肝癌檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種肝癌檢測試劑盒，所述試劑盒包括有cel-miR-39序列，以及用于cel-miR-39、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-4446-3p和hsa-miR-486-3p實時定量PCR的引物。在對患者使用甲胎蛋白進行肝癌檢測之后，再使用本發(fā)明提供的檢測試劑盒進行輔助檢測，可以有效去除甲胎蛋白檢測的假陽性結(jié)果，從而避免給患者帶來巨大的精神壓力和財產(chǎn)損失。
【專利說明】肝癌檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種肝癌檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] miRNA(microRNA)是細胞內(nèi)長度為18-25個核苷酸的非編碼小RNA。miRNA通過 與革巴基因mRNA的3'UTR(untranslatedregion)不完全互補結(jié)合，抑制祀基因的翻譯。自 1993年，在線蟲（Caenorhabditiselegans)中鑒定出第一個miRNAlin_4,越來越多的 miRNA在不同的生物中被鑒定出。目前為止，在人類組織中已發(fā)現(xiàn)超過一千種miRNA。目前 認為，10-30%的人類基因都受到miRNA的調(diào)控。
[0003] 癌癥的早期診斷對其成功治愈有重要的作用。容易獲得并且穩(wěn)定的生物學(xué)標記能 夠提供一系列相關(guān)的有價值的腫瘤生物學(xué)信息。甲胎蛋白（AFP)是目前肝癌（HCC)診斷的 主要血清學(xué)指標，但是甲胎蛋白檢測的敏感性和特異性仍不高，假陽性率較高，因為人們對 癌癥的恐懼心理，假陽性的檢測結(jié)果容易給患者造成巨大的精神壓力和財產(chǎn)損失。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中，甲胎蛋白對肝癌的檢測結(jié)果假陽性較高的問題，本發(fā)明提 供一種肝癌檢測試劑盒，用于輔助甲胎蛋白對肝癌的檢測，可以有效去除假陽性的檢測結(jié) 果。
[0005] 作為本發(fā)明的一個方面，涉及一種肝癌檢測試劑盒，所述試劑盒包括 有cel-miR-39 序列，以及用于cel-miR-39、hsa-miR-10a_5p、hsa-miR-100_5p、 hsa-miR-30b_5p、hsa-miR-99a_5p、hsa-miR-1271_5p、hsa-miR-136_3p、hsa_let-7b_5p、 hsa-let-7f-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-4446-3p和hsa-miR-486_3p實 時定量PCR的引物。
[0006]所述試劑盒還可以包括有hsa-let_7a_3p、hsa-let-7f-2_3p、hsa-miR-106a_5p、 hsa-miR-1180、hsa-miR-1224_5p、hsa-miR-1255b_5p、hsa-miR-204_5p、hsa-miR-2392、 hsa-miR-3158_3p、hsa-miR-3163、hsa-miR-3200_5p、hsa-miR-455_5p、hsa-miR-4732_3p、 hsa-miR-4732-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-5010-5p、hsa-miR-654-3p實時定量PCR的引 物。
[0007] 所述試劑盒還可以包括有，加了抗凝劑的真空采血管和真空采血針組件。所述抗 凝劑為K3EDTA。
[0008] 所述試劑盒還可以包括有,反轉(zhuǎn)錄試劑及實時定量PCR試劑。所述反轉(zhuǎn)錄試劑是 指Qiagen公司的miScriptIIRT試劑盒。所述實時定量PCR試劑是指Qiagen公司的 miScriptSYBRGreenPCRKit〇
[0009] 采用上述方案后，本發(fā)明至少能夠?qū)崿F(xiàn)如下有益效果：
[0010] 在對患者使用甲胎蛋白進行肝癌檢測之后，再使用本發(fā)明提供的檢測試劑盒進行 輔助檢測，可以有效去除甲胎蛋白檢測的假陽性結(jié)果，從而避免給患者帶來巨大的精神壓 力和財產(chǎn)損失。
[0011] 本發(fā)明所提供試劑盒，采用的miRNA均為現(xiàn)有報道已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA，其測序所用 接頭和擴增引物均有成熟的市售商品，可以方便的從市場上獲得，試劑盒易于制備。

【具體實施方式】
[0012] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的 理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0013] 實驗例1
[0014] 與肝癌相關(guān)度較高miRNA的篩選
[0015] 1.血漿分離操作
[0016]1)采取新鮮血液放入K3EDTA真空采血管（BD)，在收取血液后兩小時內(nèi)分離血漿。 在分離前，血液一直保存在冰上。
