昆蟲抗性和除草劑耐受性大豆事件9582.814.19.1的制作方法
【專利摘要】大豆事件9582.814.19.1包含編碼Cry1F、Cry1Ac(synpro)、和PAT的基因，其對含有該事件的大豆作物提供昆蟲抗性和除草劑耐受性，并且實現(xiàn)用于植物保護(hù)和貯存產(chǎn)品保護(hù)的方法。
【專利說明】昆蟲抗性和除草劑耐受性大豆事件9582.814.19.1
[0001]對相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年7月26日提交的臨時申請N0.61/511，664和2011年8月10日提交的臨時申請N0.61/521，798的優(yōu)先權(quán)，這兩篇通過提及完整收入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]編碼CrylF和CrylAc synpro (CrylAc)的基因能夠?qū)D(zhuǎn)基因植物賦予昆蟲抗性，例如對鱗翅目(I印idopteran)昆蟲的抗性；而編碼PAT(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)的基因能夠?qū)D(zhuǎn)基因植物賦予對除草劑膦絲菌素(草丁磷)的耐受性。PAT已經(jīng)在大豆中成功表達(dá)，既在生成昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因作物中用作選擇標(biāo)志物，又在轉(zhuǎn)基因作物中賦予對除草劑草丁磷的商業(yè)水平的耐受性。
[0005]已知外來基因在植物中的表達(dá)受到其在植物基因組中位置影響，這可能是由于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(例如異染色質(zhì))或整合位點附近的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(例如增強(qiáng)子)的接近性所致(Weising等，Ann.Rev.Genet22:421-477, 1988)。同時，轉(zhuǎn)基因在基因組中不同位置處的存在會以不同方式影響植物的總體表型。出于此原因，經(jīng)常有必要篩選大量事件以鑒定以引入的感興趣基因的最佳表達(dá)為特征的事件。例如，在植物中及在其它生物體中已經(jīng)觀察到事件間可以有引入基因的表達(dá)水平的較寬變化。還可以有表達(dá)的空間或時間方式的差異，例如轉(zhuǎn)基因在各種植物組織中的相對表達(dá)差異，其不能對應(yīng)于從引入的基因構(gòu)建體中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件預(yù)期的方式。出于此原因，常見的是生成數(shù)百至數(shù)千個不同事件，并且對那些事件篩選具有對于商業(yè)目的期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和方式的單一事件。具有期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平或方式的事件可用于將轉(zhuǎn)基因漸滲(intoogress)入其它遺傳背景中，其通過使用常規(guī)育種方法的有性異性雜交(outcrossing)進(jìn)行。此類雜交的后代維持初始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。此策略用于確保完全適合于地方生長條件的多種品種的可靠基因表達(dá)。
[0006]期望能夠檢測特定事件的存在`以測定有性雜交的后代是否含有轉(zhuǎn)基因或感興趣轉(zhuǎn)基因的組。另外，用于檢測特定事件的方法會有助于例如遵守要求自重組作物植物衍生的食物的銷售前批準(zhǔn)和標(biāo)簽的規(guī)則，或者有助于用于環(huán)境監(jiān)測，監(jiān)測田間作物的性狀，或者監(jiān)測自作物收獲物衍生的產(chǎn)品，以及用于確保服從管理或合同條款的各方的順應(yīng)性。
