一種新型白木香倍半萜合成酶及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型白木香倍半萜合成酶及其編碼基因和應用。白木香倍半萜合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPS1在檢測白木香樹體的結香水平中的應用。鑒于目前關于白木香倍半萜合成酶基因的報道較少，因此本發(fā)明所提供的白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPS1及其在白木香不同部位的表達水平在檢測白木香樹體中的結香水平具有重要的應用價值，對提高結香品質具有十分重要的現(xiàn)實意義。
【專利說明】一種新型白木香倍半萜合成酶及其編碼基因和應用

【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于基因生物領域，具體涉及一種新型白木香倍半萜合成酶及其編碼基因 和應用。

【背景技術】：
[0002] 沉香具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，在治療消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾 病、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病有顯著療效，在抗腫瘤、抗風濕病以及抗衰老等方面也 有較好的作用（劉軍民，徐鴻華.國產(chǎn)沉香研究進展.中藥材，2005, 28(7) :627-632)。 白木香經(jīng)機械誘導、化學損傷或真菌誘導后會形成沉香，而沉香中的主要成分包括倍半 萜類化合物。白木香的轉錄組測序結果表明，白木香倍半萜合成酶是沉香生物合成的 關鍵酶（吳宏清，王磊，何欣，白玲，高曉霞，嚴寒靜，章衛(wèi)民.白木香倍半萜合成酶基因 As-SesTPS的克隆及生物信息學與表達分析，2014,45(1) :94-101)。人工沉香與天然沉 香相比，其主要藥效成分倍半萜類化合物相對較低（GaoXX，XieMR，LiuSF，GuoX L，ChenXY，ZhongZJ,WangL，ZhangWM.Chromatographicfingerprintanalysisof metabolitesinnaturalandartificialagarwoodusinggaschromatography-mass spectrometrycombinedwithchemometricmethods.JournalofChromatography B，2014, 967:264-273)，因此其品質也不如天然沉香，而倍半萜合成酶是倍半萜類化合物形 成的關鍵酶，因此對白木香倍半萜合成酶基因的克隆和鑒定能為提升人工結香技術提供理 論指導，對于提升人工沉香的品質有十分重要的意義。
[0003] 目前，多種不同植物種類的倍半萜類合成酶基因已經(jīng)被成功克隆，但沉香倍半萜 合酶相關基因的生物合成研究并不多，僅克隆得到主產(chǎn)物為愈創(chuàng)木烯的倍半萜合成酶基因 (KumetaY,ItoM.Characterizationof6-guaienesynthasesfromculturedcellsof Aquilaria,responsiblefortheformationofthesesquiterpenesinagarwood[J]. PlantPhysiol, 2010, 154(4) : 1998-2007 ;岳躍沖，范燕萍.植物萜類合成酶及其代謝調控 的研究進展.園藝學報，2011，3 (2) :379-388)。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種新型白木香倍半萜合成酶。
[0005] 本發(fā)明的白木香倍半萜合成酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0006] 本發(fā)明第二個目的是提供編碼上述白木香倍半萜合成酶的白木香倍半萜合成酶 基因As-SesTPSl，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的是提供白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPSl在檢測白木香 樹體的結香水平中的應用。
[0008] 本發(fā)明克隆得到了白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPSl，進化樹分析結果表明 該基因屬于被子植物倍半萜合成酶基因組成的TPSa亞族，與該基因同源性最高的基因為 S_愈創(chuàng)木烯合成酶基因，其氨基酸序列同源性也僅僅為54%，因此推測為一種新型的白 木香倍半萜合成酶基因。通過熒光定量PCR分析該基因在白木香結香部位（含有大量沉 香）、過渡部位（含有少量沉香，位于結香和未結香之間的部位）和未結香部位（無沉香） 的表達水平，可作用于檢測白木香樹體的結香水平，為評價沉香品質提供重要的分子生物 學依據(jù)。
[0009] 本發(fā)明所提供的白木香倍半萜合成酶具有以下的理化特性：該基因所編碼蛋白 的分子量為64. 14kD，等電點為5. 14,為酸性蛋白，其半衰期在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細胞為 30h，在酵母體內(nèi)大于20h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10h。不穩(wěn)定系數(shù)為44. 57,為不穩(wěn)定蛋白。 該基因所編碼的蛋白能催化底物法尼基焦磷酸生成倍半萜類化合物，為沉香生物合成途徑 中的關鍵基因。
[0010] 鑒于目前關于白木香倍半萜合成酶基因的報道較少，因此本發(fā)明所提供的白木香 倍半萜合成酶基因As-SesTPSl及其在白木香不同部位的表達水平在檢測白木香樹體中的 結香水平具有重要的應用價值，對提高結香品質具有十分重要的現(xiàn)實意義。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0011] 圖1為白木香不同部位所提取RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳鑒定：1為未結香樣品； 2為過渡樣品；3為結香部位樣品
[0012] 圖2為白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPSl的瓊脂糖凝膠電泳鑒定：1為以 RT-PCR得到的cDNA作為模板擴增得到的白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPSl的序列；2 為以白木香基因組為模板擴增得到的序列；3為RT-PCR得到的cDNA;4為DL2000marker;
[0013] 圖3為植物萜類合成酶基因家族系統(tǒng)進化樹；
[0014] 圖4為白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPSl在白木香不同部位的表達水平分析： A.qPCR分析表達水平，其中沉香樣品、過渡樣品和白木樣品分別為結香部位樣品、過渡樣 品、未結香樣品；B.瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其中1、2、3、4、5、6、7、8分別為內(nèi)參基因Histone 在白木香結香部位、過渡部位、未結香部位、空白對照、As-SesTPSl基因在白木香結香部位、 過渡部位、未結香部位、空白對照的表達情況。
[0015] 圖5為含As-SesTPSl所編碼倍半萜合成酶重組菌上清催化底物法尼基焦磷酸產(chǎn) 物GC-MS鑒定圖：A.未誘導重組菌上清酶促反應產(chǎn)物B.IPTG誘導后重組菌上清酶促反應 產(chǎn)物。

