Cp4-epsps蛋白的單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗原-抗體蛋白質(zhì)的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是本發(fā)明之一涉及用于檢測抗草甘膦CP4-EPSPS蛋白的單克隆抗體。該單克隆抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；之二提供了一種上述單克隆抗體的應(yīng)用；之三提供了一種用于檢測CP4-EPSPS蛋白的試劑盒；之四提供了一種所述試劑盒的應(yīng)用；之五提供了一種DNA序列，所述DNA序列包括編碼上述的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的DNA序列，以及編碼上述的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的DNA序列；以及之六提供了一種細胞，所述細胞中含有上述的DNA序列。
CGMCC NO:10099
20141204
【專利說明】CP4-EPSPS蛋白的單克隆抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗原-抗體蛋白質(zhì)的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及用于檢測抗草甘膦的 CP4-EPSPS蛋白的單克隆抗體。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，大量的轉(zhuǎn)基因作物進入商品流通領(lǐng)域。其中，以孟山都 (Monsanto)公司的專利基因，CP4-EPSPS基因使用最為廣泛。目前以廣泛用于玉米、大豆、 棉花等農(nóng)作物。CP4-EPSPS基因來源于土壤農(nóng)桿菌株系（Agrobacterium sp)CP4株系， CP4-EPSPS基因編碼CP4-EPSPS合成酶，該酶對除草劑草甘膦有高抗性。
[0003] 由于各種各樣轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品通過貿(mào)易大量進入國際市場，轉(zhuǎn)基因食品的安全性備 受人們的關(guān)注。世界各國對轉(zhuǎn)基因食品的安全性存在著較大的爭議，歐盟、日本等地區(qū)已經(jīng) 制定了相關(guān)法規(guī)對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進行了嚴(yán)格的管理。
[0004] 目前，中國是世界第四大大豆生產(chǎn)國，年產(chǎn)量僅次于美國、巴西和阿根廷。2010年， 中國大豆產(chǎn)量約1450萬噸，而進口大豆達到4750萬噸，超過了國內(nèi)產(chǎn)量的3倍之多。大豆 是我國主要進口農(nóng)產(chǎn)品之一，然而進口大豆的絕大部分是抗除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆，因而對 轉(zhuǎn)基因食品的管理成為了我國的一項重要課題。
[0005] 而對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的管理，要從轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測開始。目前，對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的 檢測主要有以DNA為目標(biāo)的檢測方法，例如以DNA為目標(biāo)的PCR法、Southern blot法和生 物芯片法等；以及以蛋白為目標(biāo)的檢測方法，例如ELISA或膠體金快速檢測試紙條等。其 中，DNA檢測雖然靈敏度高，但是由于不同農(nóng)作物CP4-EPSPS的檢測沒有通用的引物，對樣 品的采集處理及提取方法重復(fù)性差，導(dǎo)致PCR結(jié)果假陽性和假陰性率高，檢測方法繁瑣耗 時、檢測成本高且需要配備較先進昂貴的儀器，檢測人員也要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)才能勝任。這些 缺點使其不能承擔(dān)國際和國內(nèi)貿(mào)易中進出口產(chǎn)品的大量或常規(guī)檢測工作，也難于在基層單 位推廣使用。以蛋白為目標(biāo)的檢測方法，由于靈敏度不夠高，也會出現(xiàn)假陽性和/或假陰性 率高的問題。
