和外源性的吸收，其中體內(nèi)的氨基酸、vc等經(jīng)過一系列的代謝，終產(chǎn)物為草酸；外源性的草酸則主要源自于腸道從食物中吸收的草酸。由于脊椎動物不能利用草酸作為碳源，體內(nèi)的草酸則通過腎臟經(jīng)尿液排出體外。動物體的草酸大部分源自食物，理論上通過控制從飲食中攝入的草酸量，可以防止高草酸尿的形成。但是大多數(shù)食物中均含有草酸，所以這種方法無法實現(xiàn)。對正常人和動物來說，內(nèi)源性草酸的代謝量一定，因此，減少腸道對草酸的吸收，是預(yù)防草酸鈣腎石病的發(fā)生較為可行的辦法。另外，結(jié)晶的析出聚集需要結(jié)核存在，損傷的細胞為晶體的聚集提供了這一條件，因而是結(jié)石形成的另一重要條件。草酸鈣結(jié)石形成的晶核，多來自于腎上皮細胞的損傷。機體代謝的過程中，會產(chǎn)生可引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的活性氧，其會導(dǎo)致腎上皮細胞的氧化損傷。損傷的細胞會促進草酸鈣晶體的聚集、粘附、增大，形成結(jié)石。因此，減少腎上皮細胞的氧化損傷也是防止草酸鈣結(jié)石產(chǎn)生的另一重要途徑。

硒是人和動物所必需的微量元素，是一種多功能的生命營養(yǎng)元素。研究表明，硒具有抗氧化，提高機體免疫力，抗病能力，調(diào)節(jié)機體代謝，提高繁育機能，抗腫瘤，防治地方病，延緩衰老，拮抗有毒元素等多種功能。硒是機體清除脂質(zhì)過氧化物和自由基的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，gsh-px)的必要組成部分，硒發(fā)揮抗氧化作用就是通過gsh-px的抗氧化能力來實現(xiàn)的。硒的抗氧化作用可以防止自由基對腎上皮細胞的損傷作用，防止尿結(jié)石的晶核形成。常用的硒制劑有無機硒和有機硒兩種，但相比而言有機硒有利用率高，無毒副作用等優(yōu)點。有機硒的合成有兩種方法：人工合成和生物轉(zhuǎn)化。但人工合成有機硒價格過高，無法大規(guī)模用于動物生產(chǎn)。硒的生物轉(zhuǎn)化法主要通過植物和微生物轉(zhuǎn)化無機硒成有機硒。目前，用酵母制備有機硒已進入工業(yè)化生產(chǎn)階段。

乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)是一群能從可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性球菌和桿菌的總稱。乳酸菌作為一種益生菌具有多項生理作用，包括營養(yǎng)作用、降膽固醇作用、增強免疫功能等。同時，也有一些乳酸菌具有分解腸道草酸的作用，曾有報道從草酸鈣結(jié)石發(fā)病率較低的犬中分離到能夠降解草酸的乳酸菌。乳酸菌與其它可分解草酸的細菌不同，其不僅有著較好的草酸降解力，而且還屬于益生菌。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種簡便、低成本生產(chǎn)可降解草酸的富硒乳酸菌制劑的生產(chǎn)方法和產(chǎn)品，該產(chǎn)品能同時發(fā)揮有機硒抗氧化作用和乳酸菌分解草酸的雙重功效，能有效地預(yù)防草酸鈣結(jié)石的發(fā)生。生產(chǎn)方法：在培養(yǎng)基中添加無機硒源，用能分解草酸的乳酸菌作為菌種，在適宜的條件下培養(yǎng)，待乳酸菌將無機硒轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C硒，得到富含有機硒且能降解草酸乳酸菌制劑。

技術(shù)方案：一種可降解草酸的富硒乳酸菌制劑，它是以乳酸乳球菌乳酸亞種和屎腸球菌種為菌種，經(jīng)菌種活化、制備種子液、再經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的乳酸乳球菌乳酸亞種和屎腸球菌的總濃度為1×10¹⁰～10¹¹cfu/ml，有機硒以硒的含量計為3.0～4.0μg/ml的制劑。

