一種適用于磷酸肌酸酶法生產(chǎn)工藝的肌酸激酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用基因工程技術(shù)對兔肌肌酸激酶進行突變和改造，以改善肌酸激酶在磷酸激酶生產(chǎn)中作為反應(yīng)催化酶的性能表現(xiàn)。所述方法是利用基因工程技術(shù)對兔肌肌酸激酶進行多點突變，以改善肌酸激酶在磷酸肌酸生產(chǎn)中的表現(xiàn)，如酶催化能力、底物親和力、耐酸堿能力、熱穩(wěn)定性等。本發(fā)明的優(yōu)點在于通過酶突變改造可以極大的提高肌酸激酶在pH8～10，在25～45℃下的磷酸肌酸酶法生產(chǎn)工藝環(huán)境中的催化能力，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本，對于促進酶法生產(chǎn)磷酸肌酸產(chǎn)業(yè)有重要意義。
【專利說明】一種適用于磷酸肌酸酶法生產(chǎn)工藝的肌酸激酶突變體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及通過基因突變方法對兔肌肌酸激酶進行改造以適用于磷酸肌酸的酶法生產(chǎn)用酶需求。

【背景技術(shù)】
[0002]肌酸激酶(EC 2.7.3.2)通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個與細(xì)胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)。在磷酸肌酸合成途徑中起到可逆催化肌酸形成磷酸肌酸的作用，正反應(yīng)過程中需要ATP提供磷?；姿峒∷岷懈吣苕I，具有儲能作用，因此可以補償機體ATP的濃度。
[0003]磷酸肌酸，在肌肉或其他可興奮性組織(如腦和神經(jīng))中的一種高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暫時貯存形式，其可以作為心肌細(xì)胞保護劑和能量供給物，用于臨床手術(shù)和心肌缺血等輔助性治療，效果好，安全性高，社會需求大。目前在磷酸肌酸的生產(chǎn)技術(shù)中，生物酶法合成技術(shù)由于其具有無環(huán)境污染，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快和專一性強等優(yōu)點，已經(jīng)成為了磷酸肌酸生產(chǎn)工業(yè)的研究重點。
[0004]生物酶法生產(chǎn)磷酸肌酸工藝中，技術(shù)的關(guān)鍵在于肌酸激酶的使用。目前，用于此酶的生產(chǎn)提取難以規(guī)?；?，酶利用效率低等原因?qū)е铝姿峒∷嵘a(chǎn)成本過高，因而此技術(shù)一直沒有得到產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，因此尋找一種催化性能高度優(yōu)化的肌酸激酶尤為重要。目前行業(yè)內(nèi)通行的做法是將肌酸激酶固定化，提高酶的穩(wěn)定性和反復(fù)使用率，降低生產(chǎn)用酶的成本。然而，對于肌酸激酶本身的性能優(yōu)化沒有進行系統(tǒng)的研究。目前僅依靠酶的固定化技術(shù)仍然無法滿足磷酸肌酸高效生產(chǎn)的需求，生物酶法工藝的生產(chǎn)成本依然居高不下。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提出一種改造肌酸激酶的方法，以使此酶更適用于磷酸肌酸工業(yè)生產(chǎn)的需求。它能夠進一步提高酶法生產(chǎn)磷酸肌酸工藝中肌酸激酶的催化能力，進而提高磷酸肌酸生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，從而為酶法生產(chǎn)磷酸肌酸工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為利用基因工程技術(shù)，將兔肌肌酸激酶在基因?qū)用嫔蠈σ恍┕δ芪稽c進行一系列的突變，以期從中篩選到性能進一步改善的肌酸激酶，如改善酶熱穩(wěn)定性，酶催化能力，耐堿性等，以便適用于磷酸肌酸酶法生產(chǎn)中的條件需求。
[0007]利用基因工程手段對肌酸激酶進行突變的詳細(xì)過程為:
(I)以兔肌肉型的肌酸激酶(GeneBank: Nff_003159633.1，25315-33102)為基礎(chǔ)，對其進行一系列的突變，并人工合成突變肌酸激酶基因序列。其突變位點發(fā)生在PR066、CYS146、TRP210、GLY268和HIS295其中一個至三個氨基酸殘基上，相應(yīng)替換為SER、ASN、THR和ALA其中一個至三個氨基酸殘基。
[0008](2)構(gòu)建含有突變序列的克隆載體，所述克隆載體為PUC19 ;構(gòu)建含有突變序列的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體為pET21、pET15或pET28。
[0009](3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行克隆和高效表達(dá)。所述克隆大腸桿菌為DH5ci或ToplO，所述表達(dá)型大腸桿菌為BL21 (DE3)。
[0010](4)將發(fā)酵菌液通過高壓勻漿法等物理手段進行破碎，離心，利用乙醇沉淀法進行純化。此步可去除80%以上的雜蛋白，且所得到的肌酸激酶依然保持高活性，可以滿足酶固定化的需求，且純化的成本亦在可接受的范圍內(nèi)。
[0011 ] 本發(fā)明提供了一種可以應(yīng)用于肌酸激酶酶法工業(yè)生產(chǎn)的酶催化劑突變改造類型，大大提高了酶催化反應(yīng)效率，降低了生產(chǎn)成本。這些優(yōu)點都為本發(fā)明改造的肌酸激酶能夠廣泛應(yīng)用于磷酸肌酸酶法工業(yè)生產(chǎn)中提供了保障。
[0012]下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明進一步進行闡述，但這些實例不用來限制本發(fā)明的范圍。

【具體實施方式】
[0013]實施例1
1、合成突變肌酸激酶基因。所述肌酸激酶基因來源于Genebank NW_003159633.1(25315-33102)，突變位點為 GLY268，替換為 ASN 或 SER。
