一種用聚合酶螺旋反應(yīng)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用聚合酶螺旋反應(yīng)(PSR)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法，是用一對(duì)寡核苷酸引物，在引物的5’端添加互為反向的核苷酸片段，在恒溫條件下使得目的基因在引物及DNA聚合酶的作用下進(jìn)行聚合酶螺旋反應(yīng)，使目的基因自螺旋式延伸，從而完成核酸的擴(kuò)增。本發(fā)明為核酸檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，擴(kuò)增產(chǎn)物比較簡(jiǎn)單，不僅可以應(yīng)用在檢測(cè)領(lǐng)域，還可以再稍加處理后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆回收和測(cè)序，該方法可以應(yīng)用在所有需要核酸擴(kuò)增的領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，適于大范圍推廣應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種用聚合酶螺旋反應(yīng)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】中的恒溫核酸擴(kuò)增方法，特別是涉及一種用聚合 酶螺旋反應(yīng)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法及其在進(jìn)行核酸（DNA或RNA)檢測(cè)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction)，即PCR技術(shù)，是美國(guó)Cetus公司 人類(lèi)遺傳研究室的科學(xué)家K.B.Mullis于1983年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA序列的方法，特點(diǎn)是利用耐熱的DNA聚合酶，將引物和目標(biāo)DNA混合，經(jīng)過(guò)高溫變性、低 溫退火和適溫延伸3個(gè)過(guò)程為一個(gè)周期進(jìn)行循環(huán)，將目標(biāo)DNA在短時(shí)間內(nèi)得到大量擴(kuò)增。 PCR技術(shù)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出的優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè) 試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一 DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，使肉眼 能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究 和檢測(cè)鑒定。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑，但PCR技術(shù)一直無(wú)法 擺脫熱循環(huán)的限制，經(jīng)過(guò)幾十年技術(shù)的發(fā)展，一些恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)逐漸被發(fā)明出來(lái)。
[0003] 核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是指在溫度不變的情況下將目標(biāo)基因大量復(fù)制的技術(shù)。目前， 核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法主要包括以下幾種：
[0004] TAS，即轉(zhuǎn)錄依賴(lài)的擴(kuò)增系統(tǒng)（Transcript-based Amplification System)，是美國(guó) SISKA診斷研究所和Salk研究所于1989年共同研發(fā)的，主要應(yīng)用于RNA的擴(kuò)增，它的反應(yīng) 原理是在逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶的作用下將目標(biāo)RNA通過(guò)階梯式溫度變化而大量擴(kuò)增出 來(lái)，在擴(kuò)增過(guò)程中也主要依靠了逆轉(zhuǎn)錄酶的多聚酶活性和RNase Η的活性，這種擴(kuò)增方式擺 脫了高熱循環(huán)的限制，只需要將溫度進(jìn)行階梯設(shè)置，具有重大的進(jìn)步意義，且具有很高的特 異性和敏感性，但在反應(yīng)過(guò)程中需要不斷添加逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶，給使用帶來(lái)很多 不方便，而且目前只能擴(kuò)增RNA。