本發(fā)明所述的可降解草酸的富硒乳酸菌制劑的制備方法，包括菌種活化、種子液的獲得、可降解草酸的富硒乳酸菌制劑的獲得，具體包括以下步驟：

(1)菌種活化：取保存在-20℃的乳酸乳球菌乳酸亞種和屎腸球菌種解凍后，各接種于斜面培養(yǎng)基上溫度30～40℃培養(yǎng)；

(2)種子液的獲得：將乳酸乳球菌乳酸亞種和屎腸球菌各接種入種子培養(yǎng)基中，溫度35～40℃，培養(yǎng)30～40h，分別獲得乳酸乳球菌乳酸亞種種子液和屎腸球菌種子液；

(3)可降解草酸的富硒乳酸菌制劑的獲得：將亞硒酸鈉加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中的se⁴⁺濃度為3～6μg/ml，分別將乳酸乳球菌乳酸亞種種子液和屎腸球菌種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度30～40℃，培養(yǎng)30～40h，擴大培養(yǎng)得到可降解草酸的富硒乳酸菌制劑。

所述的乳酸乳球菌乳酸亞種為乳酸乳球菌乳酸亞種njodl1，分類命名為：lactococcuslactissubsp.lactis，于2011年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號為cgmccno.4582。參見申請人于2011年6月22日申請的發(fā)明專利申請(公開號cn102250800a)。

所述的屎腸球菌為屎腸球菌njode1，分類命名為：enterococcusfaecium，于2011年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號為cgmccno.4581。參見申請人于2011年6月22日申請的發(fā)明專利申請(公開號cn102250799a)。

步驟(1)中，菌種活化的具體方法為：將保存在-20℃的乳酸乳球菌乳酸亞種和屎腸球菌種解凍后，各接種于斜面培養(yǎng)基上，溫度30～40℃下培養(yǎng)36小時，連續(xù)傳代3～5次。

所述的斜面培養(yǎng)基為mrs固體培養(yǎng)基，配制方法為，以配置1000ml斜面培養(yǎng)基為例：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，吐溫80.1ml，mgso4·7h2o0.58g，k2hpo42g，mnso4·4h2o0.05g，瓊脂20g，水1000ml，調(diào)節(jié)ph＝6.2～6.4；121℃，高壓蒸汽滅菌15min.。用于乳酸菌的復(fù)蘇和保存。

步驟(2)中，所述的種子培養(yǎng)基為mrs液體培養(yǎng)基，配制方法為，以配置1000ml斜面培養(yǎng)基為例：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，吐溫80.1ml，mgso4·7h2o0.58g，k2hpo42g，mnso4·4h2o0.05g，水1000ml，調(diào)節(jié)ph＝6.2～6.4；121℃，高壓蒸汽滅菌15min.。

步驟(3)中，乳酸乳球菌乳酸亞種種子液和屎腸球菌種子液以5％的體積接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為mrs液體培養(yǎng)基。

所述的可降解草酸的富硒乳酸菌制劑中富硒乳酸乳球菌乳酸亞種和屎腸球菌的總濃度為1×10¹⁰～10¹¹cfu/ml，有機硒以硒的含量計為3.0～4.0μg/ml，硒轉(zhuǎn)化率為60％以上。該產(chǎn)品的益生菌數(shù)符合《益生菌類保健食品評審規(guī)定》中的標(biāo)準(zhǔn)。

所述的無機硒為亞硒酸鈉；所述的有機硒為硒蛋氨酸。

本發(fā)明制得的可降解草酸的富硒乳酸菌制劑在制備保健品中的應(yīng)用，優(yōu)選在制備預(yù)防犬草酸鈣尿石癥的保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明制得的可降解草酸的富硒乳酸菌制劑在制備犬糧添加劑中的應(yīng)用，優(yōu)選在制備預(yù)防犬草酸鈣尿石癥的犬糧添加劑中的應(yīng)用。

