Pik3ca h1047r敲入非人動物乳腺癌模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及PIK3CA?H1047R敲入非人動物乳腺癌模型的開發(fā)，及其用于鑒定涉及紡錘細(xì)胞腫瘤形成的自發(fā)性功能喪失性TP53突變的用途。本發(fā)明還涉及使用這種模型對乳腺腫瘤中別的體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)異常的鑒定，及用于診斷和治療乳腺癌的方法和手段。
【專利說明】PIK3CA H1047R敲入非人動物乳腺癌模型
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及PIK3CAH1047R敲入非人動物乳腺癌模型的開發(fā)，及其用于鑒定涉及紡錘細(xì)胞腫瘤形成的自發(fā)性功能喪失性TP53突變的用途。本發(fā)明還涉及使用這種模型對乳腺腫瘤中別的體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)異常的鑒定，及用于診斷和治療乳腺癌的方法和手段。
[0002]發(fā)明背景
[0003]IA 類 PI3K 催化亞基 piIOa，pllO β 和 pllO δ 作為與 p85 a，p55 a，ρ50 a，ρ85 β或ρ55y調(diào)節(jié)亞基復(fù)合的專性異二聚體存在。在正常細(xì)胞中，ΡΙ3Κ維持于基礎(chǔ)無活性狀態(tài)且在生長因子刺激和細(xì)胞表面受體參與后變成有活性?；罨摩宝?Κ磷酸化并轉(zhuǎn)化磷脂酰肌醇4，5 二磷酸酯(ΡΙΡ2)，產(chǎn)生磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸酯(ΡΙΡ3)。升高的細(xì)胞ΡΙΡ3水平促進(jìn)ΡΙ3Κ效應(yīng)器活化，其繼而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞生長，增殖和存活(參見Cantley, L.C., Science296,1655-7 (2002) ；Hawkins, P.T.et al., Biochem Soc Trans34,647-62 (2006);及 Vanhaesebroeck, B., et al., Trends Biochem Sci30,194-204 (2005))。 [0004]已經(jīng)在結(jié)腸直腸癌，乳腺癌和肝癌中報告了編碼pllO α的基因PIK3CA中的頻繁體細(xì)胞突變(Samuels, Y.et al.，Science304, 554 (2004) ；Bachman, K.E.et al.，CancerBiol Ther3, 772-5 (2004) ；Lee, J.ff.et al., 0ncogene24，1477-1480 (2004))。報告的PllOa突變大多發(fā)生在三個熱點中-螺旋域中的兩個(Ε542Κ和Ε545Κ)和激酶域中的一個(H1047R) (Bader, A.G.et al.，Nat Rev Cancer5,921-9 (2005) ；Zhao, L.& Vogt, P.K.，Proc Natl Acad Sci U S A105，2652-7 (2008))。這些熱點突變產(chǎn)生致癌性pllO α，其能夠組成性激活下游信號傳導(dǎo)(Zhao，L.& Vogt,見上文)。而且，在異種移植物模型中，該pllO α突變體在細(xì)胞中表達(dá)時能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化及支持腫瘤形成(Samuels et al.,見上文；Zhao,L.& Vogt, 0ncogene27, 5486-5496 (2008);Isakoff, S.J., Cancer Research65,10992-11000
(2005)；Bader, A.G., Proceedings of the National Academy of Sciencesl03，1475-1479
(2006)；Horn, S.et al.，0ncogene27,4096-4106 (2008))。
[0005]人癌癥的遺傳工程化小鼠模型(GEMM)充當(dāng)重要資源，用于了解腫瘤啟動和進(jìn)展(ffalrath, J.C., Hawes, J.J., Van Dyke, Τ.& Reilly, K.Μ., Genetically engineered mousemodels in cancer research.Adv Cancer Resl06,113-64 (2010))。GEMM 還已經(jīng)用于測試治療劑及開發(fā)治療策略(Singh, M.et al., Assessing therapeutic responses in Krasmutant cancers using genetically engineered mouse models.Nat Biotechnol28, 585—93(2010))。致力于了解突變型PIK3CA所致致癌性轉(zhuǎn)化的研究主要使用基于細(xì)胞的系統(tǒng)，異種移植物模型和轉(zhuǎn)基因模型(Samuels et al.，見上文；Isakoff，見上文；Bader，A.G.，見上文；Horn, S.et al.，見上文；Engelman, J.A.et al., Nat Medl4,1351_6(2008);Adams，J.R.etal., Cancer Research71, 2706-2717 (2011)；Meyer,D.S.et al., Cancer Research (2011 ))。鑒于PIK3CA突變的較高頻率和一直以來開發(fā)小分子抑制劑的努力，能自其天然啟動子和基因組架構(gòu)表達(dá)內(nèi)源水平的突變型PIK3CA敲入小鼠模型將會是研究腫瘤啟動，進(jìn)展和治療的有價值工具。還有，此類模型自身將會適于鑒定在腫瘤發(fā)生期間與突變型PIK3CA合作的損傷。
[0006]想著這一點，我們制備了遺傳工程化小鼠模型，其中通過放置一休眠拷貝編碼H1047R的致癌性突變型PIK3CA外顯子20，與編碼外顯子20的野生型相鄰，我們修飾了內(nèi)源PIK3CA等位基因。在激活休眠突變型等位基因之前，工程化小鼠表達(dá)經(jīng)修飾野生型PIK3CA (PIK3CAWwt)。然而，在Cre介導(dǎo)的重組之后，突變型PIK3CA H1047R等位基因PIK3CAe2_4?被激活，導(dǎo)致其表達(dá)。我們顯示了 PIK3CA H1047R等位基因在小鼠乳腺上皮中的條件性激活導(dǎo)致突變型PIK3CA H1047R表達(dá)和腫瘤發(fā)生。
[0007]雖然下一代測序能夠隨著人腫瘤發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行人腫瘤的堿基對水平表征(Shah, S.P.et al., Nature461,809-813 (2009) ；Ding, L.et al., Nature464,999-1005(2010))，癌癥的小鼠模型提供確定的實驗易處理系統(tǒng)，其容許隨著腫瘤發(fā)生進(jìn)行系統(tǒng)性采樣和腫瘤表征。
[0008]在序列水平表征腫瘤的一項努力中，我們實施了腫瘤全外顯子組捕捉和測序，并鑒定出自發(fā)性功能喪失性TP53突變的出現(xiàn)，其作為涉及紡錘細(xì)胞腫瘤形成的潛在合作事件。本發(fā)明還涉及來自這種模型的乳腺腫瘤中別的體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)異常的鑒定。在分子表征之外，還對PI3K小分子抑制劑的能力測試了功效，而且結(jié)果顯示腫瘤響應(yīng)抑制劑治療。
[0009]發(fā)明概述
[0010]一方面，本發(fā)明涉及一種非人轉(zhuǎn)基因動物，其包含經(jīng)修飾內(nèi)源PIK3CA基因座，其中所述經(jīng)修飾內(nèi)源PIK3CA基因座包含與野生型外顯子20相鄰的編碼H1047R的休眠突變型PIK3CA外顯子20，且其中 所述非人轉(zhuǎn)基因動物能夠進(jìn)行PIK3CA H1047R (PIK3CAe20H1047E)突變型等位基因的條件性表達(dá)。
[0011]在一個實施方案中，所述突變型等位基因處于PIK3CA內(nèi)源啟動子控制之下。