[0005] NASBA,即依賴(lài)于核酸序列的擴(kuò)增（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification),在1991年，由加拿大Can-gene公司最先發(fā)表論文介紹，NASBA是一種等溫 擴(kuò)增技術(shù)，它能在體外將核酸序列進(jìn)行大量復(fù)制，是由兩個(gè)引物介導(dǎo)的、穩(wěn)定持續(xù)的酶促反 應(yīng)。NASBA反應(yīng)要依賴(lài)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、T7RNA聚合酶，整個(gè)反應(yīng)在恒溫（41°C )條 件下進(jìn)行的，1. 5-2h即可得到理想的結(jié)果。NASBA的缺點(diǎn)為：在產(chǎn)物檢測(cè)上仍需要復(fù)雜的后 續(xù)程序；酶非耐熱性，且要在RNA鏈溶解之后才能加入；低溫容易導(dǎo)致引物的非特異性相互 作用從而造成非特異性擴(kuò)增；反應(yīng)需要加入三種酶，且需要三種酶在同一溫度、同一反應(yīng)體 系下被激活。
[0006] 3SR，即自主序列復(fù)制（Self-Sustained Sequence Replication)，也是由美國(guó) SISKA診斷研究所和Salk研究所在TAS基礎(chǔ)上研發(fā)而來(lái)，原理同TAS基本相似，只不過(guò)多了 RNase Η酶，同時(shí)其反應(yīng)也必需AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶。相比NASBA，3SR比較復(fù)雜， 敏感性不強(qiáng)。NASBA正逐漸取代3SR。
[0007] SDA，即鏈替代擴(kuò)增（Strand Displacement Amplification)，是 1992 年由美國(guó)學(xué) 者Wallker等人建立，它利用限制性?xún)?nèi)切核酸酶剪切DNA識(shí)別位點(diǎn)的能力和DNA聚合酶在 缺口處向3'延伸并置換下游序列的能力，在等溫條件下將目標(biāo)序列大量擴(kuò)增出來(lái)。SDA的 缺點(diǎn)是仍需要變性的過(guò)程，擴(kuò)增的靶序列不能超過(guò)200bp，后續(xù)檢測(cè)復(fù)雜。
[0008] RCA，即滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification)，于 1998 年被發(fā)明出來(lái)。該方 法的靈感主要來(lái)自自然界微生物環(huán)狀DNA的復(fù)制過(guò)程，通過(guò)體外模擬這種環(huán)狀DNA的擴(kuò)增 而發(fā)明的，主要通過(guò)巧妙的引物設(shè)計(jì)和在DNA聚合酶的作用下將靶序列大量擴(kuò)增出來(lái)，但 其擴(kuò)增產(chǎn)物非常復(fù)雜，且片段大小不一。由于RCA只能擴(kuò)增環(huán)狀的DNA模板，所以大大限制 了其的應(yīng)用范圍。
[0009] HDA，即依賴(lài)解旋酶基因擴(kuò)增（Helicase-Dependent Amplification)，是由美國(guó) New England Biolabs公司的科研人員Vincent等在2004年首次介紹的一種恒溫體外核酸擴(kuò)增 技術(shù)，它的反應(yīng)原理是在解旋酶的作用下將雙鏈DNA打開(kāi)，再依靠單鏈DNA結(jié)合蛋白與模板 單鏈結(jié)合，這樣就可以使DNA保持單鏈的狀態(tài)，然后引物與單鏈結(jié)合，在DNA聚合酶的作用 下向前延伸。但是，HDA擴(kuò)增也需要三種酶，因而大大限制了其的應(yīng)用范圍。
[0010] SPIA，即單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Single Primer Isothermal Amplification)，2005 年被發(fā)明出來(lái)。該技術(shù)主要通過(guò)一條3'端是DNA片段、5'端是RNA片段的混合物，在RNase Η及具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶作用下，單鏈的cDNA便被大量的擴(kuò)增出來(lái)。SPIA擴(kuò)增 的溫度為60°C左右，在半個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。SPIA擴(kuò)增技術(shù)具有擴(kuò)增效率高、保守性強(qiáng)、原理簡(jiǎn) 單等優(yōu)點(diǎn)，適用于核酸檢測(cè)、核酸測(cè)序、SNP檢測(cè)、單鏈模板制備以及基因芯片探針制備等方 面。