有益效果：

(1)本發(fā)明選用特定的具有草酸分解能力的乳酸乳球菌亞種和屎腸球菌，采用生物轉(zhuǎn)化法，通過乳酸菌將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，轉(zhuǎn)化率為60％以上，得到富含有機硒的可降解草酸的富硒乳酸菌制劑，發(fā)揮有機硒和乳酸菌的雙重生物學(xué)功效，既能發(fā)揮抗氧化的功能，又可降解草酸，共同預(yù)防草酸鈣尿結(jié)石的形成。

(2)本發(fā)明所得可降解草酸的富硒乳酸菌制劑預(yù)防犬草酸鈣尿石癥效果顯著。試驗表明：富硒乳酸菌制劑能顯著防止尿液草酸的升高、尿液ph的降低和血鈣的降低；在提高機體抗氧化能力上，富硒乳酸菌可顯著提高機體血和腎組織抗氧化酶如超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)和過氧化氫酶(cat)的活性，能有效防止血和腎組織丙二醛(mda)的升高。本發(fā)明可降解草酸的富硒乳酸菌制劑作為一種安全的保健品，可用作犬糧添加劑，在預(yù)防草酸鈣尿結(jié)石的過程中必將發(fā)揮極其重要的作用，預(yù)防犬草酸鈣尿石癥的發(fā)生。

附圖說明

圖1為實施例1中空白對照組腎臟he切片圖(he,×400)；

圖2為實施例1中0.5％草酸組腎臟he切片圖(he,×400)；

圖3為實施例1中0.5％草酸組+有機硒組腎臟he切片圖(he,×400)；

圖4為實施例1中0.5％草酸組+乳酸菌組腎臟he切片圖(he,×400)；

圖5為實施例1中0.5％草酸組+富硒乳酸菌制劑組腎臟he切片圖(he,×400)。

生物材料保藏信息

njodl1，分類命名為：lactococcuslactissubsp.lactis，于2011年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號為cgmccno.4582。

njode1，分類命名為：enterococcusfaecium，于2011年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號為cgmccno.4581。

具體實施方式

實施例1：可降解草酸的富硒乳酸菌制劑對食源性草酸過多犬尿石癥的預(yù)防作用試驗

1、可降解草酸的富硒乳酸菌制劑，其生產(chǎn)方法如下：

1)乳酸菌種：

乳酸乳球菌乳酸亞種(lactococcuslactissubsp.lactis)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)科教研組提供，為農(nóng)業(yè)部允許使用的益生菌菌種。于2011年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號為cgmccno.4582。

屎腸球菌(enterococcusfaecium)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)科教研組提供，為農(nóng)業(yè)部允許使用的益生菌菌種。于2011年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號為cgmccno.4581。

2)無機硒源：亞硒酸鈉，配制se⁴⁺濃度為1mg/ml的亞硒酸鈉溶液500ml，121℃，高壓蒸汽滅菌15min，備用。

3)培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(mrs固體培養(yǎng)基)：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，吐溫80.1ml，mgso4·7h2o0.58g，k2hpo42g，mnso4·4h2o0.05g，瓊脂20g，水1000ml，調(diào)節(jié)ph＝6.2～6.4；121℃，高壓蒸汽滅菌15min。用于乳酸菌的復(fù)蘇和保存。

種子培養(yǎng)基(mrs液體培養(yǎng)基)：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，吐溫80.1ml，mgso4·7h2o0.58g，k2hpo42g，mnso4·4h2o0.05g，水1000ml，調(diào)節(jié)ph＝6.2～6.4；121℃，高壓蒸汽滅菌15min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

4)菌種活化：將保存在-20℃的乳酸菌種解凍后，分別接種于mrs斜面培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)36h，在此條件下連續(xù)傳代3～5次(即每次傳代培養(yǎng)的溫度是37℃，時間36h)。

5)種子液的獲得：分別將乳酸乳球菌乳酸亞種和屎腸球菌各自接接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml的錐形瓶中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基ph為6.4，溫度40℃，培養(yǎng)36h。