[0012]在另一個實施方案中，條件性表達(dá)是由突變型等位基因通過Cre介導(dǎo)的重組的激活觸發(fā)的。
[0013]在還有另一個實施方案中，條件性激活是組織特異性的。
[0014]在又一個實施方案中，條件性激活導(dǎo)致突變型PIK3CAH1047R表達(dá)和腫瘤發(fā)生。
[0015]在所有實施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動物可以是例如嚙齒類動物，諸如小鼠或大鼠。
[0016]另一方面，本發(fā)明涉及一種荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物，其條件性表達(dá)PIK3CAH1047R(PIK3CAe20H1047E)突變型等位基因處于PIK3CA內(nèi)源啟動子控制之下。
[0017]在一個實施方案中，所述動物以組織特異性方式表達(dá)PIK3CA H1047R突變型等位基因。
[0018]在另一個實施方案中，所述PIK3CA H1047R突變型等位基因在所述動物的乳腺中表達(dá)且所述腫瘤是乳腺腫瘤。
[0019]在還有另一個實施方案中，所述荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物對于PIK3CAH1047R突變型等位基因是雜合的。
[0020]在另一個實施方案中，所述荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物對于PIK3CA H1047R突變型等位基因是純合的。
[0021]在又一個實施方案中，所述乳腺腫瘤選自下組:纖維腺癌，腺癌和紡錘細(xì)胞瘤形成。
[0022]在還有又一個實施方案中，所述荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物為嚙齒類動物,諸如小鼠或大鼠。
[0023]又一方面，本發(fā)明涉及一種用于生成上文所述轉(zhuǎn)基因動物的方法，其包括放置一拷貝編碼H1047R突變的外顯子20，與編碼野生型PIK3CA等位基因的外顯子20相鄰。
[0024]在一個實施方案中，編碼野生型PIK3CA等位基因的外顯子20側(cè)翼為IexP位點，接著是轉(zhuǎn)錄終止盒和一拷貝編碼H1047R突變的PIK3CA外顯子20。
[0025]又一方面，本發(fā)明涉及一種對受試者篩選腫瘤存在情況的方法，該方法包括對自所述受試者獲得的生物學(xué)樣品測試PIK3CA H1047R等位基因的存在情況或相應(yīng)基因產(chǎn)物。
[0026]在一個實施方案中，所述腫瘤選自下組:纖維腺癌，腺癌和紡錘細(xì)胞瘤形成。
[0027]在另一個實施方案中，所述腫瘤選自下組:乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸直腸癌，胃癌，肺癌，肝細(xì)胞癌，甲狀腺癌，子宮內(nèi)膜癌，白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。
[0028]在還有另一個實施方案中，所述腫瘤為乳腺癌。
[0029]在又一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對所述樣品測試次要體細(xì)胞突變的存在情況或拷貝數(shù)改變，其中所述次要體細(xì)胞突變可以例如在TP53基因中，諸如R248H TP53突變。在其它實施方案中，所述次要體細(xì)胞突變可以在Plkl，Tssk2和/或SMGl基因中。
[0030]另一方面，本發(fā)明涉及一種篩選用于治療腫瘤的藥物候選物的方法，其包括(a)將藥物候選物施用于權(quán)利要求1的荷瘤非人動物，并(b)測量所述腫瘤對所述治療的響應(yīng)。
[0031]在一個實施方案中，步驟(b)包括評估所述藥物候選物引起至少一種選自下組的響應(yīng)的能力:減少腫瘤細(xì)胞數(shù)目，縮小腫瘤尺寸或腫瘤負(fù)荷，抑制腫瘤細(xì)胞浸潤入周圍器官，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，和抑制腫瘤生長。
[0032]在另一個實施方案中，所述腫瘤選自下組:纖維腺癌，腺癌和紡錘細(xì)胞瘤形成。
[0033]在還有另一個實施方案中，所述腫瘤選自下組:乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸直腸癌，胃癌，肺癌，肝細(xì)胞癌，甲狀腺癌，子宮內(nèi)膜癌，白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。
[0034]在又一個實施方案中，所述腫瘤為乳腺癌。
[0035]一不同方面，本發(fā)明涉及一種鑒定用于治療藥物抗性癌癥的抗癌劑的方法，其包括(a)將藥 物候選物施用于權(quán)利要求1的荷瘤非人動物，(b)測量所述腫瘤對所述治療的響應(yīng)，并(C)若所述腫瘤對所述治療展現(xiàn)正面響應(yīng)，則將所述藥物候選物鑒定為用于治療藥物抗性癌癥的抗癌劑。
[0036]在一個實施方案中，所述正面響應(yīng)選自下組:減少腫瘤細(xì)胞數(shù)目，縮小腫瘤尺寸或腫瘤負(fù)荷，抑制腫瘤細(xì)胞浸潤入周圍器官，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，和抑制腫瘤生長。
[0037]在另一個實施方案中，所述腫瘤選自下組:乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸直腸癌，胃癌，肺癌，肝細(xì)胞癌，甲狀腺癌，子宮內(nèi)膜癌，白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。
[0038]在一個具體實施方案中，所述腫瘤為乳腺癌。
[0039]附圖簡述
[0040]圖1。PIK3CAe2°H1°4?可條件性激活敲入等位基因的生成。a_d.顯示(a)編碼PIK3CA基因座的基因組基因座，(b)打靶構(gòu)建物，(c)靶定等位基因，Cd) ES中消除新霉素盒后的靶定基因座和(e)Cre介導(dǎo)的激活后的PIK3CAe2°H1°47K等位基因。f-g.通過使用5’探針(f)和3’探針(g)進(jìn)行的Southern印跡來鑒定恰當(dāng)祀定的敲入(ki)和野生型(wt)等位基因。h-1.Cre介導(dǎo)的激活后自PIK3CAe2°H1°47K/+乳腺(h)和腎(i)獲得的cDNA的Sanger測序確認(rèn)突變型等位基因在乳腺中的表達(dá)。
[0041]圖2。PIK3CAe2_47M、鼠發(fā)生乳腺腫瘤。a_b.在腹部乳腺(a)和胸部乳腺(b)中攜帶腫瘤的小鼠。白色箭頭指向腫瘤的位置。c.描繪MMTV-Cre介導(dǎo)的潛伏？11(30￥2°"^等位基因激活后兩個獨立PIK3CA~系的無腫瘤存活的Kaplan-Meier圖。圖中只顯示在終點時攜帶乳腺腫瘤的動物(~2500mm3 ;在研究中觀察到86.4%的I系和84.2%的2系piK3CAe20Hi047E/+雌性小鼠發(fā)生了腫瘤)。兩個對照組(MMTV_Cre小鼠和PmCAMniwt)在研究
期間沒有腫瘤。d-g.PIK3CAe20H1047E乳腺腫瘤的組織學(xué)。H&E染色的腫瘤切片的分析顯示存在多種組織學(xué)類型，包括纖維腺癌(d)，腺鱗癌(e)，腺癌(f)和紡錘細(xì)胞腫瘤(g)。h.代表各組織學(xué)類型的PIK3CA?4?乳腺腫瘤的Western印跡顯示與對照乳腺(1_2道)相比，所有腫瘤類型中升高的PAKT水平(3-10道)和pS6。腫瘤9，10衍生自原代紡錘腫瘤在SCID小鼠乳房脂肪墊中傳代。
[0042]圖3。PIK3CAe2°H1°47K乳腺腫瘤的免疫熒光染色。a-ρ.纖維腺癌(a_d)，腺癌(e_h和1-1)和紡錘細(xì)胞腫瘤(m-p)用H&E (a，e，l和m)，抗CK18和抗CK5 (b，f和j )，抗ER α(c，g和k)，抗Era和抗PR (0)，抗PR (d，h和1)，和抗CK18和抗波形蛋白(n，p)抗體染色的連續(xù)切片。(P)中的切片是自第三次傳代紡錘細(xì)胞腫瘤外植體獲得的。