【具體實施方式】：
[0016] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0017] 實施例1 :
[0018] 白木香不同結香部位RNA的提取，包括如下步驟：
[0019] (1)將樣品（未結香樣品、過渡樣品或結香部位樣品）于液氮中充分研磨，加入含 有@ -巰基乙醇的提取液取500iiL至1. 5mL離心管中，震蕩混勻，12000r/min離心lOmin， 取上清；
[0020] (2)等體積的抽提液I再一次抽提，12000r/min離心5min，取上清；加入等體積的 抽提液II，劇烈震蕩，12000r/min離心8min,取上清；
[0021] (3)加入1/2體積無水乙醇，與上清等體積的4mol/LLiCl，終濃度1%的0 -巰基 乙醇，反復顛倒混勻，_30°C靜置4h或過夜，12000r/min4°C離心lOmin;
[0022] (4)沉淀溶于適量DEPC水中，加入1/10體積3mol/LNaAc-HAc，pH= 5. 2,混勻后， 加入3倍體積無水乙醇，-30°C靜置30min，12000r/min4°C離心lOmin;棄去上清液，75%乙 醇洗滌沉淀2次，沉淀溶于30yLDEPC水中，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0023] 上述的改良異硫氰酸胍-CTAB提取液成分為38%水飽和酚，lmol/L異硫氰酸胍， 2%CTAB，100mmol/LNaAc-HAcpH= 5. 2,2mol/LNaCl，2%PVP;抽提液I成分為水飽和 酚：氯仿：異戊醇=25 : 24 : 1 ;抽提液II成分為氯仿：異戊醇=24 : 1。
[0024] 所提取得到的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖1所示，分別獲得未結香樣 品、過渡樣品、結香部位樣品的RNA。結果顯示所提RNA的28S與18S條帶明亮清晰，28SRNA 亮度約為18SRNA亮度的2倍，且兩條帶均無明顯拖尾。經(jīng)紫外分光光度計檢測0D26(I/28(I大 小在1. 8-2. 0之間，RNA完整性較好，未發(fā)生降解，可滿足后續(xù)實驗要求。
[0025] 實施例2:白木香cDNA序列的獲得，具體包括如下步驟：
[0026] 以提取得到的結香部位樣品的RNA為模板，以01igo(dT)15隨機引物進行RT-PCR 反應，反應體系如下：
[0027]

【權利要求】
1. 一種白木香倍半萜合成酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -種編碼權利要求1所述的白木香倍半萜合成酶的白木香倍半萜合成酶基因 As-SesTPSl，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 權利要求2所述的白木香倍半萜合成酶基因As-SesTPSl在檢測白木香樹體結香水 平中的應用。
【文檔編號】C12N15/60GK104342426SQ201410612415
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年11月4日 優(yōu)先權日:2014年11月4日
【發(fā)明者】葉偉, 何欣, 章衛(wèi)民, 王磊 申請人:廣東省微生物研究所