[0007]有可能通過本領(lǐng)域中已知的任何核酸檢測方法，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或使用核酸探針的DNA雜交來檢測轉(zhuǎn)基因事件的存在。這些檢測方法一般聚焦于常用的遺傳元件，諸如啟動子、終止子、標(biāo)志物基因，等等，因為對于許多DNA構(gòu)建體，編碼區(qū)是可互換的。因此，此類方法可能不可用于區(qū)別不同事件，特別是使用相同DNA構(gòu)建體或非常相似的構(gòu)建體生成的那些事件，除非與插入的異源DNA相鄰的側(cè)翼DNA的DNA序列是已知的。例如，對于玉米事件DAS-59122-7，事件特異性PCR測定法記載于美國專利申請2006/0070139。會期望具有用于鑒定大豆事件9582.814.19.1的簡單且有區(qū)別力的方法。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明涉及新的昆蟲抗性和除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化事件，稱作大豆事件9582.814.19.1，其包含插入大豆細(xì)胞基因組內(nèi)的特定位點中的如本文中描述的crylF，crylAc和pat。代表性大豆種子已經(jīng)以段落[0021]中標(biāo)識的登錄號保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。含有此事件的大豆植物的DNA包含本文中描述的接合(junction)/側(cè)翼序列，其表征大豆基因組內(nèi)插入DNA的位置。SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2診斷大豆事件 9582.814.19.1。更具體而言，SEQ ID NO:1 的 bpl400/1401，和 bpl536/1537，及 SEQ IDNO:2的bpl52/153處接合周圍的序列診斷大豆事件9582.814.19.1。下文段落[00012]描述了包含含有大豆事件9582.814.19.1的大豆DNA特征性的這些接合的序列的例子。
[0010]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了大豆植物或其部分，其對大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)(大豆尺蠖(soybean looper))有抗性,并且具有包含一種或多種選自下組的序列的基因組:SEQ ID NO:1 的 bpl385-1415 ；SEQ ID NO:1 的 bpl350_1450 ；SEQ ID N0:1 的 bpl300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID NO: 2 的 bpl37_168 ;SEQ ID N0:2的bpl03-203 ;和SEQ ID NO:2的bp3_303及其互補(bǔ)物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了此類植物的種子。
[0011]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種控制昆蟲的方法,其包括將昆蟲暴露于昆蟲抗性大豆植物，由此以控制所述昆蟲，其中所述大豆植物具有含有一種或多種選自下組的序列的基因組:SEQ ID N0:1 的 bpl385-1415 ;SEQ ID NO:1 的 bpl350_1450 ;SEQID N0:1 的 bpl300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID NO: 2 的 bpl37_168 ;SEQID N0:2的bpl03-203 ;和SEQ ID N0:2的bp3_303及其互補(bǔ)物；所述序列是大豆事件9582.814.19.1 存在特征性的。大豆事件 9582.814.19.1 中 crylF v3(crylF)和 cryIAcsynpro (cryIAc)基因的存在賦予對例如大豆夜蛾(大豆尺蠖)，黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)(黎豆毛蟲(velvet bean caterpillar))，夜小卷蛾(Epinotia aporema)，Omoides indicatus,薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu),草地夜蛾(Spodoptera frugiperda),Spodoptera cosmoides,南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)，煙芽夜蛾(Heliothisvirescens),美洲棉鈴蟲 (Heliocoverpa zea), Spilosoma virginica 和南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus Iignosellus)的抗性。
