一種富含β-葡聚糖的發(fā)酵乳及其制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種富含β-葡聚糖的發(fā)酵乳及其制備工藝，屬于生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。其由誘變選育的β-葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌作為發(fā)酵菌種，經(jīng)過(guò)發(fā)酵，冷卻，后熟等工藝步驟制得。本發(fā)明制備的發(fā)酵乳β-葡聚糖產(chǎn)量達(dá)268μg/ml，原菌株制作的發(fā)酵乳β-葡聚糖含量238μg/ml，比原菌株產(chǎn)β-葡聚糖能力提高了12.2%，而且風(fēng)味未受影響。
【專利說(shuō)明】一種富含β-葡聚糖的發(fā)酵乳及其制備工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種生物發(fā)酵用乳酸菌用于乳制品發(fā) 酵。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著乳酸菌對(duì)人體健康有益的作用機(jī)理被揭示，乳酸發(fā)酵食品日益受到人們的重 視。而用于制作發(fā)酵食品的乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)形成胞外多糖，在這些胞外多糖中 就含有β-葡聚糖，β-葡聚糖是低熱量的食品原料，食用后不易被人消化吸收，可減少血 液中葡萄糖含量的增加，能預(yù)防糖尿病和控制肥胖病、糖尿病，降低體重，防止心血管疾病 的發(fā)生。由于β_葡聚糖有吸水膨脹的性質(zhì)，人吃后在胃中能吸水膨脹，使人產(chǎn)生飽滿感， 延緩從胃進(jìn)入小腸的速度。進(jìn)入腸道的β_葡聚糖僅有25%被消化吸收，其余60%繼續(xù)向 腸下部移動(dòng)，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，加之在結(jié)腸處滲透作用，防止便秘，縮短了廢棄物通過(guò)腸道的 時(shí)間，減少了腸內(nèi)致癌物對(duì)腸管的污染，達(dá)到防癌的作用。目前我國(guó)市場(chǎng)上的大多數(shù)發(fā)酵乳 制品中利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的β_葡聚糖含量較低，篩選能定向發(fā)酵β_葡聚糖含量較高 的高產(chǎn)β -葡聚糖生產(chǎn)菌株對(duì)提高人們生活質(zhì)量，進(jìn)行功能性乳酸制品的開(kāi)發(fā)具有重要意 義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有菌種的不足，提供一種由誘變選育的β -葡聚糖高產(chǎn)菌 株嗜熱鏈球菌（St)與保加利亞乳桿菌（Lb )制備的發(fā)酵乳，所得發(fā)酵乳中富含大量β_葡聚 糖。
[0004] 本發(fā)明一種富含β -葡聚糖的發(fā)酵乳，經(jīng)誘變選育的β -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈 球菌與保加利亞乳桿菌發(fā)酵制得，具體由如下制備工藝制得： (1) 將誘變選育的β -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌二者混合，經(jīng)過(guò) 活化，擴(kuò)培，制備成發(fā)酵劑，備用； (2) 將全脂乳粉調(diào)制成12%復(fù)原乳，然后加入蔗糖，溶解后在90°C -95°C下殺菌5min， 再冷卻至45°C ; (3) 將步驟（1)制備的發(fā)酵劑接種到步驟（2)中冷卻的復(fù)原乳中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； (4 )最后經(jīng)過(guò)冷卻，后熟，制得成品，在4 °C下冷藏，即得； 所述步驟（1)中保加利亞乳桿菌和誘變選育的β-葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌以1 :3、 1 :2、1 :1、2 :1或3 :1的菌種比例混合； 所述步驟（2)中蔗糖添加量質(zhì)量百分比為1%，3%，5%，6%、7%或9% ; 所述步驟（3)中菌種接種量為2%、4%、5%、6%、8%或10% ; 所述步驟（3)中的發(fā)酵溫度為37°C、39°C、41°C、43°C*45°C。
[0005] 所述步驟（1)中保加利亞乳桿菌和誘變選育的β -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌的 菌種混合比例為2:1。
[0006] 所述步驟（2)中鹿糖添加量為6%。
[0007] 所述步驟（3)中菌種接種量為5%。
[0008] 所述步驟（3)中的發(fā)酵溫度為41°C。
