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一個(gè)豬6號(hào)染色體上用于溯源的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用

文檔序號(hào):9541298閱讀:459來源:國知局
一個(gè)豬6號(hào)染色體上用于溯源的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬食品安全領(lǐng)域,具體涉及一個(gè)豬6號(hào)染色體上用于溯源的SNP分子標(biāo)記 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會(huì)的發(fā)展,食品供應(yīng)鏈中的環(huán)節(jié)在不斷增加,從農(nóng)場(chǎng)、牧場(chǎng)到食品企業(yè)的加 工、包裝、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和銷售,食品供應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)存在食品的安全隱患,食品安全問題常有 發(fā)生。因此需要進(jìn)行肉制品的可追溯管理,建立從產(chǎn)地到餐桌的各個(gè)環(huán)節(jié)的追溯體系,從而 為消費(fèi)者提供準(zhǔn)確而詳細(xì)的有關(guān)產(chǎn)品的信息,有利于生產(chǎn)經(jīng)營者及時(shí)發(fā)現(xiàn)各環(huán)節(jié)中存在的 不安全隱患。從20世紀(jì)90年代中期的食品安全危機(jī)開始,肉產(chǎn)品的追溯已經(jīng)作為一種安 全控制措施,受到世界多個(gè)國家的高度重視。肉產(chǎn)品追溯系統(tǒng)加強(qiáng)了政府部門對(duì)肉產(chǎn)品質(zhì) 量安全的監(jiān)管能力,因此許多國家紛紛建立肉產(chǎn)品追溯系統(tǒng)用以降低肉產(chǎn)品質(zhì)量安全中存 在的風(fēng)險(xiǎn)。
[0003] 肉產(chǎn)品溯源技術(shù)有標(biāo)簽溯源技術(shù)、同位素溯源技術(shù)、礦物元素指紋溯源技術(shù)、有機(jī) 物溯源技術(shù)虹膜特征技術(shù)和DNA標(biāo)記溯源技術(shù)(或DNA溯源技術(shù))等,其中DNA溯源技術(shù)因 為檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速、難以偽造等特點(diǎn)成為世界各國廣泛應(yīng)用的快速溯源技術(shù)。與其他標(biāo) 記方法相比,DNA標(biāo)記具有特有放入優(yōu)越性:它直接以DNA形式出現(xiàn),在生物體的各個(gè)組織、 各發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到,不受環(huán)境因素的影響,并且標(biāo)記數(shù)量多,遍及生物體整個(gè)基因組。
[0004] SNP標(biāo)記是指基因組同一位點(diǎn)上單個(gè)核苷酸的變異,一般表現(xiàn)為二等位基因,適宜 高通量自動(dòng)化分析,所以成為動(dòng)物身份識(shí)別最受關(guān)注的分子標(biāo)記。
[0005] 但是用于肉產(chǎn)品溯源的SNP標(biāo)記不同于一般的SNP標(biāo)記,對(duì)于單個(gè)的SNP標(biāo)記,它 必須至少具有以下特征:(1)變異度高,在品種或品系中等位基因頻率接近;(2)品種間等 位基因分布頻率差異小;(3)雜合度大于等于0. 3。
[0006] 在長(zhǎng)期的育種工作中,研究者積累了大量的SNP標(biāo)記,由于單個(gè)SNP溯源標(biāo)記是無 法完成溯源的,因此,需要一組相互獨(dú)立的SNP標(biāo)記才能實(shí)現(xiàn)溯源。以現(xiàn)有的13個(gè)已知SNP 分子標(biāo)記作為溯源標(biāo)記組合,在經(jīng)過高度選擇引進(jìn)的豬群體中,使用該組標(biāo)記進(jìn)行溯源時(shí), 會(huì)出現(xiàn)某些個(gè)體不能區(qū)分的情況。