[0017]2)利用冷凍離心機（Centrifuge5804R，Eppendorf)，4°C從血液內(nèi)分兩步離心 分離血漿：500g離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的15毫升離心管內(nèi)；1800g離心10分鐘，得 到的上清即為用于建庫的血漿。
[0018] 3)每8毫升血液得到約4毫升血楽，分離得到的血漿-80°C保存。
[0019] 2.血漿中總RNA的提取
[0020] 冷凍保存的血漿（來自步驟1)在冰上融化，并輕輕顛倒混勻。
[0021] 將血漿分至1. 5毫升的無核酸酶污染的離心管中，每管600微升。
[0022] 每管加入等體積（600微升）的TRIZOL(Invitrogen)，充分震蕩混勻。
[0023] 室溫靜置3分鐘后，每管加入1/5體積（120微升）的氯仿（北京化工廠），充分震 蕩混勻，室溫靜置3分鐘。
[0024] 4°C16000g(Centrifuge5417R，Eppendorf)離心 15 分鐘。
[0025] 轉(zhuǎn)移上清至I. 5毫升無核酸酶污染的離心管中，每管約700微升上清。
[0026] 每管加入等體積（700微升）的異丙醇（北京化工廠）和0.5微升肝糖 (Invitrogen)，輕輕顛倒混勻。
[0027] 在_80°C冰箱內(nèi)沉淀過夜。
[0028] 4°C16000g離心 30 分鐘。
[0029] 去除溶液，每管加入750微升75%酒精，上下顛倒，充分洗沉淀。
[0030] 4°C16000g離心 10 分鐘。
[0031] 充分去除溶液，在室溫下干燥沉淀至沉淀剛好變成透明。
[0032] 每管加入10微升無核酸酶污染的雙蒸水，室溫下溶解15分鐘，并充分混勻。
[0033]將所有管的總RNA合并，并用nano-drop1000(ThermoScientific)測定總RNA的 量。
[0034] 取1微克RNA，放在37°C蒸干，使RNA最終體積為5微升。
[0035] 以下，步驟3-6中使用的試劑均來自TruSeqSmallRNASamplePrep Kits(Illumina)〇
[0036] 3.3'接頭的連接
[0037] 5微升總RNA(來自步驟2)中加入1微升，稀釋后濃度為0. 25納摩爾的3'接頭 (IIlumina)，混勻，70°C熱激2分鐘，并迅速放在冰上。
[0038] 在200微升薄壁PCR管中依次加入如下試劑：1微升T4RNALigase2, 2微升 LigationBuffer, 1 微升RNaseInhibitor。
[0039] 將溶液混勻，置于PCR儀上，28°C孵育2小時。
[0040]加入 1 微升StopSolution,混勻后，28°C15 分鐘。
[0041] 4. 5'接頭的連接
[0042] 取I. 1微升稀釋后濃度為0.25納摩爾的5'接頭（Illumina)，在70°C熱激2分鐘， 并迅速放在冰上。
[0043] 在已有I. 1微升5'接頭的200微升薄壁PCR管中依次I. 1微升ATP和I. 1微升 T4RNALigase1。
[0044] 向11微升RNA樣本中加入3微升上述混合物。
[0045] 將溶液混勻，置于PCR儀上，28°C孵育1小時。
[0046] 5.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0047] 在200微升薄壁PCR管中依次加入，14微升連接5'和3'接頭的RNA和1微升RNA RT引物，在70°C熱激2分鐘，并迅速放在冰上。
[0048] 依次加入下列試劑（Illumina) :4微升5XFirstStrandBuffer、2微升100毫摩 爾DTT、1 微升 12. 5 毫摩爾dNTPs、l微升RNaseInhibitor、1 微升SuperscriptIIReverse Transcriptase。
[0049] 將溶液混勻，置于PCR儀上，程序為：25°C10分鐘，42°C65分鐘，70°C15分鐘， 4Γ保持。
[0050] 6.PCR擴增
[0051] 在反轉(zhuǎn)錄步驟后獲得的，裝有24微升cDNA樣本的200微升薄壁PCR管中，依次加 入如下試劑（Illumina) :26微升PCR混合物、1微升RNAPCR引物、1微升RNAIndex引物。
[0052] 將以上溶液混勻，置于PCR儀上。在樣品放置前，PCR儀預(yù)熱至65°C以上。
[0053]PCR循環(huán)設(shè)置如下：
[0054] 98?30 秒；
[0055]I5個循環(huán)：
[0056] 98?10 秒、6(TC30 秒、72?15 秒；
[0057] 72°C5 分鐘。
[0058]7.電泳及膠回收
[0059] 在電壓100伏下預(yù)跑15%TBE-PAGE膠15分鐘。
[0060] 每管PCR產(chǎn)物中加入10微升6XGel上樣染料（Fermentas)，混勻。
[0061] 每個樣品點到連續(xù)的三個點樣孔中，每個空中加入20微升樣品。樣品與Low麗 Ladder(BiooScientific)有至少一個點樣孔的間距。
[0062] 在電壓200伏，跑約50分鐘，至下面的淺藍色染料剛好跑出。
[0063] 用SYBRGold(Invitrogen)在室溫下染膠15分鐘，之后在紫外燈下，將片段大小 在HObp左右的膠切下。
[0064] 使用200微升薄壁PCR管和1. 5毫升離心管做的嵌套管，利用離心機，將膠塊變成 小的顆粒，以利于核酸的回收。
[0065] 每個樣品得到的小膠顆粒中加入300微升ElutionBuffer,利用垂直混合儀，在 室溫下溶解過夜。