[0043]圖4。PIK3CAe2°H1°47K驅(qū)動乳腺腫瘤的表達(dá)概況和基因組異常。a.使用所示基因集合的表達(dá)水平，通過組織學(xué)不同乳腺腫瘤類型的分級聚簇衍生的熱圖。不同組織學(xué)類型的乳腺腫瘤顯示不同表達(dá)概況。樣品描繪為紡錘細(xì)胞腫瘤(1-4 ;2-4是自I衍生的連續(xù)傳代)，對照乳腺(Mg) (5-10)，纖維腺癌(11-15)和腺癌(16-20)。腫瘤樣品17和18衍生自腫瘤16的連續(xù)傳代。類似地，腫瘤樣品18衍生自腫瘤11傳代。對照乳腺樣品6，9和10是來自分別攜帶腫瘤12，13和1 4的動物的匹配樣品。b.全外顯子組測序鑒定出紡錘細(xì)胞腫瘤中的自發(fā)性TP53突變。顯示基因組區(qū)域，TP53外顯子(突變以紅色顯示)，來自感興趣區(qū)域的讀數(shù)(以實線描繪，突變位置以紅色點顯示)和TP53的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)上的突變。PR，富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域；Reg,羧基末端調(diào)節(jié)域；TA,反式激活域；Tet,四聚化結(jié)合域。c.CGH分析揭示紡錘細(xì)胞腫瘤中NF-1的喪失。
[0044]圖5。PI3K抑制劑的體內(nèi)抗腫瘤活性。a.作為異種移植物生長的PIK3CAe2(IH1°4?乳腺腫瘤外植體響應(yīng)GDC-0941治療。圖上顯示每種治療劑量(所有劑量n=9)相對于對照(n=9)的百分比腫瘤生長抑制。b.來自用⑶C-0941治療的動物的腫瘤顯示PI3K途徑抑制的證據(jù)。
[0045]圖6。表達(dá)PIK3CAe2°_?/+的乳腺顯示過度側(cè)分支和存在腫瘤小結(jié)。來自12周(a，b)和 50 周(c，d，e，和 f)齡 MMTV-Cre (a, c 和 e)或 PIK3CAe2_47K/+ (b，d 和 f)小鼠的腹部乳腺的Carmine明帆染色的全封固(a_d)或H&E染色的切片(e, f )。
[0046]圖7。經(jīng)產(chǎn)和未產(chǎn)分組的無腫瘤存活。經(jīng)產(chǎn)(465天)和未產(chǎn)(492天)中的中值無腫瘤存活的Kaplan-Meier分析具有統(tǒng)計學(xué)差異(時序檢驗p值=0.0002)。圖中只顯示在終點時攜帶乳腺腫瘤動物。
[0047]圖8。來自 PIK3CAe2Ctawt (a，c)或 PIK3CAe2_47K/+ (b，d)的精囊(a，b)和唾液腺(c，d)的組織學(xué)。
[0048]圖9。原代和傳代腫瘤的組織學(xué)比較。a_f.(a)中的纖維腺癌在傳代時產(chǎn)生(b)中所示紡錘細(xì)胞腫瘤。類似地，(C)中的纖維腺癌在傳代時產(chǎn)生(d)中所示腺癌。然而，紡錘細(xì)胞腫瘤(e)在傳代時維持其具有侵入性特征的紡錘細(xì)胞組織學(xué)(f)。
[0049]圖10。原代腫瘤和傳代腫瘤中按腫瘤類型分的預(yù)測體細(xì)胞突變的熱圖呈現(xiàn)。顯示通過 SIFT (Ng, P.C.& Henikoff, S.，Genome Resl2，436-46 (2002))預(yù)測的，突變對基因功能的影響，有害，耐受:，和未記錄(未稱為影響)。1，2和3是二份不同纖維腺癌，4_6是腺癌。5和6是自兩份獨立腫瘤4外植體在小鼠中傳代衍生的腫瘤。7-10是紡錘細(xì)胞腫瘤。腫瘤7外植體在小鼠中連續(xù)傳代，衍生腫瘤8，9和10。
[0050]圖11。以所示劑量用PI3K抑制劑治療的荷瘤小鼠的進(jìn)展前時間的Kaplan-Meier分析。
[0051]圖12。打靶模板載體。該載體工程化改造為提供用于進(jìn)行克隆的獨特限制酶位點和生成打靶載體需要的其它元件。 [0052]圖13。自PIKSCAwW+xPIKSCAe20?"+雜交獲得的后代的基因型。
[0053]圖14。用于基因組分析的樣品。
[0054]表1。腫瘤中的預(yù)測體細(xì)胞突變。
[0055]發(fā)明詳述
[0056]1.定義
[0057]除非另有定義，本文中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解相同的含義。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and MolecularBiology2nd ed.，J.ffiley&Sons (New York, N.Y.1994)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到可以使用與本文所述方法和材料相似或等同的許多方法和材料來實施本發(fā)明。確實，本發(fā)明絕非限于記載的方法和材料。為了本發(fā)明，下文定義了下述術(shù)語。
[0058]如本文中使用的，術(shù)語“等位基因”、“等位變體”、或“等位變異”可互換使用，指占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或更多種可選形式任一。等位變異經(jīng)由突變天然發(fā)生，而且可導(dǎo)致群體內(nèi)的表型多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(編碼的多肽沒有變化)，或是可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“等位變體”在本文中還用于表示由基因的等位變體編碼的蛋白質(zhì)。典型地，基因的參照形式編碼來自物種的單個參照成員或群體的多肽的野生型和/或優(yōu)勢型。典型地，等位變體(其包括種間變體)通常具有與來自同一物種的野生型和/或優(yōu)勢型的至少80%、90%或更大氨基酸同一性；同一性的程度取決于基因及比較是種間還是種內(nèi)的。一般地，種內(nèi)等位變體具有與野生型和/或優(yōu)勢型的至少約80%、85%、90%或95%同一性或更大，包括與多肽的野生型和/或優(yōu)勢型的96%、97%、98%、99%或更大同一'I"生。
[0059]當(dāng)受試者具有一種基因的兩個相同等位基因時，就說該受試者對于該基因或等位基因是純合的。當(dāng)受試者具有一種基因的兩個不同等位基因時，就說該受試者對于該基因是雜合的。特定基因的等位基因可以彼此相差單個核苷酸或數(shù)個核苷酸，而且可以包括核苷酸替代、刪除和插入?；虻牡任换蛞部梢允腔蚝型蛔兊男问?。
[0060]如本文中使用的，表述“條件性表達(dá)”意圖指基因在條件達(dá)到時轉(zhuǎn)錄，而基因在條件未達(dá)到時不轉(zhuǎn)錄。條件性表達(dá)可以由細(xì)胞天然實現(xiàn)或?qū)嵤?即沒有人為干預(yù))，或者可以人為實現(xiàn)或?qū)嵤?即有人為干預(yù)的參與，諸如例如但不限于使用化學(xué)試劑來調(diào)節(jié)的區(qū)域或啟動子的使用，等等)。條件性表達(dá)可以例如通過由位點特異性重組酶觸發(fā)的重組事件(其導(dǎo)致休眠基因的激活)(諸如由Cre介導(dǎo)的重組)來啟動。
[0061]術(shù)語“核酸”指多核苷酸諸如脫氧核糖核酸(DNA)和適當(dāng)時的核糖核酸(RNA)。作為等同物，該術(shù)語還包括自核苷酸類似物生成的DNA或RNA類似物及適用時的單鏈(有義鏈或反義鏈)和雙鏈多核苷酸?！胺蛛x的”核酸分子指如下的核酸分子，其自/與在該核酸的天然來源中通常與之有關(guān)的至少一種污染性核酸分子鑒定和分開。分離的核酸分子在形式和背景方面不同于在自然界中找到它時。因此，分離的核酸分子有別于存在于天然細(xì)胞中時的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞中含有的核酸分子，其中例如該核酸分子處于與天然細(xì)胞的染色體位置不同的染色體位置。
[0062]如本文中使用的，術(shù)語“載體”指能夠運輸與其連接的另一核酸的核酸分子。術(shù)語“表達(dá)載體”包括能夠合成由載體攜帶的相應(yīng)重組基因編碼的主題蛋白質(zhì)的質(zhì)粒、粘?；蚴删w。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與它們連接的核酸的載體。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用，因為質(zhì)粒是載體的最常用形式。