[0007] 另外,在長(zhǎng)期的育種工作中,積累的大量的SNP標(biāo)記往往集中分布在某些染色體 上,而另外部分染色體,如5號(hào),6號(hào),8號(hào),14號(hào),15號(hào)和18號(hào)染色體等則缺乏SNP標(biāo)記,容 易導(dǎo)致分子標(biāo)記間出現(xiàn)連鎖現(xiàn)象,分子標(biāo)記之間不能互相獨(dú)立,縮小溯源實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)范圍, 導(dǎo)致實(shí)際可檢測(cè)范圍小于預(yù)期可檢測(cè)范圍。因此,為了滿足對(duì)豬肉產(chǎn)品進(jìn)行DNA溯源的要 求,需要開發(fā)其他染色體上用于溯源的SNP標(biāo)記,提高溯源檢測(cè)范圍及準(zhǔn)確度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)豬6號(hào)染色體上用于溯源的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用, 可以廣泛用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源及其檢測(cè),特別是用于豬肉產(chǎn)品的安全性溯源,完善了現(xiàn) 有標(biāo)記組合,提高溯源檢測(cè)準(zhǔn)確度,擴(kuò)大了溯源規(guī)模。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010] 豬6號(hào)染色體上用于溯源的SNP分子標(biāo)記,該SNP分子標(biāo)記的DNA序列如SEQID NO. 1所示,共578bp,第232位堿基處有一個(gè)堿基替換,為232C或232T。
[0011] 進(jìn)一步,所述的SNP分子標(biāo)記由Ec〇130I限制性內(nèi)切酶識(shí)別。
[0012] 所述的SNP分子標(biāo)記是通過NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)獲得的,并在包括10個(gè)豬品種 或品系的試驗(yàn)群體(共計(jì)245個(gè)個(gè)體)中,分析該SNP分子標(biāo)記在試驗(yàn)群體中等位基因的 分布情況,發(fā)現(xiàn)該分子標(biāo)記在不同的品種和品系中的等位基因頻率接近,多態(tài)性豐富,品種 或品系間等位基因頻率分布差異小,初步判定該SNP標(biāo)記可用作豬肉產(chǎn)品DNA溯源。
[0013] 所述的用于豬肉DNA溯源的SNP分子標(biāo)記的獲得方法,采用PCR-Ecol30I-RFLP方 法進(jìn)行,包括以下步驟:
[0014] (1)在NCBI上搜索豬6號(hào)染色體的DNA序列信息,設(shè)計(jì)正、反向引物
[0015] 分離豬6號(hào)染色體的DNA片段;
[0016] (2)利用NCBI數(shù)據(jù)庫在線進(jìn)行序列比對(duì),尋找存在堿基替代的位點(diǎn);
[0017] (3)PCR-Ec〇130I-RFLP檢測(cè)方法的建立及替換位點(diǎn)的檢測(cè);
[0018] (4)采集10個(gè)品種和品系的耳組織樣,共計(jì)245個(gè)個(gè)體;
[0019] (5)檢測(cè)SNP分子標(biāo)記在試驗(yàn)群體的分布,統(tǒng)計(jì)分析,并進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證是否適用 于豬肉產(chǎn)品溯源中。
[0020] 其中,上述獲得SNP分子標(biāo)記的方法中,所述的分離豬6號(hào)染色體上DNA片段的 正、反向引物序列如下:
[0021] 正向引物:5' -CTTTACCGTTCTGCCCTTTC-3'(如SEQIDN0. 2 所示);
[0022] 反向引物:5' -TCCTCTGCCTGCCTTTGA-3'(如SEQIDNO. 3 所示)。
[0023] 在DNA溯源過程中,每增加一個(gè)溯源位點(diǎn),就能進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)樣本的數(shù)目,準(zhǔn)確 性也就更高,理想的SNP位點(diǎn)應(yīng)該是均勻分布在豬不同的染色體上,而現(xiàn)有的SNP位點(diǎn)中缺 乏6號(hào)染色體上的溯源標(biāo)記。