[0009] 所述的誘變選育的β -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌的制備方法如下： 將利用乳酸菌培養(yǎng)選擇出的嗜熱鏈球菌作為出發(fā)菌株，通過(guò)不同培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)對(duì) 其進(jìn)行純化，同時(shí)對(duì)純化得到的菌株進(jìn)行性能測(cè)試，選擇性能良好的菌株制成單細(xì)胞菌體 懸浮液，通過(guò)平板培養(yǎng)進(jìn)行懸浮液菌落計(jì)數(shù)；利用紫外誘變和亞硝基胍誘變，對(duì)菌體懸浮液 進(jìn)行誘變劑處理，利用乳酸菌培養(yǎng)對(duì)誘變劑處理后的菌體懸浮液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死 率；利用中間培養(yǎng)和平板涂布進(jìn)行突變菌株分離，將分離出的菌株進(jìn)一步篩選，首先進(jìn)行初 篩，對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行復(fù)篩，對(duì)復(fù)篩出的菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性經(jīng)測(cè)定，即得。
[0010] 所述紫外誘變使用人工制作的紫外誘變燈發(fā)出的波長(zhǎng)為253. 7 nm的紫外線，誘變 時(shí)間為120秒。
[0011] 所述亞硝基胍誘變處理劑量是0. 3mg/ml，誘變時(shí)間為50分鐘。
[0012] 本發(fā)明富含β -葡聚糖的發(fā)酵乳的制備方法，具體包括如下工藝步驟： (1) 將誘變選育的β -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌二者混合，經(jīng)過(guò) 活化，擴(kuò)培，制備成發(fā)酵劑，備用； (2) 將全脂乳粉調(diào)制成12%復(fù)原乳，然后加入蔗糖，溶解后在90°C -95°C下殺菌5min， 再冷卻至45°C ; (3) 將步驟（1)制備的發(fā)酵劑接種到步驟（2)中冷卻的復(fù)原乳中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； (4 )最后經(jīng)過(guò)冷卻，后熟，制得成品，在4 °C下冷藏，即得； 所述步驟（1)中保加利亞乳桿菌和誘變選育的β-葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌以1 :3、 1 :2、1 :1、2 :1或3 :1的菌種比例混合； 所述步驟（2)中蔗糖添加量質(zhì)量百分比為1%，3%，5%，6%、7%或9% ; 所述步驟（3)中菌種接種量為2%、4%、5%、6%、8%或10% ; 所述步驟（3)中的發(fā)酵溫度為37°C、39°C、41°C、43°C*45°C。
[0013] β -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌（St)的制備方法及檢驗(yàn)具體如下。
[0014] (一）出發(fā)菌株的確定 1、因溴甲酚紫指示劑在酸性條件下呈黃色，在堿性條件下呈紫色，本實(shí)驗(yàn)用MRS培養(yǎng) 基的PH為6. 5,故加入溴甲酚紫指示劑后呈紫色，乳酸菌(嗜熱鏈球菌株）在該培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，由于分解葡萄糖產(chǎn)生乳酸，使菌落呈黃色，菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基也變?yōu)辄S色。說(shuō)明如果平 板由原來(lái)的紫色變?yōu)辄S色說(shuō)明該菌株能產(chǎn)酸。
[0015] 2、在1所述培養(yǎng)基中加入CaCO3，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸可以溶解培養(yǎng)基中的CaCO 3，在 菌落周?chē)纬擅黠@的透明圈，既容易識(shí)別，又通過(guò)透明圈直徑的大小，可以半定量地判斷該 菌株產(chǎn)酸能力的高低，產(chǎn)酸量高的菌株透明圈大，產(chǎn)量低的透明圈小。
[0016] 3、通過(guò)1、2所述，試驗(yàn)選擇溴甲酚紫_0&〇)3平板培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的分離和篩選。
[0017] 4、脫脂乳培養(yǎng)基：配方：脫脂乳粉12g，蒸餾水100mL，12rC，高壓滅菌15min。脫 脂乳中含有大量的復(fù)合氮源、乳糖（4.8% )、礦物質(zhì)（0.5%)和酶，是乳酸菌生長(zhǎng)的良好底物 乳酸菌活化、發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0018] 5、將乳酸菌(嗜熱鏈球菌）接入MRS液體培養(yǎng)基中活化三代，然后進(jìn)行梯度稀釋。 在3所述溴甲酚紫-碳酸鈣平板培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布分離，37 °C培養(yǎng)2天后，挑選透明圈和變 色圈大的單個(gè)菌落，接種到4所述脫脂乳培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2天。
