一種雞肉源性成分核酸的恒溫擴增檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種針對雞肉源性成分核酸的恒溫擴增快速檢測技術，適合對雞肉源 性成分核酸的現(xiàn)場快速定性檢測。 (二）
【背景技術】
[0002] 我國肉類產量逐年增加，其中雞肉產量占據(jù)肉類總產量的13.97%。與此同時，消 費者對食品質量與安全性的要求也越來越高，不法商販、企業(yè)為獲得非法利潤，常以較低價 的雞肉冒充牛、羊、豬肉，嚴重侵害了消費者利益。這不僅涉及經濟、營養(yǎng)價值和食品安全等 問題，更直接影響消費者的健康，尤其是對某些食物過敏的消費者。為維護廣大消費者合法 權益，穩(wěn)定市場秩序，對動物性食品進行種源的鑒定顯得十分必要。
[0003]目前，在動物種源的定性檢測的常規(guī)檢測方法，如電泳、免疫學技術、光譜技術等 存在很大缺陷，如靈敏度低、周期長、費時費力等，因此其應用仍存在一定的局限性。本發(fā)明 技術研制了恒溫擴增雞肉源性成分核酸，并結合核酸試紙條顯色來判定檢測結果，且整個 反應過程不打開反應管蓋子，試紙條流動檢測過程密閉，杜絕了核酸擴增產物污染外界的 可能性。研究表明該雞肉源性成分核酸的恒溫擴增-核酸試紙條檢測方法具有特異性強、 敏感度高、對儀器要求簡單、檢測時間短等優(yōu)點，所以非常適用在基層檢驗機構使用，同時 在農貿市場的現(xiàn)場檢測上也具有很好的應用前景。 (三）

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種準確、靈敏、快速地檢測雞肉源性成分核酸的恒溫擴增檢 測試劑盒及其檢測方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種雞肉源性成分核酸的恒溫擴增檢測試劑盒，所述試劑盒包括如下 組成：
[0007] (1)恒溫擴增反應液，包括：正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴 增引物、lXThermolbuffer、MgS04、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和無菌雙蒸水；其中：
[0008] 所述的外圍引物分別為：
[0009] 正向外圍引物為：5，-TCTCCCATGGGGCCAAAT-3'(SEQIDNO. 2)；
[0010] 反向外圍引物為：5' -TAGGAAGGTGAGGTGGATGA-3'(SEQIDNO. 3)；
[0011] 所述兩條探針的序列分別為：
[0012] 正向 5' 端Biotin標記探針：5' -Biotin-GTCCAATGTAGGGAATTGCTG-3'(SEQID NO. 4)；
[0013] 反向 5 '端Fite標記探針：5 ' -Fitc-GTAAGGCGAAGAATCGGGA-3 '(SEQID NO. 5)；
[0014] 所述兩條擴增交叉引物分別為：
[0015] 擴增正向引物：
[0016] 5r -TCCCCCTCAGGCTCACTCTACTCTGAGGGGCCACCGTTAT-3r(SEQIDNO. 6)；
[0017] 擴增反向引物：
[0018] 5r -TTCAGTCGACAACCCAACCCTTCGATTGCAAAGGGGAGGAG-3r(SEQIDNO. 7)；
[0019] (2)陽性對照：含有雞屬特異性的細胞色素b基因（Cytb基因）片段的DNA質粒；
[0020] ⑶陰性對照：無菌雙蒸水。
[0021] 進一步，本發(fā)明所述的 1XThermolbuffer組成為：20mM的Tris-HCl、10mM的 KCl、10mM的（NH4)2S04、2mM的MgS04&及質量濃度為 0.1% 的TritonΧ-100，ρΗ7·8。
[0022] 進一步，本發(fā)明所述陽性對照為含有長205bp的雞屬特異性的Cytb基因序列的片 段，所述片段的核苷酸序列如下（SEQIDNO. 1):
[0024] 進一步，本發(fā)明所述陽性對照按如下步驟制備：