[0012]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了控制大豆作物中雜草的方法,其包括對大豆作物應(yīng)用草丁磷除草劑，所述大豆作物包含具有基因組的大豆植物，所述基因組含有一種或多種選自下組的序列:SEQ ID N0:1 的 bpl385-1415 ;SEQ ID NO:1 的 bpl350_1450 ;SEQ ID N0:1 的 bpl300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID NO: 2 的 bpl37_168 ;SEQ ID N0:2的bpl03-203 ;和SEQ ID N0:2的bp3_303及其互補(bǔ)物，其診斷大豆事件9582.814.19.1的存在。大豆事件9582.814.19.1中pat v6 (pat)基因的存在賦予對草丁磷除草劑的耐受性。
[0013]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測包含大豆DNA的樣品中大豆事件9582.814.19.1的方法，所述方法包括:
[0014](a)使所述樣品與長度至少IObp的第一引物和長度至少IObp的第二引物接觸，所述第一引物選擇性結(jié)合SEQ ID N0:1的bpl-1400或其互補(bǔ)物內(nèi)的側(cè)翼序列，所述第二引物選擇性結(jié)合SEQ ID NO:1的bpl401-1836或其互補(bǔ)物內(nèi)的插入物序列；并測定所述引物間生成的擴(kuò)增子；或
[0015](b)使所述樣品與長度至少IObp的第一引物和長度至少IObp的第二引物接觸，所述第一引物選擇性結(jié)合SEQ ID N0:2的bpl-152或其互補(bǔ)物內(nèi)的插入物序列，所述第二引物選擇性結(jié)合SEQ ID NO:2的bpl53-1550或其互補(bǔ)物內(nèi)的側(cè)翼序列；并
[0016](c)測定所述引物間生成的擴(kuò)增子。
[0017]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測大豆事件9582.814.19.1的方法，其包括:
[0018](a)使所述樣品與第一引物和第二引物接觸，所述第一引物選擇性結(jié)合選自下組的側(cè)翼序列:SEQ ID NO:1的bpl-1400和SEQ ID NO: 2的bpl53_1550及其互補(bǔ)物，所述第二引物選擇性結(jié)合SEQ ID NO:3或其互補(bǔ)物；
[0019](b)將所述樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)處理；并
[0020](c) (e)測定所述引物間生成的擴(kuò)增子。
[0021]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了對大豆植物育種的方法，其包括:將第一植物與第二大豆植物雜交以生成第三大豆植物,所述第一植物包含DNA，該DNA包含一種或多種選自下組的序列:SEQ ID N0:1 的bpl385-1415 ;SEQ ID NO:1 的bpl350_1450 ;SEQ ID NO:1的 bpl300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID NO: 2 的 bpl37_168 ;SEQ ID NO: 2的bpl03-203 ;和SEQ ID NO:2的bp3_303，及其互補(bǔ)物；并對所述第三大豆植物測定包含一種或多種選自下組的序列的DNA的存在:SEQ ID NO:1的bpl385_1415 ;SEQ ID NO:1的bpl350-1450 ；SEQ ID NO:1 的 bpl300_1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID N0:2 的bpl37-168 ；SEQ ID NO:2 的 bpl03_203 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp3_303，及其互補(bǔ)物。