[0011] 2000年，Notomi等人建立的一種新的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (Loop-mediated Isothermal Amplification，簡(jiǎn)稱(chēng)LAMP)，這種新穎的擴(kuò)增方法需要至少4 條引物，最多6條引物來(lái)特異性識(shí)別目標(biāo)片段的6個(gè)、7個(gè)或者8個(gè)區(qū)域，在DNA聚合酶的 鏈置換作用下可以在很短的時(shí)間內(nèi)將靶序列擴(kuò)增出來(lái)，具有簡(jiǎn)單、特異、高效、迅速的特點(diǎn)， 大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物的產(chǎn)生，即白色的焦磷酸鎂沉淀，這一特性可以使 LAMP反應(yīng)通過(guò)濁度變化來(lái)直接判斷陰、陽(yáng)性結(jié)果。PCR需要兩條引物來(lái)特異性結(jié)合靶序列 的兩個(gè)區(qū)間，而LAMP則是特異性的結(jié)合6至8個(gè)區(qū)間，所以相較于PCR，具有很強(qiáng)的特異性； 敏感性比普通PCR可以提高10-100倍，與熒光定量PCR的敏感性相當(dāng)，而且LAMP擴(kuò)增的過(guò) 程是在恒溫條件下進(jìn)行的，有熱穩(wěn)定的設(shè)備（比如恒溫水浴鍋、恒溫金屬浴等）就能滿足反 應(yīng)要求，因次大大降低了檢測(cè)成本。自從LAMP技術(shù)被報(bào)道后，在短短的十幾年的時(shí)間里，已 經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、病毒等微生物的檢測(cè)，遺傳病的診斷，以及性別的早期判定等 領(lǐng)域。
[0012] 各種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的比較結(jié)果詳見(jiàn)表1。
[0013] 表1恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的比較結(jié)果
[0014]

【權(quán)利要求】
1. 一種用聚合酶螺旋反應(yīng)（PSR)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法，是用一對(duì)寡核苷酸引物，在引 物的5'端添加互為反向的核苷酸片段，在恒溫條件下使得目的基因在引物及DNA聚合酶的 作用下進(jìn)行聚合酶螺旋反應(yīng)，使目的基因自螺旋式延伸，從而完成核酸的擴(kuò)增。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法，其特征在于：所述聚合酶螺旋反應(yīng) (PSR)的最基本引物只包括一對(duì)引物，一條正向引物FP和一條反向引物BP，，F(xiàn)和B為引物 設(shè)計(jì)區(qū)，它們之間為延伸區(qū)，在這兩條引物的引導(dǎo)下，聚合酶螺旋反應(yīng)（自螺旋鏈?zhǔn)椒磻?yīng)） 就可以開(kāi)始： FP(Forward Primer):該引物由F區(qū)域和N區(qū)域兩部分組成，F(xiàn)區(qū)域與祀序列的Fc區(qū)域 互補(bǔ)，N區(qū)域是一段特別的序列，可以來(lái)自靶序列本身，也可以來(lái)自外源序列，但必須和BP 引物5'端N區(qū)域序列一樣； BP (Backward Primer):該引物由B區(qū)域和N區(qū)域兩部分組成，B區(qū)域與祀序列的Be區(qū) 域互補(bǔ)，N區(qū)域是一段特別的序列，可以來(lái)自靶序列本身，也可以來(lái)自外源序列，但必須和 FP引物5'端N區(qū)域序列一樣。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法，其特征在于：所述用聚合酶螺旋反應(yīng) (PSR)及其專(zhuān)用引物恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法的反應(yīng)過(guò)程如下： 1) 依次用引物FP和BP形成自螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)： 1. 1)反應(yīng)在恒溫環(huán)境（60°C -65°C )下進(jìn)行，靶序列雙鏈解開(kāi)成兩條單鏈，引物FP中的 F部分與其中一條3'端至5'端的單鏈的Fc部分結(jié)合，并向3'端延伸至合成出與3'端至 5'端單鏈的B區(qū)域的互補(bǔ)序列Be及后續(xù)序列，即逐漸形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后雙鏈結(jié)構(gòu)解開(kāi)，形 成兩條單鏈，即一條5'端至3'端的包括N區(qū)域、F區(qū)域及Be區(qū)域的中間單鏈和一條靶序 列的3'端至5'端的單鏈； 1. 