[0063]如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”和“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”可互換使用，指可操作連接的編碼序列在特定宿主生物體中表達(dá)所必需的核酸，例如DNA序列。例如，適合于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點。已知真核細(xì)胞利用啟動子、增強(qiáng)子、剪接信號和聚腺苷酸化信號。這些術(shù)語意圖涵蓋所有促進(jìn)或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的元件，包括啟動子、RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的基本相互作用所需要的核心元件、上游元件、增強(qiáng)子、和應(yīng)答兀件(Lewin, 〃Genes V〃 (Oxford University Press, Oxford)第 847-873 頁)。本文中提到一種基因或一類基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件包括該基因或該組基因的天然存在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和經(jīng)修飾形式的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的所有或完整區(qū)域二者。此類經(jīng)修飾形式包括元件的重排、一些元件或外來序列的刪除、及異源元件的插入。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的模塊化性質(zhì)和一些調(diào)節(jié)元件(諸如增強(qiáng)子)的功能的位置依賴性的缺失使得此類修飾成為可能。眾多技術(shù)可用于解剖基因的調(diào)節(jié)元件以確定它們的位置和功能。此類信息可用于指導(dǎo)元件的修飾，若想要的話。然而，優(yōu)選的是，使用基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的完整區(qū)域。
[0064]若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是“可操作連接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)(secretory leader)的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，“可操作連接的”意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強(qiáng)子不必相鄰。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)。若沒有此類位點，則依照常規(guī)實踐使用合成的寡核昔Ife銜接頭或接頭。
[0065]術(shù)語“轉(zhuǎn)染”指通過核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將核酸(例如表達(dá)載體)導(dǎo)入受體細(xì)胞。如本文中使用的，“轉(zhuǎn)化”指如下的過程，其中細(xì)胞的基因型因細(xì)胞攝取外源DNA或RNA而改變，且經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)期望異源蛋白。
[0066]如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指如下的核酸序列，即它對于它導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因動物或細(xì)胞是部分或完全異源的(即外來的)，或?qū)τ谒鼘?dǎo)入的轉(zhuǎn)基因動物或細(xì)胞的內(nèi)源基因是同源的，以使得改變它插入的細(xì)胞的基因組(例如將它插入與天然基因的位置不同的位置或它的插入導(dǎo)致敲除)的方式插入或設(shè)計插入動物的基因組。轉(zhuǎn)基因可以可操作連接至一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和選定核酸的最佳表達(dá)可能必需的任何其它核酸(諸如內(nèi)含子)。
[0067]因而，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物”指包括轉(zhuǎn)基因和(任選的)諸如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列、聚腺苷酸化位點、復(fù)制起點、標(biāo)志基因、等其它核酸序列的核酸，其可用于將轉(zhuǎn)基因插入宿主生物體的基因組的一般操作。
[0068]術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”在本文中作為形容詞用于描述例如動物或構(gòu)建物包含轉(zhuǎn)基因的特性。例如，如本文中使用的，“轉(zhuǎn)基因生物體”指任何動物，優(yōu)選非人哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒類動物，其中動物的一個或多個細(xì)胞含有通過人為干預(yù)引入的異源核酸，諸如例如通過本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。通過精細(xì)遺傳操作，諸如通過顯微注射或通過重組病毒感染，直接地或間接地通過導(dǎo)入細(xì)胞前體將核酸導(dǎo)入細(xì)胞。術(shù)語“遺傳操作”不包括經(jīng)典的雜交育種或體外受精，而是指向引入重組DNA分子。此分子可以在染色體內(nèi)整合，或者它可以是染色體外復(fù)制DNA。
[0069]“敲除”基因表示導(dǎo)致靶基因的功能降低的基因序列改變，優(yōu)選使得靶基因表達(dá)檢測不到或不顯著。轉(zhuǎn)基因敲除動物可包含靶基因的雜合敲除或靶基因的純合敲除。如本文中使用的，“敲除”還包括條件性敲除，其中在例如將動物暴露于促進(jìn)靶基因改變的底物、弓丨入促進(jìn)靶基因位點處的重組的酶(例如Cre-1ox系統(tǒng)中的Cre)、或用于出生后指導(dǎo)靶基因改變的其它方法時，可發(fā)生靶基因的改變。
[0070]“敲入”指將轉(zhuǎn)基因靶向插入宿主細(xì)胞基因組，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或內(nèi)源靶基因改變的表達(dá)(例如升高的(包括異位的)或降低的表達(dá))，例如通過引入額外拷貝的靶基因或通過操作性插入提供內(nèi)源拷貝的靶基因增強(qiáng)的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。“敲入”轉(zhuǎn)基因可包含轉(zhuǎn)基因的雜合敲入或轉(zhuǎn)基因的純化敲入?！扒萌搿边€涵蓋條件性敲入，其中例如將動物暴露于促進(jìn)此類表達(dá)的物質(zhì)、通 過引入促進(jìn)靶向插入位點處的重組的酶(例如Cre-1ox系統(tǒng)中的Cre)、或通過用于改變靶向插入位點的一些其它方法，可發(fā)生轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或內(nèi)源靶基因改變的表達(dá)。
[0071]“純化”狀態(tài)表示相同等位基因駐留于同源染色體上的相應(yīng)基因座時存在的遺傳條件。相反，“雜合”狀態(tài)表示不同等位基因駐留于同源染色體上的相應(yīng)基因座時存在的遺傳狀態(tài)。
[0072]“位點特異性重組酶”指在一些病毒和細(xì)菌中存在且表征為具有內(nèi)切核酸酶和連接酶二者特性的酶。位點特異性重組酶催化至少下述四種事件:(a)刪除側(cè)翼為相同取向(例如頭對尾或尾對頭)的“相容位點特異性重組酶靶向位點”(SSRTS)的DNA片段；(b)顛倒側(cè)翼為相反取向(例如頭對頭或尾對尾)的相容SSRTS的DNA片段；(c)將含有SSRTS的環(huán)狀DNA片段整合入相容SSRTSjP (d)位于不同染色體的相容SSRTS之間的染色體易位。為了實施這些反應(yīng)，位點特異性重組酶通常具有至少下述四種活性:(I)識別一種或兩種特定DNA序列；⑵切割所述DNA序列；(3)涉及鏈交換的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性；和(4)重新密封經(jīng)過切割的DNA鏈的DNA連接酶活性(Sauer，B.，Cur.0pin.Biotech.5:521-527，1994)。