[0022]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷大豆事件9582.814.19.1的分離的DNA分子。在SEQ ID N0S:1和2外，此類分子包括包含SEQ ID NO:1的bpl400_1401和SEQID NO:1中相對于bpl400/1401接合的每個方向的至少IObp且長度至少25bp的分子；包含SEQ ID NO:2的152 - 153和SEQ ID N0:2中相對于bpl52/153接合的每個方向的至少IObp且長度至少25bp的擴(kuò)增子。例子是SEQ ID NO:1的bpl385_1415 ;SEQ ID NO:1的bpl350-1450 ；SEQ ID NO:1 的 bpl3`00_1500 ;SEQ ID NO:1 的bpl200_1600 ;SEQ ID N0:2 的bpl37-168 ；SEQ ID NO:2 的 bpl03_203 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp3_303，及其互補(bǔ)物。
[0023]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了控制大豆谷粒、種子或種子粗粉中的有害生物的方法，其包括在所述谷粒、種子或種子粗粉中包含大豆事件9582.814.19.1，如由包含一種或多種選自下組的序列的DNA的所述谷粒、種子或種子粗粉證明的:SEQ ID N0:1的bpl385-1415 ；SEQ ID NO:1 的 bpl350_1450 ;SEQ ID NO:1 的 bpl300_1500 ;SEQ ID NO:1 的bpl200-1600 ；SEQ ID NO:2 的 bpl37_168 ;SEQ ID NO:2 的 bpl03_203 ;和 SEQ ID N0:2 的bp3-303，及其互補(bǔ)物。
[0024]本發(fā)明還包括含有大豆事件9582.814.19.1的大豆植物細(xì)胞和植物部分，包括但不限于花粉、胚珠、花、枝條(Shoot)、根、和葉，及營養(yǎng)細(xì)胞的核、花粉細(xì)胞、種子和種子粗粉、和卵細(xì)胞。
[0025]在一些實施方案中，可以將大豆事件9582.814.19.1與其它性狀組合，所述性狀包括例如其它除草劑耐受性基因和/或昆蟲抑制性蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(即RNA干擾，dsRNA，轉(zhuǎn)錄因子，等等)。可以經(jīng)由植物育種，含有大豆事件9582.814.19.1的轉(zhuǎn)基因植物的再轉(zhuǎn)化，或經(jīng)由同源重組通過靶向整合添加新性狀將別的性狀疊加到植物基因組中。
[0026]其它實施方案包括切割包含大豆事件9582.814.19.1 (包括例如pat基因表達(dá)盒)的多核苷酸序列。在切割多核苷酸序列后，可以將經(jīng)修飾的事件在特定的染色體位置再靶向，其中別的多核苷酸序列與大豆事件9582.814.19.1疊加。
[0027]在一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋位于染色體02上在SEQ ID NO:1和2中列出的側(cè)翼序列之間的大豆染色體靶位點。
[0028]在一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋生成轉(zhuǎn)基因大豆植物的方法，其包括在染色體02上在SEQ ID N0:1和2中列出的基因組序列之間，即SEQ ID NO:1的bpl-1400和SEQ IDNO:2的bpl53-1550之間的位置處插入異源核酸。
[0029]另外，本發(fā)明提供了用于檢測(例如大豆)樣品中的主題事件的存在的測定法。測定法可以基于插入大豆基因組中的重組構(gòu)建體的DNA序列，以及基于在插入位點側(cè)翼的基因組序列。還提供了可用于進(jìn)行測定法的試劑盒和條件。
[0030]本發(fā)明部分涉及源自在轉(zhuǎn)基因大豆系中插入來自PDAB9582的T-DNA的邊界區(qū)的DNA序列的克隆和分析。這些序列是獨特的。基于插入物和接合序列，可以生成事件特異性引物。PCR分析證明了這些事件可以通過分析用這些事件特異性引物組生成的PCR擴(kuò)增子來鑒定。如此，這些和其它相關(guān)規(guī)程可以用于獨特鑒定包含本發(fā)明事件的大豆系。
[0031]種子保藏