[0006] 為此，需要開發(fā)出一種能夠節(jié)省時間、降低檢測成本且操作更為簡單的能夠準(zhǔn)確 檢測轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明之一提供了一種CP4-EPSPS蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體包括重鏈 可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，且所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述輕鏈可變 區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0008] 所述單克隆抗體的親和力常數(shù)為2. 61 X 1012。也就是說，其與抗原的抗原決定簇 的特異性結(jié)合強度非常高，優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的CP4-EPSPS蛋白的單克隆抗體的結(jié)合強度， 因而，該抗體的應(yīng)用比現(xiàn)有技術(shù)中的所述抗體的應(yīng)用更具有優(yōu)勢。在利用雙抗夾心ELISA 檢測目標(biāo)蛋白時，本發(fā)明的CP4-EPSPS單克隆抗體與其他抗體，例如可以是北京華大蛋白 質(zhì)研發(fā)中心有限公司的貨號為AbM59705-3-PU的單克隆抗體，配對抗體時，可以檢測到 含量低至lng/ml的轉(zhuǎn)基因蛋白，并且具有100%的特異性。這充分說明，使用本發(fā)明的 CP4-EPSPS單克隆抗體作為檢測含有CP4-EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因植物時的靈敏度和特異性相 當(dāng)高，因而更容易檢測到目標(biāo)基因，而不至于漏檢或錯檢。這將對鑒定含有CP4-EPSPS基因 的轉(zhuǎn)基因植物具有重要的意義，為我國的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的管理邁出了堅實的一步。
[0009] 而且，利用CP4-EPSPS蛋白抗原-抗體反應(yīng)能夠準(zhǔn)確檢測含有CP4-EPSPS基因的 轉(zhuǎn)基因植物，并且能夠節(jié)省時間，降低檢測成本，操作更為簡單。
[0010] 在一個具體的實施例中，所述單克隆抗體可以選自單價抗體、單鏈抗體、雙鏈抗 體、雙特異性抗體和嵌合抗體中的一種。
[0011] 在一個具體的實施例中，所述單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO: 10099的雜交瘤 細胞株分泌產(chǎn)生。
[0012] 本發(fā)明之二提供了一種如上所述的單克隆抗體的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明之三提供了一種用于檢測CP4-EPSPS蛋白的試劑盒，所述試劑盒包括如上 所述的單克隆抗體。
[0014] 本發(fā)明的用于檢測CP4-EPSPS蛋白的試劑盒包括但不限于ELISA試劑盒、酶免疫 層析檢測試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒以及免疫熒光檢測試劑盒。
[0015] 在一個具體的實施方式中，為ELISA檢測試劑盒，該試劑盒中可以包括樣品稀釋 液、洗滌液、顯色液、終止液、陽性對照以及陰性對照。陽性對照例如可以是原核或真核表達 的純化的CP4-EPSPS蛋白；陰性對照例如可以是非轉(zhuǎn)基因大豆種子的全蛋白。
[0016] 在一個具體的實施方式中，所述ELISA檢測試劑盒中的所述樣品稀釋液為含有脫 脂奶的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選為含有10% (w/ν)脫脂奶的磷酸鹽緩沖液；
[0017] 所述洗滌液為含有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選為含有0· 05% (V/V) Tween-20 的磷酸鹽緩沖液；
[0018] 所述顯色液包括顯色液A和顯色液B，所述顯色液A含3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯 胺（TMB) 20mg、無水乙醇10ml，并用ddH20定容至IOOml ;所述顯色液B含朽1檬酸2. lg、無水 Na2HP042. 82g、0. 75% (V/V)的過氧化氫尿素 0. 64ml，并用 CldH2O 定容至 IOOml ;
[0019] 所述終止液為2mol/L H2S04。
[0020] 術(shù)語"磷酸鹽緩沖液"是指含有磷酸或其鹽并被調(diào)至理想pH值的溶液，是生物化 學(xué)研究中使用最為廣泛的一種緩沖液。一般地，磷酸鹽緩沖液是從磷酸或磷酸鹽（包括但 不限于鈉和鉀鹽）制備的。本領(lǐng)域已經(jīng)知道一些磷酸鹽，例如磷酸二氫鈉和磷酸二氫鉀、磷 酸氫二鈉和磷酸氫二鉀、磷酸鈉和磷酸鉀。已經(jīng)知道磷酸鹽是以鹽的水合物形式存在的。由 于緩沖液的二級解離作用，緩沖的pH值范圍很寬，例如約pH 4至約pH 10的范圍，優(yōu)選約 pH 5至pH 9的范圍，更有選約pH 6至約pH 8的范圍，最優(yōu)選約pH 7.4。進一步優(yōu)選地， 所述磷酸鹽緩沖液為含氯化鈉和/或氯化鉀的磷酸鹽緩沖液。
[0021] 用于檢測CP4-EPSPS蛋白的ELISA檢測試劑盒的制備方法可以包括以下步驟：
[0022] (1)克隆所述CP4-EPSPS全蛋白（如SEQ ID N0:6所示的序列）的DNA(如SEQ ID NO: 5所不的序列），并進行蛋白質(zhì)表達；