[0025] 以包含擴增區(qū)域的雞屬特異性的Cytb基因片段為模板，通過兩條外圍引物進行 PCR擴增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒（Promega)對PCR擴增產物進行純化；將純 化后的擴增產物通過T-easy質粒轉染試劑盒（Promega)構建完整的含有目的基因的質 粒序列，用分光光度計對所抽提的質粒測A2S。定量并稀釋至10個拷貝/μ1，獲得陽性對 照，-20 °C保存。
[0026] 進一步，本發(fā)明所述恒溫PCR擴增反應液組成為：兩條外圍引物各自5. 7nmol， 兩條探針各自11.4nmol，兩條交叉引物各自22. 8nmol，lXThermolbuffei^MgSO^^ 0. 2μmol，dNTPs溶液各35pmol，BstDNA聚合酶8U，無菌雙蒸水組成補足至25μ1。
[0027] 本發(fā)明還提供一種所述雞肉源性成分核酸的恒溫擴增檢測試劑盒的檢測方法，所 述檢測方法為：
[0028]a)提取待檢測標本DNA:剪取約米粒大小的雞肉樣品，加入500 μL雙蒸水后振蕩 15s，于95°C作用5min，離心后取上清，即獲得DNA;
[0029] b)將步驟a)提取得到的DNA作為模板加入到裝有恒溫擴增反應液的PCR管中，在 65°C下擴增反應30分鐘；標準陽性模板（即陽性對照）加入陽性對照PCR管中，標準陰性 模板（即陰性對照）加入陰性對照PCR管中，所述標準陽性模板為含有雞屬特異性的Cytb 基因片段的DNA質粒，所述標準陰性模板為無菌雙蒸水；
[0030] c)將反應后的PCR管采用核酸試紙條進行檢測（優(yōu)選放置到核酸試紙條防污染檢 測裝置（杭州優(yōu)思達生物技術公司3號裝置）中進行檢測），2分鐘以后判讀結果，當試紙 條的檢測線呈陽性時（即試紙條T線為紅色，C線為紅色），說明樣品中含有雞肉源性成分 核酸。該試紙條包括在帶有不干膠的襯墊上按順序設有樣品墊、有色顆粒結合物墊和吸水 濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上設有檢測線和質控線，其中有色顆粒結合 物墊上的有色顆粒有抗Fite抗體包被，檢測線上有親和素包被，質控線上有抗Fite抗體包 被，有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。
[0031] 在本發(fā)明提供的試劑盒中，有兩條外圍引物，兩條交叉引物和兩條檢測探針。本試 劑盒中的6條寡聚核苷酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使得鏈置換DNA 合成不斷的自我擴增循環(huán)。在本發(fā)明提供的雞肉源性成分核酸的恒溫擴增檢測試劑盒中， 對不同的反應條件進行了優(yōu)化，如引物和探針的濃度，Mg2+濃度，反應溫度等的優(yōu)化，并將本 發(fā)明與核酸檢測試紙條檢測系統(tǒng)相結合，建立了雞肉源性成分核酸的恒溫擴增定性檢測的 方法。該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出10個拷貝，可以滿足快速檢測雞肉源性 成分核酸的要求。
[0032] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果：
[0033] (1)本發(fā)明簡化了肉樣品核酸的提取方法，減低了成本，而且大大縮短了檢測時 間。
[0034] (2)雞肉恒溫擴增檢測試劑盒的特異性好，靈敏度高，步驟簡單，可重復性高；
[0035] (3)反應速度快，單個樣本從樣本處理到完成檢測，僅需40分鐘左右；
[0036] (4)整個擴增和檢測過程中不需要打開管蓋，減少了擴增產物污染的機會；整個 反應過程不需要復雜的儀器。 (四）
【附圖說明】
[0037] 圖1為核酸檢測試紙條原理示意圖。
[0038] 圖2為本發(fā)明試劑盒用于檢測雞肉源性成分核酸的特異性，圖中1-7分別雞肉、鴨 肉、豬肉、牛肉、羊肉、陽性對照、陰性對照品。
[0039] 圖3為本發(fā)明試劑盒用于檢測雞肉源性成分核酸的靈敏度，圖中1-6分別表示10 4 拷貝/微升、1〇3拷貝/微升、10 2拷貝/微升、10 1拷貝/微升、10 °拷貝/微升、陰性對照品。 (五）
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