[0032]作為此公開內(nèi)容的一部分，包含大豆事件9582.814.19.1的大豆系的至少2500粒種子保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas, VA, 20110。ATCC于2011年7月21日接收保藏物ATCC專利保藏名稱PTA-12006。生成此保藏物，并且為了專利規(guī)程的目的就種子保藏物而言會依照布達(dá)佩斯條約的條款或者在布達(dá)佩斯條約的條款下維持。生成此保藏物，并且為了專利規(guī)程的目的就種子保藏物而言會依照 布達(dá)佩斯條約的條款或者在布達(dá)佩斯條約的條款下維持。
[0033]序列簡述
[0034]SEQ ID NO:1是大豆事件9582.814.19.1的5’DNA側(cè)翼邊界序列。核苷酸1-1400是基因組序列。核苷酸1401-1535是來自pDAB9582的重排序列。核苷酸1536-1836是插入物序列。
[0035]SEQ ID NO: 2是大豆事件9582.814.19.1的3’ DNA側(cè)翼邊界序列。核苷酸1-152是插入物序列。核苷酸153-1550是基因組序列。
[0036]SEQ ID NO: 3是pDAB9582的DNA序列，其在下文表1中注釋。
[0037]SEQ ID N0:4是用于確認(rèn)5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物81419_FW3。
[0038]SEQ ID N0:5是用于確認(rèn)3’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物81419_RV1。
[0039]SEQ ID N0:6是用于確認(rèn)3’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物81419_RV2。
[0040]SEQ ID NO: 7是用于確認(rèn)3’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物81419_RV3。
[0041]SEQ ID N0:8是用于確認(rèn)5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5’ IREnd-Ol0
[0042]SEQ ID NO:9是用于確認(rèn)5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物5’ IREnd-02。
[0043]SEQ ID NO: 10是用于確認(rèn)5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物AtUbi 10RV1。
[0044]SEQ ID NO: 11是用于確認(rèn)5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物AtUbi 10RV2。
[0045]SEQ ID NO: 12是用于確認(rèn)3’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3’ PATEnd05。
[0046]SEQ ID NO: 13是用于確認(rèn)3’邊界基因組DNA的寡核苷酸引物3’ PATEnd06。
[0047]SEQ ID NO: 14是大豆事件9582.814.19.1的確認(rèn)序列。包括5’基因組側(cè)翼序列，PDAB9582T鏈插入物，和3’基因組側(cè)翼序列。[0048]附圖簡述
[0049]圖1是含有crylF、cryIAc和pat表達(dá)盒的pDAB9582的質(zhì)粒圖。
[0050]圖2描繪了用于確認(rèn)大豆事件pDAB9582.814.19.1的5’和3’邊界序列的引物位置。
[0051]圖3描繪了大豆事件PDAB9582.814.19.1中的基因組序列重排。
[0052]發(fā)明詳述
[0053]已經(jīng)對大豆事件9582.814.19.1插入的兩個末端測序并表征。開發(fā)出事件特異性測定法。還已經(jīng)將其定位至大豆基因組(大豆基因組02)?？梢詫⑹录u滲入別的良種系中。