[0023] (2)利用所述蛋白免疫小鼠產(chǎn)生雜交瘤細胞，然后通過大量的篩選，得到性能優(yōu)良 的分泌抗CP4-EPSPS蛋白的單克隆抗體CP4-EPSPS AS5102 ;其中，單克隆抗體CP4-EPSPS AS5102由保藏號為CGMCC NO: 10099的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生。
[0024] 在一個具體的實施方式中，所述ELISA檢測試劑盒的制備方法還可以包括上述步 驟（2)之后的步驟（3):將步驟（2)所制得的單克隆抗體CP4-EPSPS AS5102在酶標(biāo)板上進 行包被；將市售單克隆抗體進行酶標(biāo)記；該市售單克隆抗體例如可以是北京華大蛋白質(zhì)研 發(fā)中心有限公司的貨號為AbM59705-3-PU的單克隆抗體；
[0025] (4)配制樣品稀釋液、洗滌液、顯色液A液、顯色液B液、終止液，制備陽性對照以及 陰性對照；
[0026] (5)將步驟（3)制備的組分，和/或（4)制備的任選的組分組裝成ELISA檢測試劑 盒。
[0027] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的所述ELISA檢測試劑盒的制備方法 中，所述步驟（3)中包被時所用的包被液可以為碳酸鹽緩沖液，優(yōu)選為pH9. 6的碳酸鹽緩沖 液，4°C包被過夜或37°C包被2小時，封閉時所用的封閉液為1 % (W/V)牛血清白蛋白（BSA) 的磷酸鹽緩沖液（PBS)、5% (W/V)脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液、1.5% (V/V)明膠的磷酸鹽緩 沖液或5% (V/V)犢牛血清FCS的磷酸鹽緩沖液中的任一種，37°C封閉2小時，洗滌時所用 洗滌液為含有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選為含有0· 05 % (V/V) Tween-20的磷酸鹽緩沖 液。
[0028] 本發(fā)明的所述ELISA檢測試劑盒的使用方法可以包括以下步驟：
[0029] (1)將待檢血清按100 μ 1/孔加入包被有單克隆抗體CP4-EPSPS AS5102的酶標(biāo)板 上，37°C反應(yīng)60min，加入200 μ 1/孔洗滌液洗3-5次，Imin/次，洗完后在吸水紙上拍干。
[0030] (2)將100 μ 1/孔的1:10000倍（V/V)稀釋的辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP)標(biāo)記的市售單克隆抗體加入至包被有單克隆抗體CP4-EPSPS AS5102的 酶標(biāo)板上，37 °C反應(yīng)60min，之后加入200 μ 1/孔洗滌液洗3-5次，Imin/次，洗完后在吸 水紙上拍干。該市售單克隆抗體例如可以是北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司的貨號為 AbM59705-3-PU的單克隆抗體。
[0031] (3)加入底物顯色液A和顯色液B的混合液100 μ 1/孔，室溫避光放置15min。
[0032] (4)加入50 μ 1/孔終止液以終止反應(yīng)。
[0033] (5)在酶標(biāo)儀上讀取OD45tl的值，并按照判定標(biāo)準(zhǔn)進行計算和判定。
[0034] 在一個具體的實施方式中，所述ELISA檢測試劑盒的使用方法還可以包括：與上 述步驟（1)同時進行的步驟（Γ ):將陰性對照、陽性對照按?οομ 1/孔加入包被有單克隆 抗體CP4-EPSPS AS5102的酶標(biāo)板上，37°C反應(yīng)60min，加入200μ 1/孔洗滌液洗3-5次， Imin/次，洗完后在吸水紙上拍干。其余步驟同步驟（2)到（5)。
[0035] 本發(fā)明之四提供了一種如上所述的試劑盒的應(yīng)用。
[0036] 本發(fā)明之五提供了一種DNA序列，所述DNA序列包括編碼如上所述的單克隆抗體 的重鏈可變區(qū)的DNA序列，以及編碼如上所述的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的DNA序列。
[0037] 在一個具體的實施例中，編碼所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)的DNA序列為如SEQ ID Ν0:3所示的序列，編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的DNA序列為如SEQ ID Ν0:4所示的序 列。
[0038] 本發(fā)明之六提供了一種細胞，所述細胞中含有如上所述的DNA序列。
[0039] 在一個具體的實施方式中，所述DNA序列可以是內(nèi)源的或外源的DNA序列，并且可 以表達如上所述的單克隆抗體。
[0040] 在一個具體的實施方式中，所述細胞可以選自真核細胞株或原核細胞株；所述細 胞優(yōu)選大腸桿菌表達細胞株、酵母表達細胞株、昆蟲表達細胞株、鼠源性雜交瘤株；特別優(yōu) 選保藏編號為CGMCC NO: 10099的雜交瘤細胞株。