[0066] 在室溫下16000g離心2分鐘。
[0067]將上清轉(zhuǎn)移至離心柱中（Ambion)，在室溫下16000g離心2分鐘，以充分除去膠顆 粒。
[0068] 將過濾液轉(zhuǎn)移至新的無核酸污染的1. 5毫升離心管中，每管加入750微升 無水乙醇（北京化工廠）、30微升濃度為3摩爾每升的NaOAc(北京化工廠）、1微升 C〇-precipitant (Bioo Scientific)。
[0069] _20°C沉淀兩小時。
[0070] 4°C16000g離心 30 分鐘。
[0071] 輕輕去除上清，用800微升75%乙醇洗沉淀。
[0072] 4°C16000g離心10分鐘。去除上清，并在室溫下干燥沉淀至沉淀剛好變成透明。
[0073] 每管加入10微升無核酸酶污染的雙蒸水，室溫下溶解15分鐘，并充分混勻。
[0074] 8.庫的質(zhì)量檢測
[0075] 使用Agilent Bioanalyzer分析庫中核酸的片段大小。
[0076]使用實時定量PCR檢測庫中含有接頭序列的核酸量。因為實時定量PCR的引物是 根據(jù)接頭的核酸序列設(shè)計的（此過程可由接頭提供商進行），因此，只有與雙端接頭連接上 的核酸可以被檢測到。當檢測結(jié)果顯示核酸量均大于3. 5納摩爾每升時，可用于二代測序。 [0077] 將樣本進行二代測序。
[0078] 9.測序數(shù)據(jù)分析
[0079] 將原始fastq數(shù)據(jù)進行去低質(zhì)量值、去接頭（由Illumina公司提供）、保留插入序 列長度大于16nt的處理，并將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為fasta形式，同時將相同序列進行合并。
[0080] 利用blast軟件包將處理過的數(shù)據(jù)與miRBase下載的參考序列進行比對，比對要 求：e值小于0. 05;第一位必須完全匹配；3'端允許左移1位或右移3位；允許1個位置不 匹配。
[0081] 記錄數(shù)據(jù)總量，比對上miRNA的序列數(shù)，miRNA的種類數(shù)以及序列數(shù)大于10的 miRNA種類數(shù)。
[0082] 將至少在一個樣本中表達量序列數(shù)大于10的miRNA的種類和表達量匯總。
[0083] 利用R軟件中的DEseq軟件包尋找腫瘤血漿和正常血漿兩個樣本差異表達的 miRNA。
[0084] 實驗結(jié)果
[0085] 將樣本血漿miRNA建庫、二代測序后，樣本基本數(shù)據(jù)如表1所示。
[0086] 表1:14個血漿樣本的測序數(shù)據(jù)信息
[0087]

【權(quán)利要求】
1. 一種肝癌檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括有cel-miR-39序列，以及用 于 cel-miR-39、hsa-miR-10a_5p、hsa-miR-100_5p、hsa-miR-30b_5p、hsa-miR-99a_5p、 hsa-miR-1271_5p、hsa-miR-136_3p、hsa_let-7b_5p、hsa-let_7f-5p、hsa-miR-16_5p、 hsa-miR-432-5p、hsa-miR-4446-3p 和 hsa-miR-486-3p 實時定量 PCR 的引物。
2. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括有hsa-let-7a_3p、 hsa-let-7f-2_3p、hsa-miR-106a_5p、hsa-miR-1180、hsa-miR-1224_5p、 hsa-miR-1255b_5p、hsa-miR-204_5p、hsa-miR-2392、hsa-miR-3158_3p、hsa-miR-3163、 hsa-miR-3200_5p、hsa-miR-455_5p、hsa-miR-4732_3p、hsa-miR-4732_5p、hsa-miR-4770、 hsa-miR-5010-5p 和 hsa-miR-654-3p 實時定量 PCR 的引物。
3. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括有，加了抗凝劑的真空采 血管和真空采血針組件。
4. 權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述抗凝劑為K3EDTA。
5. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括有，反轉(zhuǎn)錄試劑及實時定 量PCR試劑。
6. 權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述反轉(zhuǎn)錄試劑是指Qiagen公司的 miScript II RT 試劑盒。
7. 權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述實時定量PCR試劑是指Qiagen公司的 miScript SYBR Green PCR Kit〇
【文檔編號】C12Q1/68GK104357566SQ201410612498
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】李春燕, 劉珍珍, 邵小健, 呂雪梅, 吳仲義 申請人:中國科學(xué)院北京基因組研究所