[0054]如上文在發(fā)明部分中提到的，對植物基因組中引入并整合轉(zhuǎn)基因牽涉一些隨機(jī)事件(因此名稱“事件”代表表達(dá)的給定插入)。也就是說，憑借許多轉(zhuǎn)化技術(shù)諸如土壤桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化，生物射彈轉(zhuǎn)化(即基因槍)，和碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(即WHISKERS)，不可預(yù)測在基因組中轉(zhuǎn)基因會在何處被插入。如此，鑒定插入物兩側(cè)的側(cè)翼植物基因組DNA對于鑒定具有給定插入事件的植物可以是重要的。例如，可以設(shè)計PCR引物，其生成穿過插入物和宿主基因組的接合區(qū)的PCR擴(kuò)增子。可以使用此PCR擴(kuò)增子來鑒定獨特的或不同類型的插入事件。
[0055]本文中提供的定義和實例是為了幫助描述本發(fā)明并指導(dǎo)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員實施本發(fā)明。除非另有記錄，應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解術(shù)語。使用如列于37CFR § 1.822的DNA堿基命名法。
[0056]如用于本文，術(shù)語“后代”指包含大豆事件9582.814.19.1的親本植物的任何世代的后代。
[0057]轉(zhuǎn)基因“事件”是通過用異源DNA，即包含感興趣的轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，重新產(chǎn)生由將所述轉(zhuǎn)基因插入植物基因組所得的植物群體，并選擇由插入特定基因組位置所表征的特定植物來產(chǎn)生。術(shù)語“事件”指含有所述異源DNA的起始轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)化體后代。術(shù)語“事件”還指通過轉(zhuǎn)化體和含有基因組/轉(zhuǎn)基因DNA的另一品種之間的有性異型雜交(outcross)產(chǎn)生的后代。即使在與回歸(recurrent)親本的反復(fù)回交之后,插入的轉(zhuǎn)基因DNA和來自轉(zhuǎn)化的親本的側(cè)翼基因組DNA (基因組/轉(zhuǎn)基因DNA)仍存在于雜交后代的相同染色體位置處。術(shù)語“事件”還指來自包含插入的DNA和直接鄰接插入的DNA的側(cè)翼基因組序列的起始轉(zhuǎn)化體及其后代的DNA,期待其會轉(zhuǎn)移至下述后代,所述后代作為一個含有所述插入的DNA的親本系(例如起始轉(zhuǎn)化體和其自交所得的后代)和不含有該插入的DNA的親本系有性雜交的結(jié)果而接受了含有感興趣的轉(zhuǎn)基因的插入的DNA。
[0058]“接合序列”或“邊界序列”跨越了插入基因組的DNA與來自插入點側(cè)翼的大豆天然基因組的DNA連接的點，其中植物基因物質(zhì)中一種或其他接合序列的鑒定或檢測足以對所述事件具診斷性。包括了跨越本文中所述的大豆事件中的插入和類似長度的側(cè)翼DNA的DNA序列。本文中提供了此類診斷性序列的具體實例；然而，其他與插入的接合或插入和基因組序列的接合重疊的序列也具診斷性，并可根據(jù)本發(fā)明使用。
[0059]本發(fā)明部分涉及使用此類側(cè)翼、接合和插入物序列的事件鑒定。本發(fā)明包括相關(guān)的PCR引物和擴(kuò)增子。根據(jù)本主題發(fā)明，使用跨越插入的DNA及其邊界的擴(kuò)增子的PCR分析方法可用于檢測或鑒定商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因大豆品種或來源于本主題專利的轉(zhuǎn)基因玉米品系白勺品系。
[0060]側(cè)翼/接合序列診斷出大豆事件9582.814.19.1?；谶@些序列，生成事件特異性弓丨物。PCR分析證明了可通過對用這些事件特異性引物組生成的PCR擴(kuò)增子的分析來在不同的玉米基因型中鑒定這些大豆品系。如此，這些和其他相關(guān)規(guī)程可用于獨特地鑒定這些玉米品系。本文中鑒定的序列是獨特的。
[0061]本主題發(fā)明的檢測技術(shù)特別地可與植物育種一同使用，以確定在為了將一種或多種其他感興趣的性狀賦予后代，將包含感興趣的事件的親本植物與另一種植物品系雜交之后，哪些后代植物包含給定事件。這些PCR分析方法有利于大豆育種項目以及質(zhì)量控制，特別是對于商業(yè)化轉(zhuǎn)基因大豆種子?，F(xiàn)在亦可制備并使用用于這些轉(zhuǎn)基因大豆品系的PCR檢測試劑盒。這亦可幫助產(chǎn)品登記和產(chǎn)品管理。