[0041] 本發(fā)明中的術(shù)語"CP4-EPSPS蛋白"是指抗草甘膦抗性蛋白-5-烯醇丙酮酰-莽草 酸-3-憐酸合成酶（5_enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)全蛋白，基 因編碼序列如 Genbank Accession No. AF464188 的序列。
[0042] 本發(fā)明中的術(shù)語"單克隆抗體（Mb) "是指含有由唯一輕鏈基因產(chǎn)物和唯一重鏈基 因產(chǎn)物組成的唯--個物種的抗體群體。具體而言，在群體的所有分子中單克隆抗體的互 補性決定區(qū)域（CDR)相同。Mab含有能夠免疫結(jié)合特征在于對其有獨特親和力的抗原的特 定表位的抗原結(jié)合位點。其包括天然的或遺傳修飾的形式，諸如單鏈的、嵌合的、合成的、 重組的、雜合的、突變的、嫁接的和體外制備的抗體。其也可以包括如Fab、F(ab'）2、Fv、 scFv、FcU dAb、Fe和其他組合物，尤其是保持抗原結(jié)合功能的抗體片段，或含有與抗原結(jié)合 結(jié)構(gòu)域的任何多肽，以及融合至另一多肽的、包含與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等 同物也包括在其中。還可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補性決定區(qū)（CDRs) 的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。此外，也對雜交瘤細胞或產(chǎn)生抗 體的其它細胞進行遺傳突變或其它改變，可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。 具體來說，"單克隆抗體"也可用重組DNA方法獲得，例如根據(jù)本發(fā)明公開的DNA人工合成或 用PCR法擴增得到，將該序列連入合適的表達載體中，在適合本發(fā)明抗體表達的條件下，培 養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細胞，然后本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā) 明的單克隆抗體。
[0043] 本發(fā)明中的短語"特異性結(jié)合"是指這樣的結(jié)合反應(yīng)，在所述結(jié)合反應(yīng)中結(jié)合對的 兩個成員（例如，抗體和包含該抗體目標(biāo)表位的分子）彼此結(jié)合的親和性比所述成員對異 質(zhì)混合物其他組分（例如，雜交瘤培養(yǎng)物上清液或其他蛋白的混合物）的親和性高至少100 倍。
[0044] 在本發(fā)明中沒有特殊說明的情況下，本發(fā)明中的術(shù)語均屬于現(xiàn)有技術(shù)中所指的通 用術(shù)語。
[0045] 在本說明書中，用語"包含"或者諸如"包括"的變形應(yīng)理解為表示包括一個指定 的元素、整數(shù)或步驟或者元素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他元素、整數(shù)或步驟或者 元素、整數(shù)或步驟的組。用語"可以"或其變形應(yīng)理解為表示可以選擇指定的元素、整數(shù)或 步驟或者元素、整數(shù)或步驟的組，但也可以不是選擇指定的元素、整數(shù)或步驟或者元素、整 數(shù)或步驟的組，而是根據(jù)實際情況進行等同替換或其他相應(yīng)的選擇。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1經(jīng)純化后的在大腸桿菌中表達的CP4-EPSPS蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中M 為蛋白Marker。
[0047] 圖2利用本申請制備的單克隆抗體CP4-EPSPS AS5102與CP4-EPSPS蛋白的 Western blot，其中 M 為蛋白 Marker。
[0048] 圖3單克隆抗體CP4-EPSPS AS5102與轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因材料的Western blot。
[0049] 細朐保藏
[0050] 小鼠骨髓雜交瘤細胞株AS5102保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏 編號為CGMCC N0:10099,保藏日期為2014年12月4日。中國普通微生物菌種保藏管理 中心的地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101。小鼠骨髓雜交瘤細胞株 AS5102產(chǎn)生的單克隆抗體為CP4-EPSPS AS5102。

【具體實施方式】
[0051] 下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做以下詳細說明。但這些實施例僅是范例性的， 并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精 神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改和替換，但這些修改和替換均落 入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0052] 實施例1