[0019] 6、選擇5所述凝乳良好的菌株進(jìn)行剛果紅檢測(cè)，確定β -葡聚糖產(chǎn)量高且產(chǎn)酸穩(wěn) 定的菌株作為誘變的出發(fā)菌株。方法是：將加熱滅菌的發(fā)酵液攪拌，然后靜置使蛋白質(zhì)變 性沉淀。在5000r/min條件下離心IOmin,加入粉末活性炭1. 5%，充分?jǐn)嚢?，?0°C下靜置 30-40min以吸附雜質(zhì)，之后用真空抽濾法去除活性炭，然后采用冷凍結(jié)晶法去除大部分乳 酸鈣，根據(jù)EDTA-Ca鹽法測(cè)定的鈣含量，加入定量的Na 2CO3生成CaCOjX淀離心除去鈣離子， 得到乳酸發(fā)酵提取液。取4支具塞試管，在室溫下依次加入3ml0. 2mol/LPH8的磷酸緩沖液， 25mg/L的剛果紅溶液0. lml，其中3支試管依次加入0. 4mlPH調(diào)節(jié)為8的發(fā)酵液，余下體積 用去離子水補(bǔ)齊至4ml，另外1支直接用去離子水補(bǔ)齊至4ml，混勻，20°C條件下反應(yīng)15min， 在550nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，取平均值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得發(fā)酵液中實(shí)際β -葡聚糖的含量。
[0020] (二）紫外（UV)誘變 1、UV誘變出發(fā)菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的確定 將溴甲酚紫-CaCO3平板篩選出來(lái)的出發(fā)菌株接種于MRS試管液體培養(yǎng)基中，恒溫37°C 傳代培養(yǎng)進(jìn)行活化，調(diào)整活菌數(shù)為108cfu/mL，按3%的接種量接種于裝有MRS液體培養(yǎng)基的 三角瓶中，37°C恒溫培養(yǎng)。每間隔2h取發(fā)酵液，在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值，以時(shí)間為橫 坐標(biāo)，以〇D_值為縱坐標(biāo)作圖，可得到出發(fā)菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線(每個(gè)測(cè)定值作三個(gè)重復(fù)， 取其平均值)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的菌株制備單細(xì)胞懸浮液。
[0021] 2、單細(xì)胞懸浮液的制備 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的出發(fā)菌株發(fā)酵菌液4000rpm，5min離心得菌體，棄去上清液洗 滌兩次，再用生理鹽水適當(dāng)稀釋，在帶有玻璃珠的三角瓶中震蕩20min即制備成細(xì)胞懸浮 液，逐級(jí)稀釋并在MRS平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。一般誘變處理細(xì)菌，調(diào)整其營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞濃度為 10 7-108cfu/mL。
[0022] 3、UV誘變處理 誘變過(guò)程應(yīng)在暗室進(jìn)行，照明采用紅燈泡。紫外線的波長(zhǎng)為136-390nm，其中波長(zhǎng)為260 nm的紫外線殺菌能力最強(qiáng)。人工制作的紫外誘變燈發(fā)出的紫外線波長(zhǎng)為253. 7 nm，其不僅 殺菌能力強(qiáng)，而且穩(wěn)定，誘變效果好。
[0023] 取5-10mL菌體懸浮液置于Φ90的無(wú)菌平皿中，平皿中央放滅菌大頭針一枚，開(kāi)啟 紫外燈（20W，照射距離30cm)預(yù)熱20-30min，使光波穩(wěn)定。打開(kāi)磁力攪拌器，然后打開(kāi)皿蓋， 分別照射30s，60s，90s，120s，150s，180s和210s。以不經(jīng)紫外照射的菌液作對(duì)照，分別取 紫外照射和未經(jīng)照射的菌液lmL，經(jīng)適當(dāng)稀釋分離。誘變處理后的菌液，浸在冰水浴中2-3h 后37°C恒溫培養(yǎng)2h。取0. ImL菌液涂平板，每組三個(gè)平皿，平板用黑布或牛皮紙包裹置于 恒溫箱培養(yǎng)。
[0024] 4、致死率的計(jì)算 待誘變處理的菌液長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行計(jì)數(shù)，取三個(gè)平皿的平均值，以未經(jīng)紫外照射的菌 液作對(duì)照，按照如下公式計(jì)算致死率。