[0073]術(shù)語“重組酶”或“位點特異性重組酶”指進(jìn)行位點特異性重組(SSR)以改變DNA結(jié)構(gòu)的酶。這種定義包括轉(zhuǎn)座酶、拉姆達(dá)(λ)整合/切除酶、和位點特異性重組酶。重組酶的公知例子包括但不限于Cre-lox、FLP/FRT、R/RS、Gin/gix、pSRl系統(tǒng)、cer系統(tǒng)、和fim系統(tǒng)(例如 N.L.Craig, Annu.Rev.Genet.22:17,1988 ； Odell et al.，Homologous Re comb.Gene Silencing Plants，1994，pp.219—270，Paszkowski, Jerzy, ed.Kluwer:Dordrecht,Germany)。另外，已經(jīng)在微生物中鑒定了 SSR系統(tǒng)，諸如噬菌體、細(xì)菌(例如大腸桿菌)、酵母等等。這包括用于整合和切除的大腸桿菌λ att P系統(tǒng)(Zubko et al., NatureBiotechnologyl8:442, 2000)和鏈霉素曬菌體 C31 整合酶(Groth et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:5995，2000)。在將來自這些微生物的SSR系統(tǒng)引入與衍生這種系統(tǒng)的生物體不同的生物體(包括植物)時，它的表現(xiàn)方式與在初始生物體中相同。
[0074]“重組酶位點”或“位點特異性重組序列”表示會受到重組酶識別，從而推動重組事件的DNA序列。會領(lǐng)會，這可以是野生型或突變型重組酶位點，只要功能性得到維持且重組酶仍可識別該位點，結(jié)合DNA序列，并催化兩個相鄰重組酶位點之間的重組。
[0075]術(shù)語“l(fā)ox側(cè)翼”指遺傳元件或其部分側(cè)翼為串聯(lián)位點特異性序列。位點特異性序列可以彼此以相同方向(即同向重復(fù))(使得DNA元件在SSR時切除)或以相反方向(使得DNA元件在SSR時顛倒)取向。1x側(cè)翼元件可以是單一啟動子、轉(zhuǎn)錄“終止”阻斷元件、可操作連接靶序列的啟動子、或這些和其它遺傳元件的組合。
[0076]“位點特異性重組底物”或“SSR底物”指如下的任何DNA，它是SSR的底物，SSR源自位點特異性重組酶對重組酶位點的作用。該術(shù)語包括1x側(cè)翼DNA元件，即那些側(cè)翼為重組酶位點的DNA元件。
[0077]術(shù)語“建立者系”和“建立者動物”指如下的那些動物，它們是添加有轉(zhuǎn)基因的胚胎的成熟產(chǎn)物，即那些自插入有DNA并植入一個或多個代孕宿主的胚胎生長起來的動物。
[0078]術(shù)語“后代”和“轉(zhuǎn)基因動物的后代”指最初轉(zhuǎn)化的哺乳動物之后的每一代的任何和所有后裔。
[0079]術(shù)語“哺乳動物”指哺乳綱的所有成員，包括人、高等靈長類動物、家畜和牲畜諸如家兔、豬、綿羊、山羊、牛、及動物園、運動、或?qū)櫸飫游铩⒓皣X類動物諸如小鼠和大鼠。
[0080] 術(shù)語“非人哺乳動物”指哺乳綱除人以外的所有成員。
[0081]在用于本文時，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，而且所有這類名稱都包括后代。如此，詞語“轉(zhuǎn)化子/轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞及由其衍生的培養(yǎng)物，不管轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)理解，由于有意的或無意的突變，所有后代可能在DNA內(nèi)容上不是精確相同的。在最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的突變后代包括在內(nèi)。若想做出不同的命名，上下文會有清楚的表述。
[0082]如本文中使用的，“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細(xì)胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細(xì)胞和組織。
[0083]術(shù)語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征通常為細(xì)胞生長不受調(diào)節(jié)的生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗狀癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、以及頭和頸癌。
[0084]如本文中使用的，術(shù)語“細(xì)胞毒劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如At211、Im、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體。
[0085] “化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?，諸如噻替哌(thiotepa)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide) (CYTOXAN? );院基磺酸酯類，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa);乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietyIenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bul Iatacin)和布拉他辛酮(bul Iatacinone) ) ； δ -9-四氫大麻酷(曲大麻酷(dronabinol)， MARINOL# )； β -拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol);秋水仙素類(colchicine)；白禪脂酸(betulinic acid);喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物拓?fù)涮婵?topotecan) ( HYCAMTIN? ), CPT-1l (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR? )、乙酰喜樹堿、東莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinic acid);替尼泊苷(teniposide);隱藻素類(cryptophycin)(特別是隱藻素I和隱藻素8);多拉司他丁(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物KW-2189和 CBl-TMl);艾植塞洛素(eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ;海綿抑素(spongistatin);氮芥類，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾酉享(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼卩定氮芥(uracil mustard);硝基服類，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(1mustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類(enediyne)抗生素(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y II 和加利車霉素 ω-- (參見例如 Agnewj Chem.1ntl.Ed.Engl.33:183-186(1994))；蒽環(huán)類(dynemicin)抗生素，包括dynemicin A ;埃斯波霉素(esperamicin);以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomy sin)、方文線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C (cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、方文線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCiN嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射劑(DOXIL? ),脂質(zhì)體多柔比星TLC D-99 ( MYOCET⑩)、PEG化脂質(zhì)體多柔比星(CAELYX⑩)和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcel1mycin)、絲裂霉素(mitomycin)諸如絲裂霉素C、霉酷酸(mycophenolicacid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培來霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；
抗代謝物類，諸如甲氨喋呤、吉西他濱(gemdtabine) ( GEMZAR? ).替加氟(tegafur) ( UFTORAL⑩)、卡培他濱(eapecitobine) ( XELODA? )、epothilone 和
5-氟尿啼唳(5-FU);葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨噪呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate) ; 票呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、
6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿卩定(doxifIuridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(tri1stane);葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼P定(eniluracil);氛苯口丫 P定(amsacrine) ；bestrabucil ; t匕生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate) ；defofamine ;地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine);醋酸輕吡咔唑(elliptinium acetate);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；輕脲；香燕多糖(Ientinan);氯尼達(dá)明(1nidamine);美登木素生物堿類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安絲菌素(ansamitoci n);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽酉昆(mitoxantrone);莫哌達(dá)醇(mopidamol) ； 二胺硝口丫 P定(nitracrine);噴司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(1soxantrone) ;2_乙基酰肼；丙卡巴月井(procarbazine) ； PSfC為多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone) ;2，2’，2’ ’ -三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine));烏拉坦(urethan);達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine) ;二溴甘露醇(mitobronitol) ;二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴焼(pipobroman) ；gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside) (“Ara_C”)；噻替
哌；類紫杉醇(taxoid)，例如帕利他賽(paditaxel) (ΤΑΧΟΙΛ I紫杉醇的清蛋白改
造納米顆粒劑型(ABRAXANECg))和多西他賽(doxetaxel) (TAXOTERE?);
苯丁酸氮芥(chloranbucil) ;6_硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉬劑，諸如順鉬、奧沙利鉬(oxaliplatin)和卡鉬；阻止微管蛋白聚合形成微管的長春花生物堿
類(vincas)，包括長春堿(vinblastine) (VELBAN(R))、 長春新堿(vincristine)(ONCOV:TN?)、長春地辛(vindesine) (ELDISINE?，F(xiàn)ILDESIN?)和長春瑞賓(vinoreibine) (NAVELBTNE?);依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異
磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);亞葉酸(Ieucovovin);諾安托(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);柔紅霉素(daunomycin);氨基蝶呤；伊拜膦酸鹽(ibandronate);拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000 ; 二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類
維A酸，諸如視黃酸，包括貝沙羅汀(bexan；nene)( TARGRETIN? ); 二碳磷酸
鹽類(bisphosphonate),諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如 BONEFOSO? 或OSTAOK))、etidronate ( DIDROCAL? )、NE-58095、唑來膦酸(zoledronicacid)/唑來膦酸鹽/酯(ZOlediOi1Hte) (ZOMETA^)4阿侖膦酸鹽/酯
(alendronate) (FOSAMAX? )、pamidronate (AREMA?)、替魯膦酸鹽 / 酯
(tiludronate) ( SKELID? >或利塞膦酸鹽 / 酯(risedronate) ( ACTONEL?);曲沙
他濱(troxacitabine) (1，3_ 二氧戍環(huán)核苷胞喃唳類似物)；反義寡核苷酸,特別是那些抑制涉及粘著性細(xì)胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Ralf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE?疫苗和基因
療法疫苗，例如ALLOVFXTIN?疫苗、LEUVECTIN⑩疫苗和VAXID?疫苗；拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 抑制劑(如 LURTOTECAN? ); rmRH (ABARELIX? ); BAY439006(sorafenib; Bayer) ;SU_11248 (Pfizer);哌立福辛(perifosine), C0X-2 抑制劑(如塞來考昔(celecoxib)或艾 托考昔(etoricoxib)),蛋白體抑制劑(如PS341) ;bortezomib(VELCADE? ); CC1-779 ；tipifarnib (R11577) ；orafenib, ABT510 ;Bcl_2 抑制劑，諸
^noblimersen sodium ( GENASENSE? ); pixantrone ;EGFR 抑制劑(見下文定義);酪