[0053] 抗原的制備
[0054] 設(shè)計CP4_EPSPS(序列如SEQ ID NO:5)的引物，在引物的兩端分別加入NdeI和 XhoI位點，然后將CP4-EPSPS基因克隆到pET30a表達載體上，抗性為卡那霉素。最終在 B121中表達，基本條件為在抗性條件下，25°C低溫誘導(dǎo)過夜。
[0055] 利用His標(biāo)簽對誘導(dǎo)產(chǎn)生的上述蛋白進行純化，條件為15mM咪唑洗脫，60mM咪唑 洗滌，150mM咪唑洗脫，300mM咪唑洗脫。將150mM咪唑洗脫獲得的組分用IOmM Tris-HCl透 析，測定蛋白質(zhì)濃度為0. 9mg/ml。純化后的CP4-EPSPS蛋白（序列如SEQ ID N0:6)SDS-PAGE 電泳圖見圖1。
[0056] 實施例2
[0057] 單克隆抗體的制備
[0058] 1)動物免疫
[0059] 用CP4-EPSPS蛋白按60 μ g/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小 鼠，編號為：1、2、3、4。皮下第一次加強免疫，蛋白的免疫量為30 μ g/只；皮下第二次加強免 疫，蛋白的免疫量為30 μ g/只；皮下第三次加強免疫，蛋白的免疫量為30 μ g/只；皮下第 四次加強免疫，蛋白的免疫量為30 μ g/只；眼眶取血，測血清效價。
[0060] 2)免疫效價檢測
[0061] 步驟：將CP4-EPSPS蛋白用包被液，2μ g/ml，4°C包被過夜；2%脫脂牛奶，37°〇封 閉2h ;血清從200倍開始2倍梯度稀釋，空白對照（blank)為PBS，陰性對照（negative)為 陰性血清200倍稀釋。結(jié)果：選取免疫效價最高3號小鼠做腹腔沖擊細胞融合實驗。
[0062] 3)細胞融合實驗
[0063] 用上述純化的CP4-EPSPS蛋白免疫原50 μ g，腹腔沖擊3號小鼠。取小鼠脾細胞與 SP2/0細胞，采用PEG法進行融合。融合完細胞用半固體培養(yǎng)基（含HAT)進行篩選培養(yǎng)。
[0064] 實驗器材
[0065] 滅菌的手術(shù)器械：三把剪刀、三把鑷子、一個細胞篩、一個注射器的內(nèi)芯、一個平 皿、濕盒、2個500ml燒杯、2個50ml離心管、3個15ml離心管。
[0066] 實驗試劑
[0067] 頂DM培養(yǎng)基
[0068] MDM完全培養(yǎng)基（含15 %血清）
[0069] 2. 2% 甲基纖維素：廠家：SIGMA ;貨號：M0262-100G
[0070] 新生牛血清：10ml
[0071] PEGl5OO :廠家：Roche ;貨號：78364
[0072] HAT :廠家：Sigma ;貨號：H0262-10VL
[0073] HT :廠家：Sigma ;貨號：H0137-10VL
[0074] 融合實驗步驟
[0075] i.將狀態(tài)良好的sp2/0細胞輕柔的從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，吸入到50ml離心管 中。
[0076] ii.小鼠摘眼球取血，然后拉頸處死，放入75%的酒精中浸泡5min。
[0077] iii.在平皿中倒入少量無血清的MDM培養(yǎng)基，將細胞篩及注射器內(nèi)芯放入平皿 中。用剪刀和鑷子取下小鼠的脾臟，放到細胞篩上。用注射器的內(nèi)芯輕輕地將脾充分碾碎， 將碾好的細胞吸入到裝sp2/0的離心管中，離心1500rad/min，5min。
[0078] iv.用剪刀和鑷子取下小鼠的胸腺，碾碎。將碾好的胸腺細胞到15ml離心管中，再 加入2ml的HAT，2ml的HT放在孵箱中備用。
[0079] V.將離心好的細胞，倒掉上清，用無血清的MDM培養(yǎng)基將細胞小心輕柔地吹勻， 離心（1500rad/min，5min)。
[0080] Vi.將離心好的細胞上清盡量倒掉。拍打離心管底充分懸浮細胞，將離心管放入 37°C溫水中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入Iml的PEG，加完后，在溫水中靜置lmin。然后2min內(nèi)緩 慢加入2ml的無血清的MDM培養(yǎng)基，接著2min內(nèi)緩慢加入8ml無血清的MDM培養(yǎng)基。離 心 1000rad/min,5min〇
[0081] vii.倒掉上清，加入IOml的血清，小心的將細胞吹勻，倒入前面準(zhǔn)備好的胸腺細 胞。再加入25ml滅過菌的半固體培養(yǎng)基，充分混勻。然后均勻倒入30個細胞培養(yǎng)皿中。將 細胞培養(yǎng)皿放入濕盒中，然后放入孵箱中培養(yǎng)。
[0082] 4)篩選雜交瘤細胞
[0083] 待融合的細胞培養(yǎng)至第7天時，即細胞培養(yǎng)至覆蓋10%孔底時，吸取96孔培養(yǎng) 板的孔中出現(xiàn)克隆細胞簇的培養(yǎng)上清用間接ELISA法檢測抗體含量，經(jīng)有限稀釋進行二 次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價、高特異性的細胞株，擴大培養(yǎng)，并將高效 價、高特異性的細胞株凍存。最終篩選出一株雜交瘤細胞，命名為小鼠骨髓雜交瘤細胞株 AS5102,將其保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC NO: 10099。其產(chǎn) 生的單克隆抗體命名為CP4-EPSPS AS5102。
