一種以微衛(wèi)星為分子標記篩選釀酒酵母乙酸耐受性性狀的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以微衛(wèi)星位點為分子標記對釀酒酵母乙酸耐受性性狀進行篩選的方法，其特征在于，以微衛(wèi)星位點ScATT3為分子標記，所述微衛(wèi)星位點ScATT3與釀酒酵母乙酸耐受性性狀成正相關(p<0.05)。與傳統方法相比，本發(fā)明提供的以微衛(wèi)星ScAAT3為分子標記對釀酒酵母乙酸耐受性進行篩選的方法，具有豐度高、多態(tài)性高、共顯性標記、可以鑒別出雜合子和純合子，實驗重復性好，結果可靠，選擇中性、可自動化檢測分析等特點，具有廣闊的應用價值。
【專利說明】-種以微衛(wèi)星為分子標記篩選釀酒酵母乙酸耐受性性狀的 方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及釀酒酵母乙酸耐受性的篩選，特別是以微衛(wèi)星ScAAT3為分子標記的 篩選，屬于遺傳領域。

【背景技術】
[0002] 釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)是一類重要的工業(yè)微生物，被廣泛應用于 食品焙烤、啤酒、酒精、白酒、黃酒、葡萄酒、清酒的釀造和有機酸的生產等方面。釀酒酵母在 進行有機酸發(fā)酵時，發(fā)酵醪液pH往往低于3. 5,有時甚至達到2. 5,這不利于生產菌株的生 長及產物的生成，提高了生產成本。研究發(fā)現，釀酒酵母的耐有機酸能力與菌株來源、酸性 物質種類和培養(yǎng)方式等均密切相關。因此篩選耐酸能力強的釀酒酵母生產菌株有利于提高 生產效率，降低生產成本，在工業(yè)生產中有著巨大的商業(yè)價值。
[0003] 傳統的釀酒酵母遺傳性狀的篩選方法主要有基因敲除法和大批量誘變篩選法。在 基因敲除后酵母的表型性狀會發(fā)生改變，因此可通過基因敲除來對酵母遺傳性狀進行篩 選。但由于表型性狀是由基因型與多種因素共同作用的結果，因此通過基因敲除來對酵母 遺傳性狀進行篩選準確性較低。而通過誘變的方法對釀酒酵母遺傳性狀進行篩選，效率較 低，且需要耗費大量的人力、物力和財力。目前，遺傳標記已成為分子生態(tài)學研究的重要 手段，被廣泛用于揭示釀酒酵母遺傳多樣性。DNA標記能直接反應基因組DNA間的差異， 如：單核苷酸多態(tài)性標記（SNP)，隨機擴增多態(tài)性標記（RAPD)，限制性片段長度多態(tài)性標記 (RFLP)和擴增片段長度多態(tài)性標記（AFLP)等。SNP是檢測等位序列上的單個核苷酸存在的 差異，因此SNP是二等位多態(tài)性，RPAD標記擴增出來的DNA片段具有隨機性和任意性，但一 般表現為顯性遺傳，不能區(qū)分顯性純合和雜合的基因型；RFLP標記需要消耗大量時間且需 要使用放射性標記，效率較低切操作程序復雜。AFLP標記通過選擇性擴增基因組DNA酶切 片段所產生的擴增產物的多態(tài)性，該技術結合了 RFLP的穩(wěn)定性和PCR的技術，同時克服例 如RELP帶型少，信息量小及RAPD技術不穩(wěn)定的缺點。但同時也更加費時費力，程序復雜， 因此有必要開發(fā)一種新的簡單快速，可靠的篩選方法。
[0004] 微衛(wèi)星DNA序列（SSR)，是一類由幾個（多為1-6個）堿基組成的基序串聯重復而 成的DNA序列，在眾多的遺傳標記技術中，它具有不受環(huán)境影響，多態(tài)性高，特異性強，遺傳 穩(wěn)定，與生物表型相關度高，并能直接反映DNA序列水平的遺傳變異等特點。近年來，微衛(wèi) 星DNA分子標記作為新興的標記技術，以其多態(tài)點豐富、與生物表型相關度高等優(yōu)點在生 物遺傳多樣性、等位基因鑒定等研究方面已經取得了較好的結果，也廣泛用于釀酒酵母菌 株的分類鑒定、菌株間的親緣關系分析和釀酒酵母群體遺傳多樣性分析。
