一株產(chǎn)纖維素酶菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株產(chǎn)纖維素酶的菌株，所述菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為：CGMCC No.8339，類命名為：青霉菌株P(guān)enillium piceum H16。所述青霉菌株是將在秸稈中篩選得到的菌株P(guān)enillium piceum 9-3為出發(fā)菌株經(jīng)誘變處理后得到的。本發(fā)明將Penillium piceum 9-3做為出發(fā)菌株誘變育種，選育得到一株產(chǎn)高活力纖維素酶的青霉菌株P(guān)enillium piceum H16，所述青霉菌株H16發(fā)酵得到的纖維素酶粗酶液，其濾紙酶活力達(dá)到7IU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活力達(dá)到50IU/mL。通過將所述青霉菌株H16和里氏木霉RUT-C30的不同纖維素酶系進(jìn)行不同配比研究，得出在最優(yōu)配比時(shí)大幅度高了酶活以及對(duì)微晶纖維素的水解率，降低了用酶成本。
CGMCC No8339
2013.10.15
【專利說明】一株產(chǎn)纖維素酶菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明微生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一株產(chǎn)纖維素酶菌株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 人類進(jìn)入21世紀(jì)以來，在能源、資源、環(huán)境等方面面臨著越來越嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。纖維 素是地球上最大的可再生性有機(jī)資源，利用這些廉價(jià)的、可再生的植物纖維素原料來生產(chǎn) 生物基產(chǎn)品以及生物質(zhì)能，對(duì)人類的可持續(xù)發(fā)展是非常有利的。纖維素是植物細(xì)胞壁的主 要成分，是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上。在我國， 每年有數(shù)億噸的農(nóng)作物秸桿被焚燒掉，既污染了環(huán)境又浪費(fèi)了資源。目前纖維素糖化的方 法主要有酸解法和酶解法，但酸解法有耗能大、對(duì)設(shè)備損耗大、污染大等缺點(diǎn)，因此酶解法 將是纖維素酶糖化的主要趨勢。但由于纖維素酶的生產(chǎn)成本過高，導(dǎo)致木質(zhì)纖維素降解成 本過高，使得無法真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。因此，為了提高酶水解效率，降低工業(yè)生產(chǎn)中纖維素酶 的成本，世界各國科學(xué)家圍繞纖維素酶展開了廣泛的研究，包括菌株的篩選、發(fā)酵工藝的優(yōu) 化等等。
[0003] 纖維素酶是使纖維素降解生成葡萄糖的一組酶的總稱，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、 外切葡聚糖酶和β_葡萄糖苷酶。纖維素酶的三個(gè)組分經(jīng)過協(xié)同作用，將大分子的纖維素 降解為低分子量的寡糖、雙糖或多糖。纖維素酶廣泛的應(yīng)用于食品加工業(yè)、釀造業(yè)、造紙工 業(yè)、飼料添加劑、紡織工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域、植物細(xì)胞融合等方面。
[0004] 目前，纖維素酶的生產(chǎn)方法一般是固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵成本低，但易污 染雜菌，不易提取，難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。而液態(tài)發(fā)酵，屬于密閉式發(fā)酵，發(fā)酵過程中 不易污染，且發(fā)酵條件以控制，后期分離提取酶液簡便，因此便于大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)高活性 的纖維素酶除具有優(yōu)良的發(fā)酵工藝路線，包括培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等，最關(guān)鍵的因 素是選育高產(chǎn)菌株。
[0005] 纖維素酶的產(chǎn)生菌包括細(xì)菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纖維素酶生產(chǎn)的菌 種主要為絲狀真菌。絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶酶系較全，且其產(chǎn)生的酶多為胞外酶，便于后 期的分離提取。目前研究較多的菌包括木霉、曲霉等，例如里氏木霉、黑曲霉，尤以木霉屬最 為受關(guān)注，而對(duì)青霉屬的報(bào)道較少。本發(fā)明所表述的即為一株高產(chǎn)纖維素酶的青霉屬菌株。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一株產(chǎn)纖維素酶菌株。本發(fā)明是利用誘變方法對(duì)出發(fā)菌株進(jìn) 行誘變篩選出更高產(chǎn)的纖維素酶菌株，并且所述纖維素酶的酶活力得到了很大提高。本發(fā) 明對(duì)儀器設(shè)備要求低，操作簡單，很大程度上降低了用酶成本。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：
[0008] -株產(chǎn)纖維素酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中國微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為：CGMCC No. 8339,分類命名為：檜狀青霉Penicillium piceum，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為：2013年10月15 曰。