[0062]此外，可使用側(cè)翼大豆/基因組序列以特異性鑒定每個插入物的基因組位置。該信息可用于制作特異于每一個事件的分子標(biāo)志物系統(tǒng)。這些可用于加速育種策略和構(gòu)建連鎖數(shù)據(jù)。
[0063]此外，可使用側(cè)翼序列信息以研究和表征轉(zhuǎn)基因整合過程，基因組整合位點特征，事件分選，轉(zhuǎn)基因及其側(cè)翼序列的穩(wěn)定性，和基因表達(dá)(特別涉及基因靜默，轉(zhuǎn)基因甲基化樣式，位置效應(yīng)，和潛在的表達(dá)相關(guān)元件，如MARS (基質(zhì)連接區(qū))等)。
[0064]對于所有主題公開，應(yīng)顯而易見本主題發(fā)明包括以段落[0021]中標(biāo)識的ATCC保藏號可獲得的種子。本主題發(fā)明還包括從以段落[0021]中標(biāo)識的ATCC保藏號保藏的種子培育的除草劑抗性大豆植物。本主題發(fā)明進(jìn)一步包括所述植物的部分，如葉、組織樣品、由所述植物產(chǎn)生的種子、花粉等(其中它們包含crylF, cryIAc, pat,和SEQ ID NO:1和2)。
[0065]此外，本主題發(fā)明包括從保藏的種子培育的植物的后裔和/或后代植物，優(yōu)選為除草劑抗性大豆植物，其中所述植物具有包含如本文所述的可檢測的野生型接合序列的基因組。如用于本文，術(shù)語“大豆”意指大豆(Glycine max)，并包括所有其可與大豆植物育種的品種。
[0066]本發(fā)明進(jìn)一步包括使用本主題發(fā)明的植物作為至少一個親本來進(jìn)行雜交的過程。舉例而言，本主題發(fā)明包括具有本文中例示的任何植物作為一個或兩個親本的F1雜交植物。本主題發(fā)明還包括由此類本主題發(fā)明的Fl雜合體產(chǎn)生的種子。本發(fā)明包括用于產(chǎn)生F1雜合體的方法，即將例示的植物與不同(例如，近交的親本)植物雜交和收獲所得的雜交種子。本主題發(fā)明包括作為母本或父本的示例性植物。所得的植物的特征亦可通過慎重選擇親本植物來改善。
[0067]可培育本發(fā)明的昆蟲抗性/草丁磷耐受性大豆植物，即首先將由本文中提及的任何一種品系種子培育的大豆植物組成的第一親本大豆植物和第二親本植物有性雜交，由此產(chǎn)生多株第一后代植物，然后選擇對草丁磷有抗性的第一后代植物；將第一后代植物自交，由此產(chǎn)生多株第二后代植物，然后從第二后代植物選擇對草丁磷有抗性的植物。這些步驟可進(jìn)一步包括將第一后代植物或第二后代植物與第二親本大豆植物或第三親本大豆植物回交。然后可種植包含本主題發(fā)明或其后代的大豆種子的大豆作物。
[0068]亦可理解的是，亦可使兩種不同轉(zhuǎn)基因植物交配以產(chǎn)生含有兩種獨立分離添加的外源基因的后代。合適后代的自交可產(chǎn)生對于兩種添加的外源基因為純合的植物。亦考慮了回交于親本植物和與非轉(zhuǎn)基因植物的異型 雜交，以及營養(yǎng)繁殖。其他常用于不同性狀和作物的育種方法在本領(lǐng)域是已知的。使用了回交育種以將簡單遺傳的高度可遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移至期望的純合栽培種或近交系，其為回歸親本。待轉(zhuǎn)移的性狀的來源稱為供體親本。期待所得的植物具有回歸親本(例如栽培種)的特征和從供體親本轉(zhuǎn)移的期望的性狀。在起始雜交之后，選擇了擁有供體親本的表型的個體，并將其反復(fù)與回歸親本雜交(回交)。預(yù)期所得的親本具有回歸親本(例如栽培種)的特征，和從供體親本轉(zhuǎn)移的期望的性狀。
[0069]同樣地，可以使用本領(lǐng)域中已知的方法用別的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化本發(fā)明的昆蟲抗性/草丁磷耐受性大豆植物。轉(zhuǎn)化技術(shù)諸如土壤桿菌轉(zhuǎn)化、生物射彈轉(zhuǎn)化(即基因槍)，和碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(即WHISKERS)可以用于將別的轉(zhuǎn)基因?qū)氪蠖故录?582.814.19.1的基因組中?？梢詫行虏迦氲霓D(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物完成選擇和表征以鑒定在本發(fā)明的crylF, cryIAc, pat基因外含有新轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合子(integrant)的植物。