[0005] 本研究首次將SSR分子標記與釀酒酵母乙酸耐受性性狀相結合，探索SSR分子與 釀酒酵母乙酸耐受性性狀相關性，為利用SSR對釀酒酵母乙酸耐受性性狀篩選提供一種較 為有效的方法，并為以SSR為分子標記對微生物遺傳性狀進行篩選提供借鑒。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的問題是提供一種以微衛(wèi)星位點為分子標記對釀酒酵母乙酸耐 受性性狀進行篩選的方法。
[0007] 所述微衛(wèi)星位點為ScAAT3,該微衛(wèi)星位點與釀酒酵母乙酸耐受性成正相關 (p〈0. 05)，可以作為釀酒酵母乙酸耐受性性狀篩選的分子標記。
[0008] 本發(fā)明要解決的另一個技術問題是以微衛(wèi)星為分子標記，建立釀酒酵母乙酸耐受 性與11個微衛(wèi)星相關性。
[0009] 選取釀酒酵母基因組中11個微衛(wèi)星位點，通過PCR擴增技術對44株釀酒酵母生 產菌株進行準確快速分型，并建立相關的基因型數據庫。根據實驗菌株的耐酸表型差異，利 用SPSS軟件統計分析，建立釀酒酵母微衛(wèi)星與乙酸耐受性性狀之間的相關性。
[0010] 與傳統方法相比，本發(fā)明提供的以微衛(wèi)星SCAAT3為分子標記對釀酒酵母乙酸耐 受性進行篩選的方法，具有豐度高、多態(tài)性高、共顯性標記、可以鑒別出雜合子和純合子，實 驗重復性好，結果可靠，選擇中性、可自動化檢測分析等特點，具有廣闊的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖144株菌乙酸耐受性表型鑒定結果
[0012] 圖2釀酒酵母在ScAAT3和AT-X位點處的等位基因多態(tài)性

【具體實施方式】
[0013] YH)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L
[0014] 醋酸母液：配置5mM的醋酸溶液，用NaOH調節(jié)其pH至4. 5,現配現用。
[0015] YPD醋酸平板：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L、瓊脂粉2g，ρΗ4· 5,滅 菌后分別添加終濃度為50、70、90和110mM的醋酸母液。
[0016] 活化培養(yǎng)條件：采用YH)培養(yǎng)基，裝液量為20 %，采用50mL搖瓶進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫 度為30°C，培養(yǎng)時間為24h，轉速為200rpm。培養(yǎng)條件：采用YH)培養(yǎng)基，裝液量為20%，采 用50mL搖瓶進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為20h，搖床轉速為200rpm。
[0017] 釀酒酵母乙酸耐受性表型值的確定：
[0018] 分別測定各個搖瓶中菌液的〇D_值，然后用無菌水將各菌株菌液稀釋到0D_值 相等，分別取少量稀釋后的菌液點在不同濃度的Yro醋酸平板上，分別以相同od_的菌液 稀釋100倍后在無醋酸平板上生長的菌落作為參照，若某濃度乙酸脅迫培養(yǎng)后的菌落與其 相當，則判定該濃度為此菌的乙酸耐受性表型值。
[0019] 微衛(wèi)星基因分型：
[0020] 以釀酒酵母基因組為模板，利用熒光標記的引物進行PCR擴增，取1 μ L擴增產物 加入9 μ L上樣緩沖液（含有8. 7 μ L甲酰胺，0. 3 μ LGS500分子內標）渦旋混勻，稍稍離心； 將上述樣品放置在95°C變性3min，隨后立即放入4°C進行冷卻，以備上樣；利用ABI377DNA 測序儀進行毛細管電泳；GeneS Can3. 7軟件分析熒光信號。
[0021] 實施例1釀酒酵母乙酸耐受性表型的鑒定