6)可降解草酸的富硒乳酸菌產(chǎn)品的獲得：將亞硒酸鈉加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中se⁴⁺濃度為5μg/ml，500ml錐形瓶培養(yǎng)基裝液量為300ml，分別將乳酸乳球菌乳酸亞種種子液和屎腸球菌種子液以5％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基ph為6.4，溫度40℃，搖床培養(yǎng)37h，得到可降解草酸的富硒乳酸菌制劑。

上述所得能降解草酸的富硒乳酸菌制劑中，乳酸乳球菌乳酸亞種和腸屎腸球菌的總濃度為3.8×10¹⁰cfu/ml，有機硒(硒蛋氨酸)以硒的含量計為3.83μg/ml，硒轉(zhuǎn)化率約為76.50％。

2、上述可降解草酸的富硒乳酸菌制劑飼喂食源性草酸過多犬試驗

1)試驗動物選取、處理及飼養(yǎng)管理：

a.選用10kg左右南京本地雜種雄犬40只，隨機分為5組。

b.基礎(chǔ)犬糧的配方和營養(yǎng)水平見表1。

c.試驗前預(yù)養(yǎng)2周，注射犬五聯(lián)疫苗。

d.試驗時空白對照組飼喂基礎(chǔ)犬糧，其他各組犬日糧添加草酸，草酸劑量為日糧的0.5％；除草酸對照組外，其他3草酸組分別添加有機硒(即添加硒蛋氨酸作為有機硒對照，無活酵母)、乳酸菌菌劑(乳酸菌菌劑的制備方法同本實施例的富硒乳酸菌制劑生產(chǎn)方法，不過發(fā)酵培養(yǎng)基中不加入亞硒酸鈉，乳酸菌的總濃度為3.8×10¹⁰cfu/ml)、富硒乳酸菌制劑。有機硒和富硒乳酸菌制劑的添加量均以硒計為0.3mg/kg日糧。

e.整個試驗時間30天，試驗期間定時定量喂料，限水，常規(guī)管理和環(huán)境控制。于試驗第0d、15d、和30d，采用尿?qū)Ч軐?dǎo)尿法收集犬尿液。4℃保存，收集24h尿液后，混勻，測尿量及ph值。用濃鹽酸將5ml尿液酸化至ph為1后凍存，測定尿草酸的濃度；剩余尿液離心后，取上清液用于測定游離鈣、尿素氮和尿肌酐。犬前肢外側(cè)靜脈采血，一部分裝于抗凝管，一部分裝于10ml離心管用于制備血清，將制好的血清-20℃保存?zhèn)溆?。檢測血鈣、血尿素氮、血肌酐、血液抗氧化功能。第30d將實驗犬采用呼吸麻醉后，取出犬的腎臟，將左腎切開后泡在10％的福爾馬林中用作制備常規(guī)he切片；將右腎切成小塊，按組織與生理鹽水1:9的比例制成10％的勻漿液，用作組織酶的測定。

表1基礎(chǔ)犬糧的配方和營養(yǎng)水平

表2富硒乳酸菌制劑對犬尿草酸含量的影響(mmol/l)

1注：0d表示未補給任何物質(zhì)前1天，15d和30d表示補給富硒制劑和草酸后第15天和第30天，下同。

2注：同行中標(biāo)有不同小寫字母間表示差異顯著(p＜0.05)，下同。

表3富硒乳酸菌制劑對犬尿ph值的影響

表4富硒乳酸菌制劑對犬血鈣含量的影響(mmol/l)

表5富硒乳酸菌制劑對犬尿肌酐含量的影響(mmol/l)

表6富硒乳酸菌制劑對犬抗氧化功能的影響

表7富硒乳酸菌制劑對犬尿尿素氮含量的影響(mmol/l)

表8富硒乳酸菌制劑對犬血尿素氮含量的影響(mmol/l)

表9富硒乳酸菌制劑對犬血肌酐含量的影響(mmol/l)