2)引物BP與5'端至3'端的包括N區(qū)域、F區(qū)域及Be區(qū)域的中間單鏈結(jié)合，BP中的 B部分與中間單鏈的Be區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，并向3'端延伸至合成出與F區(qū)域互補(bǔ)的Fc區(qū)域及 與N區(qū)域互補(bǔ)的Nc區(qū)域，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)雙鏈結(jié)構(gòu)解開(kāi)形成單鏈時(shí)，便形成了兩條單鏈， 至此形成了聚合酶螺旋反應(yīng)中最為關(guān)鍵的一條目的單鏈，即3'端至5'端的包括Nc區(qū)域、 Fc區(qū)域、B區(qū)域和N區(qū)域的單鏈； 1. 3)目的單鏈兩端的Nc區(qū)域和N區(qū)域互補(bǔ)，Nc區(qū)域和N區(qū)域相結(jié)合后形成自螺旋環(huán) 結(jié)構(gòu)，由于Nc末端為3'端，可以以自身為模板進(jìn)行自螺旋延伸，一旦形成自螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)， 就會(huì)開(kāi)始劇烈的聚合酶螺旋反應(yīng)，5分鐘左右便會(huì)完成擴(kuò)增，形成大小不等的螺旋形擴(kuò)增產(chǎn) 物，從而最終完成核酸的擴(kuò)增； 2) 同時(shí)，還可依次用引物BP和FP形成自螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)： 2. 1)反應(yīng)在恒溫環(huán)境（60°C _65°C )下進(jìn)行，靶序列雙鏈解開(kāi)成兩條單鏈，引物BP中的 B部分與其中一條3'端至5'端的單鏈的Be部分結(jié)合，并向3'端延伸至合成出與3'端至 5'端單鏈的F區(qū)域的互補(bǔ)序列Fc及后續(xù)序列，即逐漸形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后雙鏈結(jié)構(gòu)解開(kāi)，形 成兩條單鏈，即一條5'端至3'端的包括N區(qū)域、B區(qū)域及Fc區(qū)域的中間單鏈和一條靶序 列的3'端至5'端的單鏈； 2. 2)引物FP與5'端至3'端的包括N區(qū)域、B區(qū)域及Fc區(qū)域的中間單鏈結(jié)合，F(xiàn)P中的 F部分與中間單鏈的Fc區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，并向3'端延伸至合成出與B區(qū)域互補(bǔ)的Be區(qū)域及 與N區(qū)域互補(bǔ)的Nc區(qū)域，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)雙鏈結(jié)構(gòu)解開(kāi)形成單鏈時(shí)，便形成了兩條單鏈， 至此形成了聚合酶螺旋反應(yīng)中最為關(guān)鍵的一條目的單鏈，即5'端至3'端的包括N區(qū)域、F 區(qū)域、Be區(qū)域和Nc區(qū)域的單鏈； 2. 3)目的單鏈兩端的Nc區(qū)域和N區(qū)域互補(bǔ)，Nc區(qū)域和N區(qū)域相結(jié)合后形成自螺旋環(huán) 結(jié)構(gòu)，由于Nc末端為3'端，可以以自身為模板進(jìn)行自螺旋延伸，一旦形成自螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)， 就會(huì)開(kāi)始劇烈的聚合酶螺旋反應(yīng)，5分鐘左右便會(huì)完成擴(kuò)增，形成大小不等的螺旋形擴(kuò)增產(chǎn) 物，從而最終完成核酸的擴(kuò)增。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法，其特征在于：所述用于檢測(cè)NDM-1基 因的FP引物如序列表中序列2所示，BP引物如序列表中序列3所示；所述用于檢測(cè)H1N1 基因的FP引物如序列表中序列5所不，BP引物如序列表中序列6所7]^。