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 一種富含3 -葡聚糖的發(fā)酵乳，其特征在于：所述發(fā)酵乳經(jīng)誘變選育的3 -葡聚糖 高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌發(fā)酵制得，具體由如下制備工藝制得： (1) 將誘變選育的3 -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌二者混合，經(jīng)過(guò) 活化，擴(kuò)培，制備成發(fā)酵劑，備用； (2) 將全脂乳粉調(diào)制成12%復(fù)原乳，然后加入蔗糖，溶解后在90°C -95°C下殺菌5min， 再冷卻至45°C ; (3) 將步驟（1)制備的發(fā)酵劑接種到步驟（2)中冷卻的復(fù)原乳中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； (4 )最后經(jīng)過(guò)冷卻，后熟，制得成品，在4 °C下冷藏，即得； 所述步驟（1)中保加利亞乳桿菌和誘變選育的3 -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌以1 :3、 1 :2、1 :1、2 :1或3 :1的菌種比例混合； 所述步驟（2)中蔗糖添加量質(zhì)量百分比為1%，3%，5%，6%、7%或9% ; 所述步驟（3)中菌種接種量為2%、4%、5%、6%、8%或10% ; 所述步驟（3)中的發(fā)酵溫度為37°C、39°C、41°C、43°C*45°C。
2. 如權(quán)利要求1所述的富含P -葡聚糖的發(fā)酵乳，其特征在于：所述步驟（1)中保加利 亞乳桿菌和誘變選育的3 -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌的菌種混合比例為2:1。
3. 如權(quán)利要求1所述的富含￠-葡聚糖的發(fā)酵乳，其特征在于：所述步驟（2)中蔗糖添 加量為6%。
4. 如權(quán)利要求1所述的富含￠-葡聚糖的發(fā)酵乳，其特征在于：所述步驟（3)中菌種接 種量為5%。
5. 如權(quán)利要求1所述的富含￠-葡聚糖的發(fā)酵乳，其特征在于：所述步驟（3)中的發(fā)酵 溫度為41°C。
6. 如權(quán)利要求1所述的富含P -葡聚糖的發(fā)酵乳，其特征在于：所述的誘變選育的 3-葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌的制備方法如下： 將利用乳酸菌培養(yǎng)選擇出的嗜熱鏈球菌作為出發(fā)菌株，通過(guò)不同培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)對(duì) 其進(jìn)行純化，同時(shí)對(duì)純化得到的菌株進(jìn)行性能測(cè)試，選擇性能良好的菌株制成單細(xì)胞菌體 懸浮液，通過(guò)平板培養(yǎng)進(jìn)行懸浮液菌落計(jì)數(shù)；利用紫外誘變和亞硝基胍誘變，對(duì)菌體懸浮液 進(jìn)行誘變劑處理，利用乳酸菌培養(yǎng)對(duì)誘變劑處理后的菌體懸浮液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死 率；利用中間培養(yǎng)和平板涂布進(jìn)行突變菌株分離，將分離出的菌株進(jìn)一步篩選，首先進(jìn)行初 篩，對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行復(fù)篩，對(duì)復(fù)篩出的菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性經(jīng)測(cè)定，即得。
7. 如權(quán)利要求6所述的富含0 -葡聚糖的發(fā)酵乳，其特征在于：所述紫外誘變使用人 工制作的紫外誘變燈發(fā)出的波長(zhǎng)為253. 7 nm的紫外線，誘變時(shí)間為120秒。
8. 如權(quán)利要求6所述的富含0 -葡聚糖的發(fā)酵乳，其特征在于：所述亞硝基胍誘變處 理劑量是〇. 3mg/ml，誘變時(shí)間為50分鐘。
9. 一種如權(quán)利要求1所述富含0 -葡聚糖的發(fā)酵乳的制備方法，其特征在于：所述發(fā) 酵乳經(jīng)誘變選育的3 _葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌發(fā)酵制得，具體包括 如下工藝步驟： (1) 將誘變選育的3 -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌二者混合，經(jīng)過(guò) 活化，擴(kuò)培，制備成發(fā)酵劑，備用； (2) 將全脂乳粉調(diào)制成12%復(fù)原乳，然后加入蔗糖，溶解后在90°C -95°C下殺菌5min， 再冷卻至45°C ; (3)將步驟（1)制備的發(fā)酵劑接種到步驟（2)中冷卻的復(fù)原乳中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； (4 )最后經(jīng)過(guò)冷卻，后熟，制得成品，在4 °C下冷藏，即得； 所述步驟（1)中保加利亞乳桿菌和誘變選育的3 -葡聚糖高產(chǎn)菌株嗜熱鏈球菌以1 :3、 1 :2、1 :1、2 :1或3 :1的菌種比例混合； 所述步驟（2)中蔗糖添加量質(zhì)量百分比為1%，3%，5%，6%、7%或9% ; 所述步驟（3)中菌種接種量為2%、4%、5%、6%、8%或10% ; 所述步驟（3)中的發(fā)酵溫度為37°C、39°C、41°C、43°C*45°C。
【文檔編號(hào)】A23C9/127GK104489085SQ201410848145
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】孫鴻雁 申請(qǐng)人:臨沂格瑞食品有限公司