[0084] 利用單克隆抗體 CP4-EPSPS AS5102 與 CP4-EPSPS 蛋白的 Western blot 見圖 2。
[0085] 利用單克隆抗體CP4-EPSPS AS5102與轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因材料的Western blot見圖3。
[0086] 實施例3
[0087] 單克隆抗體的特征
[0088] 1)單克隆細胞亞類鑒定
[0089] 實驗試劑包括：PBS-T為加有0. 05 %吐溫20的PBS溶液。購自于Southern Biotech的包被抗體；封閉液，溶于PBS的2% BSA和3%蔗糖；顯色液，0. 2ml A液和10 μ I 30% H2O2溶于IOml的B液中（A液：15mg/ml ABTS溶于H2O ;B液：檸檬酸緩沖液，pH4. 0); 購自于Southern Biotech的各型亞類二抗。
[0090] 實驗步驟
[0091] A.用 IOOmM PBS(pH7. 4)稀釋包被抗體至 0. 5μ g/ml，每孔加 0. lml，4°C，過夜。
[0092] PBS-T洗2次，每孔加入200 μ 1封閉液，37°C孵育2h。
[0093] C. PBS-T洗3次；每孔加入100 μ 1雜交瘤上清，37°C孵育lh。
[0094] D. PBS-T洗3次；用封閉液1 :1000(κ，λ)或I :2000稀釋的HRP標(biāo)記的抗體0. Iml 每孔，分別加入適當(dāng)?shù)目字校?7°C孵育lh。
[0095] E. PBS-T洗3次；每孔加50 μ 1底物溶液，10-20min內(nèi)于雙波長（450nm，630nm)測 吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。
[0096] 數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明單克隆抗體CP4-EPSPS AS5102的亞類為IgGl (見表1)。
[0097] 表 1
[0098]

【權(quán)利要求】
1. 一種CP4-EPSPS蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變 區(qū)，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體選自單價抗體、單 鏈抗體、雙鏈抗體、雙特異性抗體和嵌合抗體中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由保藏編號為 CGMCC NO: 10099的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項所述的單克隆抗體的應(yīng)用。
5. -種用于檢測CP4-EPSPS蛋白的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1 至3任意一項所述的單克隆抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒的應(yīng)用。
7. -種DNA序列，其特征在于，所述DNA序列包括編碼權(quán)利要求1至3任意一項所述的 單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的DNA序列，以及編碼權(quán)利要求1至3任意一項所述的單克隆抗 體的輕鏈可變區(qū)的DNA序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA序列，其特征在于，編碼所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)的 DNA序列為如SEQ ID NO: 3所示的序列，編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的DNA序列為如 SEQ ID NO:4所示的序列。
9. 一種細胞，其特征在于，所述細胞中含有如權(quán)利要求7或8所述的DNA序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的細胞，其特征在于，所述細胞選自真核細胞株或原核細胞 株；所述細胞優(yōu)選大腸桿菌表達細胞株、酵母表達細胞株、昆蟲表達細胞株、鼠源性雜交瘤 株；特別優(yōu)選保藏編號為CGMCC NO: 10099的雜交瘤細胞株。
【文檔編號】C12N5/20GK104497142SQ201410770732
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】束長龍, 張 杰, 耿麗麗, 宋福平, 彭琦, 梁影屏 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所