5. -種用權(quán)利要求1或2或3所述用聚合酶螺旋反應(yīng)（PSR)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法及濁 度法檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有目的基因（DNA)的方法，包括以下步驟： 1) 配制23yL PSR反應(yīng)液，其中各物質(zhì)濃度為：20mM Tris*HCl(pH 8.8)，10mM KC1， 10mM(NH4)2S04,0. l%Tween20,0.8M甜菜堿（betaine)，8mM MgS04，1.4mM dNTP each,8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量為：FP和BP各40pM ; 2) 按常規(guī)方法提取待測(cè)樣品中的核酸，濃度20ng/y L以上； 3) 取2 μ L核酸提取液加入步驟1)配制的PSR反應(yīng)液中，使最終反應(yīng)體積為25 μ L，混 勻反應(yīng)液，加入封閉劑以防止污染； 4) 置60-65°C環(huán)境中進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間120-150min ; 5) 用實(shí)時(shí)濁度儀記錄反應(yīng)管中濁度的變化，曲線上升的樣品判定為陽(yáng)性結(jié)果，曲線沒(méi) 有上升的樣品判定為陰性結(jié)果。
6. -種用權(quán)利要求1或2或3所述用聚合酶螺旋反應(yīng)（PSR)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法及顯 色法判定檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有目的基因（DNA)的方法，包括以下步驟： 1) 配制23yL PSR反應(yīng)液，其中各物質(zhì)濃度為：20mM Tris*HCl(pH 8.8)，10mM KC1， 10mM(NH4)2S04,0. l%Tween20,0.8M甜菜堿（betaine)，8mM MgS04，1.4mM dNTP each,8U Bst DNA聚合酶，加入的PSR引物量為：FP和BP各40pM ; 2) 按常規(guī)方法提取待測(cè)樣品中的核酸，濃度20ng/y L以上； 3) 取2 μ L核酸提取液和1 μ L顯色液（主要是一些可以根據(jù)反應(yīng)液中Mg2+濃度變化 而產(chǎn)生顏色變化的金屬離子指示劑，如鈣黃綠素/Mn2+混合液、羥基萘酚藍(lán)等；還包括一些 可以核酸染料，如SYBR Green I等），加入到步驟1)配制的PSR反應(yīng)液中，使最終反應(yīng)體積 為26 μ L,混勻反應(yīng)液，加入封閉劑以防止污染； 4) 置60-65°C環(huán)境中進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間120-150min; 5) 取出反應(yīng)管，肉眼或紫外光輔助下觀察，反應(yīng)液顏色改變的樣品為陽(yáng)性結(jié)果，保持顏 色不變的樣品為陰性結(jié)果。
7. -種用權(quán)利要求1或2或3所述用聚合酶螺旋反應(yīng)（PSR)恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法及濁 度法或顯示法檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有RNA的方法，包括以下步驟： 1) 配制23yL PSR反應(yīng)液，其中各物質(zhì)濃度為：20mM Tris*HCl(pH 8.8)，10mM KC1， 10mM(NH4)2S04,0. 1 % Tween20,0.8M甜菜堿（betaine)，8mM MgS04，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，加入的PSR引物量為：FP和BP各40pM ; 2) 按常規(guī)方法提取待測(cè)樣品中的核酸，濃度20ng/y L以上； 3) 取2yL核酸提取液加入到步驟1)配制的PSR反應(yīng)液中，混勻反應(yīng)液，加入封閉劑以 防止污染； 4) 置60-65°C環(huán)境中進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間120-150min ; 5) 用濁度法或者顯色法判定反應(yīng)結(jié)果。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的方法，所述封閉劑為熔點(diǎn)低于核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)溫 度0-25°C、直徑與反應(yīng)管管徑相同的柱狀全精煉固態(tài)石蠟塊或半精煉固態(tài)石蠟塊，封閉劑 的使用方法為：將石蠟塊加入到反應(yīng)管中反應(yīng)液的上方，蓋上蓋，進(jìn)行反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104232622SQ201410535579
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】劉威, 袁靜, 陳澤良, 黃留玉, 董德榮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制所