[0014]2、將合成的突變兔肌肌酸激酶基因和質(zhì)粒pUC19使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI進行雙酶切，回收目的片段并進行連接，將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，挑取陽性克隆并測序鑒定，獲得重組質(zhì)粒。
[0015]3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切重組質(zhì)粒及表達(dá)載體pET21+、，回收酶切得到的目的片段并進行連接，獲得重組的表達(dá)載體質(zhì)粒。
[0016]4、將重組的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3、，挑取陽性克隆，獲得肌酸激酶表達(dá)型大腸桿菌重組菌株。
[0017]5、加入 0.5mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。
[0018]6、利用高壓勻漿法破碎誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌。
[0019]7、離心沉淀取上清，預(yù)冷后加入95%冷乙醇至終濃度38%，去除雜蛋白沉淀；繼續(xù)加乙醇至終濃度50%，取沉淀，回溶于pH8.0 Tris-HCL緩沖液中，備用。
[0020]該突變酶與野生酶相比，比活力提高了 2?2.5倍，在pH 8.0?10.0范圍內(nèi)的活性也要比野生型的高1%?5%。其最適pH也向堿性方向偏移了 0.5個pH單位，在偏堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性也比野生型酶有了很大的提高。另外，突變酶的最適反應(yīng)溫度也有提高，在15°C?45°C范圍內(nèi)的酶活性要比野生型的高5%左右，其熱穩(wěn)定性也要好。
[0021]實施例2
1、合成突變肌酸激酶基因。所述肌酸激酶基因來源于Genebank NW_003159633.1(25315-33102)，突變位點為GLY268和CYS146，替換為ASN，THR或SER其中兩個。
[0022]2、其余步驟同實施例1 一致。
[0023]該突變酶與野生酶相比，比活力提高了 2?3倍，其最適pH也向堿性方向偏移了
1.2個pH單位，在pH 8.0?10.0范圍內(nèi)的活性也要比野生型的高1%?10%。在偏堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性也比野生型酶有了很大的提高。另外，突變酶在15°C?45°C范圍內(nèi)的酶活性要比野生型的高10%?20%，其熱穩(wěn)定性也有極大提高。
[0024]實施例3 1、化學(xué)合成突變肌酸激酶基因。所述肌酸激酶基因來源于Genebank NW_003159633.1(25315-33102)，突變位點為 GLY268、His295 和 CYS146，替換為 ASN、THR、ALA 或 SER 其中三個。
[0025]2、其余步驟同實施例1 一致。
[0026]該突變酶與野生酶相比，比活力提高了 2?3倍，在pH 8.0?10.0范圍內(nèi)的活性也要比野生型的高1%?15%。其最適pH也向堿性方向偏移了 I個pH單位，在偏堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性也比野生型酶有了很大的提高。另外，突變酶的最適反應(yīng)溫度也提高了 10°C左右，在15°C?50°C范圍內(nèi)的酶活性要比野生型的高10%?20%，其熱穩(wěn)定性也有極大提高。
[0027]以上所述僅為本發(fā)明個別的實施例，而不是全部的實施例。這些實施例并不用以限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他可能實施例，以及在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上對實施例所做的部分修改和改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種適用于磷酸肌酸生產(chǎn)使用的突變肌酸激酶的改造方法，其特征在于該方法包括: 用基因工程方法對兔肌肌酸激酶的關(guān)鍵功能位點進行定點突變，將合成的肌酸激酶基因連至克隆載體，轉(zhuǎn)化克隆大腸桿菌，篩選得到正確的克隆載體，重組構(gòu)建含有編碼突變肌酸激酶核苷酸序列的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入表達(dá)型大腸桿菌，構(gòu)建重組工程菌株，誘導(dǎo)表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兔肌肌酸激酶，其特征在于: 其核苷酸序列來源于GeneBank:NW_003159633.1，序列片段取自25315-33102。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌酸激酶基因突變方法，其特征在于: 對兔肌肌酸激酶的突變位點發(fā)生在PR066、CYS146, TRP210、GLY268和HIS295其中一個至三個氨基酸殘基上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因突變方法，其特征在于: PR066、CYS146、TRP210、GLY268和HIS295其中一個至三個氨基酸殘基上，替換為SER、ASN、THR和ALA其中一個至三個氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程技術(shù)，其特征在于: 所述的大腸桿菌克隆載體為PUC19，所述表達(dá)載體為pET21、pET15或peT28，所述克隆大腸桿菌為DH5a或Top 10，所述表達(dá)型大腸桿菌為BL21 (DE3)。
【文檔編號】C12N9/12GK104357420SQ201410716476
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】藺宗, 吳學(xué)強, 周海夢, 姚玲 申請人:杭州清科生物科技有限公司