[0070]本發(fā)明的DNA分子可作為分子標(biāo)志物用于標(biāo)志物協(xié)助育種(MAB)方法。本發(fā)明的DNA分子可如本領(lǐng)域已知地用于鑒定遺傳連鎖的農(nóng)藝學(xué)上可用的性狀的方法(如AFLP標(biāo)志物，RFLP標(biāo)志物，RAPD標(biāo)志物，SNP和SSR)?？墒褂肕AB方法在與本主題發(fā)明的大豆植物的雜交(或其后代和任何其他大豆栽培種或品種)的后代中追蹤昆蟲抗性和除草劑耐受性性狀。所述DNA分子為針對該性狀的標(biāo)志物，且本領(lǐng)域中公知的MAB方法可用于追蹤大豆植物中的除草劑抗性性狀，其中至少一種本主題發(fā)明的大豆品系或其后代為親本或祖先。本發(fā)明的方法可用于鑒定具有本主題事件的任何大豆品種。
[0071]本主題發(fā)明的方法包括產(chǎn)生昆蟲抗性/除草劑耐受大豆植物的方法，其中所述方法包括用本主題發(fā)明的植物育種。更具體而言，所述方法可包括將兩株本主題發(fā)明的植物雜交，或一株本主題發(fā)明的植物與任何其他植物雜交。優(yōu)選的方法進(jìn)一步包括通過就根據(jù)本主題發(fā)明可檢測的事件和有利的品種性能(例如產(chǎn)量)分析所述后代來選擇所述雜交的后代。舉例而言，本主題發(fā)明可用于通過與包含其他所需的性狀如農(nóng)藝學(xué)性狀、疾病耐受性或抗性，線蟲耐受性或抗性和成熟日期的植物的育種循環(huán)來追蹤本主題事件?？蓹z測、鑒定、選擇包含本主題事件和所需的性狀的植物，并例如在進(jìn)一步的育種輪次中快速使用。本主題事件/性狀亦可通過育種來與其它昆蟲抗性性狀和/或其他的除草劑耐受性狀組合，并根據(jù)本主題發(fā)明進(jìn)行追蹤。后者的實施方案為包含與賦予對2，4- 二氯苯氧基乙酸和吡唳基氧乙酸酯(pyridyloxyacetate)除草劑的耐受性的aad_12基因或者與編碼對除草劑麥草畏(dicamba)的抗性的基因組合的本主題事件的植物。
[0072]因此，本主題發(fā)明可與，例如編碼草甘膦抗性(例如抗性植物或細(xì)菌EPSPS，G0X,GAT)，草銨膦抗性(例如pat，bar)，乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草劑抗性(例如咪唑啉酮[如咪草煙Qmazethapyr)]、磺酰脲、三唑并喃唳磺酰苯胺、喃唳基硫代苯甲酸類和其他化學(xué)物[Csr I，SurA等])，溴苯腈抗性(例如Bxn)，對HPTO酶(4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶)抑制劑的抗性，對八氫番爺紅素去飽和酶(phytoene desaturase) (PDS)的抑制劑的抗性，對光系統(tǒng)II抑制性除草劑(例如PsbA)的抗性，對光系統(tǒng)I抑制性除草劑的抗性，對原口卜啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase IX (PPO))抑制性除草劑(例如PP0-1)的抗性，對苯基脲除草劑(例如CYP76B1)的抗性，麥草畏降解酶(dicamba-degrading enzyme)(參見，例如US20030135879)，和其他可單獨或以多種組合疊加的性狀相組合，以提供有效控制或預(yù)防雜草演替(weed shift)的能力和/或?qū)τ谌魏吻笆鲱愋偷某輨┑目剐浴?br> [0073]此外，大豆事 件9582.814.19.1可與一種或多種其他輸入(例如，昆蟲抗性，病原體抗性，或應(yīng)激耐受性等)或輸出(例如增加的產(chǎn)量，改善的油分布(profile)，改善的纖維品質(zhì)等)性狀疊加。因此本主題發(fā)明可用于提供改善的作物品質(zhì)與靈活且合算地控制任何數(shù)量的農(nóng)藝學(xué)病蟲害的能力的完整農(nóng)藝學(xué)套組(package)。
[0074]本領(lǐng)域內(nèi)已描述了通過同源重組將多核苷酸序列整合在植物細(xì)胞的特定染色體位點內(nèi)的方法。舉例而言，描述于美國專利申請
【發(fā)明者】N.巴德, G.布拉德費希, Y.C.崔, J.E.德里普斯, T.霍夫曼, D.帕雷迪, D.M.帕克赫斯特, S.G.托勒多, B.維金斯, N.周 申請人:陶氏益農(nóng)公司