氨酸激酶抑制劑(見下文定義)；及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述兩種或多種的組合，諸如CHOP (環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX (奧沙利鉬(EL0XATIN? )聯(lián)合5-FU和亞葉酸(Ieucovovin)的治療方案的縮寫)。
[0086]術(shù)語“前體藥物”在用于本申請時指與母藥(parent drug)相比對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降乃幱没钚晕镔|(zhì)的前體和衍生物形式。參見例如 Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy，，，Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382，615th Meeting Belfast (1986)和 Stella et al., “Prodrugs: AChemical Approach to Targeted Drug Delivery，，，Directed Drug Delivery, Borchardt etal., (ed.), pp.247-267，Humana Press (1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含β_內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)化為更具活性而無細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。
[0087]“脂質(zhì)體”指由各種類型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的，可用于對哺乳動物投遞藥物(諸如本文中所披露的抗ErbB2抗體和任選的化療劑)的小囊泡。脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層形式，與生物膜的脂質(zhì)排列相似。
[0088]“小分子”在本文中定義為具有約500道爾頓以下的分子量。
[0089]術(shù)語“抗體”在本文中以最廣義使用，明確覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性。
[0090]術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們可以在不受其它抗體污染的情況下合成。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，有待依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首次由Kohler etal.(1975) Nature256:495記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利N0.4，816，567)?！皢慰寺】贵w”也可以使用例如Clackson et al.(1991)Nature352:624-628 及 Marks et al.(1991) J.Mol.Biol.222:581-597 中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。
[0091]單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(參見美國專利N0.4，816，567;Morrisonet al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長類動物(例如舊大陸猴類(Old World Monkey)、猿等)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的“靈長類化”抗體。
[0092]“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0093]“完整”抗體指包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CJ和重鏈恒定區(qū)Ch1、Ch2和Ch3的抗體。恒定區(qū)可以是天然序列恒定區(qū)(例如人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。優(yōu)選的是，完整抗體具有一項或多項效應(yīng)物功能。
[0094]非人(例如嚙齒類動物)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見 Jones et al., Nature321:522-525 (1986) ; Riechmann etal., Nature332:323-329(1988);和 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
[0095]I1.詳細(xì)描沭
[0096]癌癥的條件性PIKSCAhimzs非人動物模型的生成
[0097]如上文討論的，IA類PI3K催化亞基pllO α，ρ110β和ρΙΙΟ?作為與ρ85 α，ρ55α，ρ50α，ρ85β或ρ55Y調(diào)節(jié)亞基復(fù)合的專性異二聚體存在。在正常細(xì)胞中，ΡΙ3Κ維持于基礎(chǔ)無活性狀態(tài)且在生長因子刺激和細(xì)胞表面受體參與后變成有活性。活化的ΡΙ3Κ磷酸化并轉(zhuǎn)化磷脂酰肌醇4，5 二磷酸酯(ΡΙΡ2)，產(chǎn)生磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸酯(ΡΙΡ3)。升高的細(xì)胞ΡΙΡ3水平促進(jìn)ΡΙ3Κ效應(yīng)器活化，其繼而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞生長，增殖和存活。
[0098]超過25%的人乳腺癌中發(fā)生編碼磷脂酰肌醇3-激酶(ΡΙ3Κ)催化亞基pllO α的PIK3CA中的致癌性突變。還已經(jīng)在其它類型的人癌癥中報告了 PIK3CA基因中的頻繁突變，諸如卵巢癌，結(jié)腸直腸癌，胃癌，肺癌，肝細(xì)胞癌，甲狀腺癌和子宮內(nèi)膜癌，急性白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。
[0099]本發(fā)明至少部分基于乳腺癌的敲入小鼠模型的開發(fā)，其中內(nèi)源PIK3CA等位基因經(jīng)過修飾而容許頻繁發(fā)現(xiàn)的PIK3CA H1047R (PIK3CAe2°H1°4?)突變型等位基因的組織特異性條件性表達(dá)。特別地，通過放置一休眠拷貝包括H1047R的致癌性突變型PIK3CA外顯子，與野生型編碼外顯子相鄰，修飾內(nèi)源PIK3CA等位基因。在休眠突變型等位基因激活之前，工程化小鼠表達(dá)經(jīng)修飾野生型PIK3CA (PIK3CAe2°mwt)。然而，在Cre介導(dǎo)的重組時，突變型PIK3CA H1047R等位基因(PIK3CAe2°H1°4?)被激活，導(dǎo)致其表達(dá)。本文中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示小鼠乳腺上皮中PIK3CA H1047R等位基因的條件性激活導(dǎo)致突變型PIK3CA H1047R表達(dá)和腫瘤發(fā)生。而且，在實施來自這種模型的紡錘細(xì)胞腫瘤的全外顯子組分析時，自發(fā)性功能喪失性TP53突變的出現(xiàn)被鑒定為涉及腫瘤形成的潛在合作事件。
[0100]發(fā)現(xiàn)潛伏PIK3CA H1047R等位基因的激活導(dǎo)致具有多種組織學(xué)類型的乳腺腫瘤。與PIK3CAe2°H1°4?的表達(dá)一致，所有腫瘤顯示PI3K途徑的激活。而且，PIK3CA H1047R驅(qū)動的乳腺腫瘤的全外顯子組分析鑒定出多種突變，包括已經(jīng)充分表征的在紡錘細(xì)胞型腫瘤發(fā)生期間自發(fā)出現(xiàn)的TP53熱點突變。在演示該模型在研究腫瘤發(fā)生期間次要突變出現(xiàn)中的效用之外，還使用這種小鼠模型測試處于臨床開發(fā)的PI3K-抑制劑⑶C-0941的功效，而且顯示腫瘤響應(yīng)PI3K抑制。因而，本文中開發(fā)的轉(zhuǎn)基因非人動物模型是研究腫瘤啟動，進(jìn)展和治療的有價值工具，而且自身還適于鑒定在腫瘤發(fā)生期間與突變型PIK3CA合作的損傷。特別地，本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物模型可用于篩選抗癌劑，而單獨或任意組合的pIK3CAe20H1047E和次要突變可用于癌癥的診斷，分類，預(yù)后，和治療，包括但不限于乳腺癌。