[0024] 本發(fā)明通過NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)檢測(cè)到豬6號(hào)染色體上的存在的SNP分子標(biāo)記, 在包括10個(gè)豬品種或品系的試驗(yàn)群體中,分析該SNP分子標(biāo)記在試驗(yàn)群體中等位基因的分 布情況,發(fā)現(xiàn)該分子標(biāo)記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近,多態(tài)性豐富,品種或 品系間等位基因頻率分布差異小,并且雜合度都大于0. 3,初步判定該SNP標(biāo)記可用作豬肉 產(chǎn)品DNA溯源以及豬肉產(chǎn)品的安全性溯源中。
[0025] 為了完善已有SNP分子標(biāo)記組合,提高溯源實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)準(zhǔn)確度,擴(kuò)大溯源規(guī)模,將 本發(fā)明獲得的豬6號(hào)染色體上的新SNP分子標(biāo)記位點(diǎn)與其它現(xiàn)有已公開的SNP分子標(biāo)記位 點(diǎn)結(jié)合在一起(共計(jì)14個(gè)SNP位點(diǎn))進(jìn)行溯源實(shí)驗(yàn)。
[0026] 本發(fā)明在溯源實(shí)驗(yàn)中,增加商品豬來源,在屠宰場(chǎng)共挑選了來自不同豬場(chǎng)的300 個(gè)個(gè)體,從300個(gè)個(gè)體中隨機(jī)挑選100個(gè)個(gè)體,檢測(cè)該100個(gè)個(gè)體中14個(gè)SNP位點(diǎn)的基因 型,統(tǒng)計(jì)每個(gè)個(gè)體的基因型結(jié)果,發(fā)現(xiàn)100個(gè)個(gè)體均擁有各自不同的基因型,能實(shí)現(xiàn)個(gè)體區(qū) 分;同時(shí),隨機(jī)在這100個(gè)個(gè)體中挑取20份肌肉樣,同樣檢測(cè)統(tǒng)計(jì)14個(gè)SNP分子標(biāo)記位點(diǎn) 的基因型,然后跟100個(gè)個(gè)體的基因型進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)均能找到與20份肌肉樣品基因 型完全一致的個(gè)體,即通過溯源在100個(gè)個(gè)體中找到20份豬肌肉的來源個(gè)體,因此判定本 發(fā)明的該SNP分子標(biāo)記可以用于豬肉產(chǎn)品溯源。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果:
[0028] 本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記位于豬的6號(hào)染色體上,能進(jìn)一步完善標(biāo)記的檢測(cè)覆蓋面, 提高溯源的準(zhǔn)確性,并擴(kuò)大豬的DNA溯源SNP分子標(biāo)記的檢測(cè)范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0030] 實(shí)施例1分子標(biāo)記的查找
[0031] (1)引物設(shè)計(jì)
[0032] 以豬6號(hào)染色體的DNA序列(Genbank:FN673773)為模板,設(shè)計(jì)引物分離豬的DNA 片段(以一頭申農(nóng)豬的DNA為PCR擴(kuò)增的模板),引物如下:
[0033] 正向引物:5' -CTTTACCGTTCTGCCCTTTC-3'(如SEQIDN0. 2 所示);
[0034]反向引物:5' -TCCTCTGCCTGCCTTTGA-3'(如SEQIDNO. 3 所示)。
[0035]PCR反應(yīng)總體積為20μ1,其中豬基因組DNA約100ng,含lXbuffer(Promega公 司),1. 5mmol/LMgCl2,dNTP(上海生工生物公司)終濃度為150ymol/L,引物終濃度為 0· 2μmol/L,2UTaqDNA聚合酶(Promega公司)。
[0036] PCR擴(kuò)增:94°C4min,(94°C30s,60°C退火 30s,72°C30s)循環(huán) 30 次,最后 72°C延 伸 10min〇
[0037] PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)。
[0038](2)克隆測(cè)序分析
[0039] 將得到的豬6號(hào)染色體的DNA片段按照如下方法進(jìn)行克隆。
[0040] PCR產(chǎn)物的純化:在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上
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