表10富硒乳酸菌制劑對犬尿鈣含量的影響(mmol/l)

表11富硒乳酸菌制劑對犬全血硒含量的影響(mg/l)

2)結(jié)果分析：在試驗第15d時，與草酸組相比，僅富硒乳酸菌組防止草酸升高作用顯著，在試驗第30d時，與草酸組比較，乳酸菌組和富硒乳酸菌組防止草酸升高作用均顯著，其中富硒乳酸菌對防止草酸升高作用顯著優(yōu)于有機硒組對防止草酸的升高作用(見表2)；有機硒、乳酸菌和富硒乳酸菌在試驗第15d和第30d均能防止尿液ph的降低，與草酸組相比差異顯著，且富硒乳酸菌防止尿液ph下降的效果最顯著(見表3)；在試驗第15d時，三個試驗組對犬血鈣影響不顯著，在試驗第30d時，與草酸組比較，富硒乳酸菌組可顯著防止血鈣降低，而有機硒組和乳酸菌組差異不顯著(見表4)；在提高機體抗氧化能力上，富硒乳酸菌可顯著提高機體血和腎組織抗氧化酶如超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)和過氧化氫酶(cat)的活性，顯著防止血和腎組織丙二醛(mda)的升高(見表6)；與草酸組比較，三個試驗組有可防止尿液肌酐和尿素氮的降低，以及血液肌酐和尿素氮的升高的作用，但差異不顯著(見表5、表7、表8、表9)；在試驗第15d和30d，與草酸組比較，乳酸菌和富硒乳酸菌能顯著防止尿鈣升高(見表10)；能升高犬全血硒含量(見表11)。結(jié)合5個處理組的腎臟he切片圖(圖1-5)可知，富硒乳酸菌制劑可有效預(yù)防犬草酸尿石癥的發(fā)生。綜上所述，富硒乳酸菌的上述效果顯著優(yōu)于單純的有機硒和乳酸菌組。

實施例2：可降解草酸的富硒乳酸菌制劑對食源性草酸過多犬尿石癥的預(yù)防作用試驗

可降解草酸的富硒乳酸菌制劑，其生產(chǎn)方法同實施例1。制得的可降解草酸的富硒乳酸菌制劑中，乳酸乳球菌乳酸亞種和腸屎腸球菌的總濃度為6.7×10¹⁰cfu/ml，有機硒以硒的含量計為3.79μg/ml，有機硒轉(zhuǎn)化率約為75.79％。

1)試驗動物選取、處理及飼養(yǎng)管理：

a.選用10kg左右南京本地雜種雄犬為試驗對象。

b.飼喂基礎(chǔ)犬糧的配方和營養(yǎng)水平見表1。

c.試驗前預(yù)養(yǎng)2周，注射犬五聯(lián)疫苗。

d.試驗犬隨機分為3組，每組8只。a組為空白對照組，飼喂基礎(chǔ)犬糧；b組為草酸對照組，每天飼喂基礎(chǔ)犬糧并按犬糧重量0.5％添加草酸；c組每天飼喂基礎(chǔ)犬糧并按犬糧重量0.5％添加草酸，并補給可降解草酸富硒乳酸菌制劑，其計量以硒計為0.3mg/kg日糧。

e.整個試驗時間30天，試驗期間定時定量喂料，限水，常規(guī)管理和環(huán)境控制。

表12富硒乳酸菌制劑對犬尿草酸含量的影響(mmol/l)

表13富硒乳酸菌制劑對犬抗氧化功能的影響

表14富硒乳酸菌對犬全血硒含量的影響(mg·l^-1)

2)結(jié)果分析：應(yīng)用可降解草酸的富硒乳酸菌制劑于犬日糧中，能顯著防止尿液草酸升高(見表12)、可顯著提高機體抗氧化能力(見表13)；能升高犬全血硒含量(見表14)。結(jié)合腎組織切片記分表明，本發(fā)明可降解草酸的富硒乳酸菌能顯著減少犬尿草酸尿石癥的發(fā)生。