[0022] 本實施例以細胞的存活率為指標，考察釀酒酵母菌株的耐乙酸脅迫能力。取少量 實驗菌株的甘油菌液分別接種于YPD平板上，30°C培養(yǎng)過夜；隨后在YPD平板上挑取單菌 落轉接至含有l(wèi)OmLYH)液體培養(yǎng)基的搖瓶中，在30°C搖床中培養(yǎng)24h，搖床轉速為200rpm ; 分別在上述搖瓶中取少量菌液，轉接至含有10mL新鮮YH)液體培養(yǎng)基的搖瓶中，在30°C的 搖床中培養(yǎng)20h，設置搖床轉速為200rpm ;隨后分別測定上述搖瓶中菌液的0D600值，用無 菌水將所有菌液的0D600稀釋到1，取上述稀釋后的菌懸液5μ L點在不同乙酸濃度的YPD 平板上，分別以0D600 = 1的菌懸液稀釋100倍后在無乙酸ΥΗ)平板上生長的菌落作為對 照。若某濃度乙酸脅迫培養(yǎng)后的菌落與其相當，則判定為該濃度為此菌的乙酸表型值，根據 上述實驗結果對釀酒酵母乙酸耐受性表型進行鑒定（結果如圖1所示）。
[0023] 實施例2微衛(wèi)星基因型數據庫的構建
[0024] 根據挑選的微衛(wèi)星位點的上下游保守序列設計引物，為實現微衛(wèi)星多 態(tài)性的半自動精確檢測，分別在各引物的上游5'端修飾不同的熒光標記，提 取44株菌的基因組作為PCR擴增的模板，利用PCR進行擴增，PCR擴增條件如 下：95 °C 5min, (94 °C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 30s，此過程重復 30 個循環(huán)），72 °C 7min， 12°C lOmin(不同的微衛(wèi)星位點退火溫度不同）。
[0025] PCR擴增產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步對擴增產物的質量、濃度和片段 大小進行評估，以便選擇合適的擴增產物進行下一步的檢測分析。經過初步的檢測結果，選 取擴增效果較好的產物進行多態(tài)性檢測。取lul擴增產物加入10 μ L上樣緩沖液（含有 8. 7ul甲酰胺，0. 3ulGS500分子內標），95°C變性3分鐘，立即放到4°C冷卻，利用ABI377DNA 測序儀進行毛細管電泳，GeneS Can3. 7軟件根據每條泳道的分子量內標，將泳道內的所有條 帶解讀為不同的長度，最后根據釀酒酵母在各個微衛(wèi)星位點的擴增條帶在瓊脂糖凝膠電泳 中的目的片段的大小進行判讀并獲取數據，獲得完整的基因型數據庫。
[0026] 通過計算等位基因的頻率可以評估菌種的遺傳多樣性，統計釀酒酵母在11個微 衛(wèi)星位點的等位基因數目和等位基因頻率（如表1)。44株釀酒酵母在11個微衛(wèi)星位點共 得到207個等位基因，提供較為豐富的遺傳信息。各個微衛(wèi)星位點的等位基因數目在9-37 之間變化，平均每個位點上的等位基因為18. 82個。其中，在微衛(wèi)星位點C4上檢測到的等 位基因最多，為34個；在微衛(wèi)星位點AT-X上檢測到的等位基因最少，為9個。C4、C5和 ScY0R267c位點在47株菌種檢測出的等位基因分別是19、22和23個，而本實施例中44株 菌中這三個位點的等位基因數分別是37、20及25個。ScAATl、C5、ScY0R267C、YPL009C和 C4具有較多的等位基因數，多態(tài)性較高，說明本實施例所選取的菌株具有較高的遺傳多樣 性，各菌株之間的遺傳差異較大。11個微衛(wèi)星中，ScAAT3位點的雜合率最低，275bp、254bp、 245bp片段只存在于耐酸菌株中（如圖2)。
[0027] 表1釀酒酵母在ScAAT3和AT-X位點處的等位基因多態(tài)性分析
[0028]

【權利要求】
1. 一種以微衛(wèi)星位點為分子標記對釀酒酵母乙酸耐受性性狀進行篩選的方法，其特征 在于，以微衛(wèi)星位點SCATT3為分子標記。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于微衛(wèi)星位點ScATT3與釀酒酵母乙酸耐受性 性狀成正相關（P〈〇. 05)。
【文檔編號】C12N15/11GK104232635SQ201410506102
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權日:2014年9月26日
【發(fā)明者】張梁, 石貴陽, 肖銀, 胡蕓, 顧正華, 丁重陽 申請人:江南大學