[0009] 本發(fā)明的檜狀青霉Penicillium piceum的形態(tài)學(xué)特征為：
[0010] 本發(fā)明的檜狀青霉H16的形態(tài)學(xué)特征為：菌株H16在PDA培養(yǎng)基上30°C恒溫培養(yǎng) 2d即可看到清晰的白色菌落，菌落開展，絨狀，4?5d時(shí)表層著生一層墨綠色分生孢子粉， 菌株生長后期背面觀察呈黃色。孢子的顏色較出發(fā)菌株P(guān)enillium piceUm9-3相比要深， 出發(fā)菌株為黃綠色，H16的孢子為墨綠色。
[0011] 所述青霉菌株H16是將菌株P(guān)enillium piceum9-3經(jīng)誘變方法處理后篩選得到 的。
[0012] 所述誘變篩選方法包括以下步驟：
[0013] 1)在所述菌株P(guān)enillium piceum9_3的孢子懸液中添加硫酸二乙酯，所述硫酸二 乙醋添加量為使所述抱子懸液中硫Ife-乙醋的質(zhì)量百分比濃度為1 %，之后在1〇?30 C， 50?150rpm震蕩反應(yīng)10?120min，獲得所述孢子懸液的誘變處理液，備用；
[0014] 2)以所述反應(yīng)時(shí)間為準(zhǔn)，每間隔IOmin按體積比為1 : 9取出誘變處理液與濃度 為25%的硫代硫酸鈉溶液進(jìn)行混合，獲得誘變終止液并根據(jù)時(shí)間順序編號(hào)；
[0015] 3)將編號(hào)的所述誘變終止液按順序分別涂布PDA平板，25?33 °C培養(yǎng)直至長出單 菌落；
[0016] 4)將所述單菌落通過對(duì)比在剛果紅平板上透明圈與菌落直徑之比的大小和發(fā)酵 培養(yǎng)測定粗酶液酶活力的方法篩選得到所述青霉菌株H16。
[0017] 所述步驟1)所述反應(yīng)時(shí)間為60min。
[0018] 所述青霉菌株H16應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶。
[0019] -株應(yīng)用權(quán)利要求1?5所述產(chǎn)纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，用 于培養(yǎng)所述產(chǎn)纖維素酶菌株的培養(yǎng)基的組分含量為：微晶纖維素 10?30g/L，葡萄糖1? l〇g/L，玉米楽干粉10?20g/L，硫酸銨1?10g/L，磷酸二氫鉀1?10g/L，硫酸鎂1?IOg/ L以及加水至1L。
[0020] 優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)條件為：溫度為26?32°C，轉(zhuǎn)速為150?250rpm震蕩培養(yǎng)， 初始PH為5.0?6.0,接種量為1?5%，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為96?144h。
[0021] 優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)條件為：初始pH為5. 5,發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為120h。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明將Penillium piceum9_3做為出發(fā)菌株誘變育種，選 育得到一株產(chǎn)高活力纖維素酶的青霉菌株，所述菌株發(fā)酵得到的纖維素酶粗酶液，其濾紙 酶活力達(dá)到7IU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活力達(dá)到50IU/mL。通過將所述菌株H16和里氏木霉 RUT-C30的不同纖維素酶系進(jìn)行不同配比研究，得出在最優(yōu)配比時(shí)大幅度高了酶活以及對(duì) 微晶纖維素的水解率，降低了用酶成本。本發(fā)明對(duì)儀器設(shè)備要求低，操作簡單，很大程度上 降低了用酶成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明所述產(chǎn)纖維素酶菌株誘變篩選方法流程圖。
[0024] 圖2為本發(fā)明所述產(chǎn)纖維素酶菌株發(fā)酵所得粗酶液與里氏木霉RUT-C30的粗酶液 按照不同體積比例配比所得混合酶液的濾紙酶活力比較圖。
[0025] 圖3為本發(fā)明所述產(chǎn)纖維素酶菌株和里氏木霉RUT-C30的混合酶提取液與里氏木 霉酶RUT-C30提取液的水解率的比較圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0027] 實(shí)施例1 :出發(fā)菌株的培養(yǎng)
[0028] 將檜狀青霉菌株9-3在PDA斜面上連續(xù)活化兩次，在30°C恒溫箱中培養(yǎng)3-4天，之 后，4 C保存?zhèn)溆谩?br> [0029] 檜狀青霉9-3 (Penicillium piceum9-3)。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究 所，保藏日期=2011年10月9日，保藏號(hào)：CGMCC5314。
[0030] 實(shí)施例2 :硫酸二乙酯誘變篩選菌株H16 (如圖1所示）
[0031] 1)硫酸二乙酯誘變
[0032] 用pH為7的磷酸緩沖液洗下PDA斜面培養(yǎng)的孢子，無菌玻璃珠打散，兩層無菌擦 鏡紙過濾，得孢子懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為IO 6個(gè)/mL，取4mL孢子懸液，加入 到16mL的pH為7的磷酸緩沖液中，再添加0. 2mL硫酸二乙酯，在3(TC，150r/min條件下反 應(yīng)開始20min后每隔5min取反應(yīng)液0. ImL加入到0. 9mL的濃度為25%的硫代硫酸鈉中充 分混合，終止誘變反應(yīng)，然后將混合液稀釋三個(gè)梯度使混合液中菌種終濃度為IO5個(gè)/mL、 IO4個(gè)/mL、IO3個(gè)/mL，分別取三種濃度的稀釋液0. ImL涂布PDA平板，30°C培養(yǎng)直至長出單 菌落，用于檢測誘變的致死率和正突變率。如表1所示，55min時(shí)致死率（％)和正突變率 (% )幾乎達(dá)到100%。
[0033] 2)篩選
[0034] ①剛果紅染色篩選：在上述平板上選取不同處理時(shí)間、不同形態(tài)的菌落100株，接 種到含有蛋白胨l〇g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉5g/L，羧甲基纖維素鈉10g/L，磷酸二氫鉀Ig/ L，瓊脂18g/L，吐溫-802mL/L。30°C培養(yǎng)4-5天后，用濃度為1%的剛果紅染色lh。在上述 平板上選取透明圈與菌落直徑比值較大的菌落9個(gè)，接種到PDA斜面，30°C培養(yǎng)4-5天后保 存菌種。
[0035] ②發(fā)酵培養(yǎng)篩選：將上述保存的菌株接種到種子培養(yǎng)基中增值培養(yǎng)，然后接入到 發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，并對(duì)離心獲得粗酶液進(jìn)行酶活測定，經(jīng)過對(duì)比篩選得到1株酶 活較高的菌株。
[0036] 所述的種子培養(yǎng)基為：微晶纖維素20g/L，玉米漿干粉17g/L，葡萄糖2g/L。
[0037] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：微晶纖維素20g/L，玉米漿干粉17g/L，硫酸銨5g/L，碳酸鈣 2. 5g/L，磷酸二氫鉀6g/L，硫酸鎂lg/L。在30°C，200轉(zhuǎn)/min，初始pH5. 5,接種量3%，發(fā)酵 培養(yǎng)120h。
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一株產(chǎn)纖維素酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心的保藏號(hào)為：CGMCC No. 8339,分類命名為：青霉菌株P(guān)enillium piceum H16。
2. 如權(quán)利要求1所述產(chǎn)纖維素酶的菌株，其特征在于，所述青霉菌株H 16是將菌株 Penillium piceum9_3經(jīng)誘變方法處理后篩選得到的。
3. -株如權(quán)利要求2所述的產(chǎn)纖維素酶菌株的誘變篩選方法，其特征在于，向所述菌 株P(guān)enillium piceum9_3的孢子懸液中添加硫酸二乙酯進(jìn)行10?120min誘變反應(yīng)。
4. 如權(quán)利要求3所述產(chǎn)纖維素酶的誘變篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 在所述菌株P(guān)enillium piceum9-3的所述孢子懸液中添加硫酸二乙酯，所述硫酸 _乙醋添加量為使所述抱子懸液中硫Ife-乙醋的質(zhì)量百分比濃度為〇. 8?1. 2 %，之后在 10?30°C，50?150rpm震蕩反應(yīng)10?120min，獲得所述孢子懸液的誘變處理液，備用； 2) 以所述反應(yīng)時(shí)間為準(zhǔn)，每間隔8?12min取出0. 1?0. 3mL誘變處理液與硫代硫酸 鈉溶液進(jìn)行混合中和所述誘變處理液中的硫酸二乙酯以終止誘變反應(yīng)，獲得誘變終止液并 根據(jù)時(shí)間順序編號(hào)； 3) 將編號(hào)的所述誘變終止液按順序分別涂布PDA平板，25?33°C培養(yǎng)直至長出單菌 落； 4) 將所述單菌落通過對(duì)比在剛果紅平板上透明圈與菌落直徑之比的大小和發(fā)酵培養(yǎng) 測定粗酶液酶活力的方法篩選得到所述青霉菌株H16。
5. 如權(quán)利要求3所述產(chǎn)纖維素酶的菌株的誘變篩選方法，其特征在于，所述步驟1)所 述硫酸二乙酯的質(zhì)量百分比濃度為1%，反應(yīng)時(shí)間為60min。
6. 如權(quán)利要求2所述產(chǎn)纖維素酶的菌株，其特征在于，所述青霉菌株H16應(yīng)用于生產(chǎn)纖 維素酶。
7. -株應(yīng)用權(quán)利要求3?5中任一項(xiàng)所述的產(chǎn)纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶的方法，其特 征在于，用于培養(yǎng)所述產(chǎn)纖維素酶菌株的培養(yǎng)基的組分含量為：微晶纖維素10?30g/L，葡 萄糖1?10g/L，玉米漿干粉10?20g/L，硫酸銨1?10g/L，磷酸二氫鉀1?10g/L，硫酸 鎂1?l〇g/L以及加水至1L。
8. 如權(quán)利要求7所述產(chǎn)纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)條件 為：溫度為26?32°C，轉(zhuǎn)速為150?250rpm震蕩培養(yǎng)，初始pH為5. 0?6. 0,接種量為1? 5%，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為96?144h。
9. 如權(quán)利要求8所述產(chǎn)纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)條件 為：初始PH為5. 5,發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為120h。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK104312928SQ201410573432
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】陳樹林, 張粲, 宗志友, 賈文娣, 赫榮琳, 武改紅, 李晨, 張東遠(yuǎn) 申請人:中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所