[0101] 在生成本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠時，使用Cre-1ox重組系統(tǒng)。Cre蛋白是一種位點特異性DNA重組酶，它能催化DNA分子中特定位點之間的DNA重組。這些位點(稱作1xP序列)含有Cre的特異性結(jié)合位點，它們圍繞定向核心序列，在那里可發(fā)生重組。當(dāng)在其基因組中具有1xP位點的細(xì)胞表達(dá)Cre時，1xP位點之間可發(fā)生重組事件。雙鏈DNA在兩個1xP位點處都受到Cre蛋白切割。然后用DNA連接酶重新接合鏈。重組的結(jié)果取決于1xP位點的取向。對于在相同染色體臂上的兩個1x位點,顛倒的1xP位點會引起插入,而同向重復(fù)的1xP位點會引起刪除事件。
[0102]雖然Cre-1ox重組系統(tǒng)最初是為了用于在哺乳動物細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因小鼠中激活基因表達(dá)而開發(fā)的，但是后來顯示Cre-1ox重組可用于在轉(zhuǎn)基因動物的多種選定細(xì)胞類型中高效刪除側(cè)翼為1xP的染色體DNA序列，而且Cre-1ox重組可用于體內(nèi)條件性基因打靶。另外，可使用其它定點重組系統(tǒng)(包括上文所列那些)來生成與本文中具體例示的小鼠模型相似的非人轉(zhuǎn)基因動物模型。
[0103]由于PIK3CA突變在乳腺癌中的重要性，測試了 PIK3CA H1047R等位基因在乳腺腫瘤發(fā)生中的作用，這通過將PIK3CAe2°mwt小鼠與MMTV-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠(其中在乳腺允許性MMTV LTR啟動子控制下表達(dá)Cre重組酶)交配來進(jìn)行。對于其它類型的腫瘤，可使用其它組織允許性或組織特異性啟動子。組織特異性啟動子(包括導(dǎo)致特定組織類型或器官，諸如肝，胰，腎，肝，肺，睪丸表達(dá)的調(diào)節(jié)元件)是本領(lǐng)域已知的且可得的，例如得自TiProD人啟動子序列數(shù)據(jù)庫，它們的一些功能特征是已知的。該數(shù)據(jù)庫容許用戶查詢個別啟動子和它們介導(dǎo)的表達(dá)樣式，及依照它們的組織特異性活性找出啟動子集合?？缮蒔IK3CA突變在其中發(fā)揮作用的其它癌癥類型的非人轉(zhuǎn)基因動物模型，例如通過使用本領(lǐng)域已知的適宜組織特異性啟動子之一。
[0104]可以通過任何合適方法對本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動物(包括它們的后代)篩選轉(zhuǎn)基因的存在和/或表達(dá)。篩選常常通過使用與至少部分轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)的探針進(jìn)行的自尾組織制備的DNA的Southern印跡或PCR來實現(xiàn)?？砷_發(fā)使用針對由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行的Western印跡分析或免疫組織化學(xué)，作為用于篩選轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在的替代或補(bǔ)充方法?；蛘?，使用Northern分析或RT-PCR對認(rèn)為以最高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因的組織或細(xì)胞測試轉(zhuǎn)基因的RNA表達(dá)。
[0105]用于評估轉(zhuǎn)基因存在情況的替代或補(bǔ)充方法包括但不限于合適的生物化學(xué)測定法，諸如酶和/或免疫學(xué)測定法，針對特定標(biāo)志物或酶活性的組織學(xué)染色劑，流式細(xì)胞術(shù)分析，等等。血液分析也可用于檢測血液中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在情況，以及在各種類型的血液細(xì)胞和其它血液組分的水平上評估轉(zhuǎn)基因的效果。
_6] 候選抗癌劑的篩選
[0107]本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物模型可用于對候選藥劑篩選抗癌活性。術(shù)語“抗癌活性”以最廣義使用，包括直接或間接介導(dǎo)預(yù)防，延遲，減緩或抑制腫瘤發(fā)生和/或生長方面的任何效果的活性，這可以給宿主提供有益效果。“抗癌活性”因此涵蓋但不限于直接或間接減少癌細(xì)胞數(shù)目，縮小腫瘤尺寸或腫瘤負(fù)荷，抑制(即一定程度地減緩和優(yōu)選終止)癌細(xì)胞浸潤入周圍器官，抑制(即一定程度地減緩和優(yōu)選終止)腫瘤轉(zhuǎn)移，一定程度地抑制腫瘤生長，和/或一定程度的減輕一種或多種與癌癥有關(guān)的癥狀的能力。
[0108]對可臨床用于治療癌癥的具有抗癌活性的藥劑特別感興趣。在本公開中特別感興趣的是鑒定可在治療特征為PIK3CA中的致癌性突變(特別是突變型PIK3CA H1047R等位基因或次要突變激活)的癌癥中提供臨床好處的具有抗癌活性的藥劑。
[0109]一般地，通過在非人轉(zhuǎn)基因動物模型中評估對癌癥表型的影響的存在或缺乏來評估抗癌活性，該對癌癥表型的影響指示候選藥劑的抗癌活性。如此，例如，施用候選藥劑后動物中的腫瘤負(fù)荷降低指示該藥劑具有抗癌活性。[0110]可使用本發(fā)明的非人動物模型篩選抗癌活性的候選抗癌劑包括但不限于合成的，天然存在的，或重組生成的分子，包括小分子，肽，抗體和其它多肽。
[0111]可以自極其多種來源獲得候選藥劑，包括合成或天然化合物的文庫。例如，眾多手段可用于隨機(jī)和定向合成極其多種有機(jī)化合物和生物分子，包括表達(dá)隨機(jī)化寡核苷酸和寡肽?；蛘撸?xì)菌，真菌，植物和動物提取物形式的天然化合物文庫是可得的或容易生成的。或者，經(jīng)由常規(guī)化學(xué)，物理和生物化學(xué)手段容易修飾天然的或合成生成的文庫和化合物，而且可用于生成組合文庫?？梢詫σ阎幚韺W(xué)藥劑進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，諸如?；?，烷化，酯化，酰胺化，等以生成結(jié)構(gòu)類似物。
[0112]可以以對于投遞藥劑而言期望和/或適宜的任何方式施用候選藥劑以檢查抗癌活性。例如，可以通過注射(例如通過靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，等等注射)，輸注，口服，或通過任何其它期望手段來施用候選藥劑。
[0113]篩選方法可涉及施用不同量的候選藥劑(從沒有藥劑到接近可成功投遞給動物的量上限的量的藥劑，例如在毒性極限內(nèi))，而且可以包括以不同配方和路徑投遞藥劑?？梢允┯脝我凰巹?，或者可以在兩種或更多種藥劑的組合中組合藥劑，尤其是藥劑組合的施用可導(dǎo)致協(xié)同效應(yīng)的情況。
[0114]可以通過將候選藥劑施用于轉(zhuǎn)基因動物，并評估對癌癥表型的調(diào)控來評估候選藥劑治療已有癌癥的能力?？梢岳缤ㄟ^評估對例如腫瘤負(fù)荷,腫瘤數(shù)目，腫瘤尺寸,腫瘤細(xì)胞的代謝活性，無進(jìn)展存活(PFS)，總體存活(0FS)，等等的影響的存在或缺乏來評估對癌癥表型的調(diào)控。
[0115]可以通過施用 候選藥劑，之后誘導(dǎo)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的突變來評估候選藥劑推動癌癥預(yù)防的能力。癌癥預(yù)防指相對于在沒有干預(yù)(例如不施用具有抗癌活性的藥劑)的情況下預(yù)期的癌癥發(fā)生率和/或嚴(yán)重性降低動物中的腫瘤發(fā)生率和/或嚴(yán)重性。
[0116]下面的非限制性實施例例示本發(fā)明的進(jìn)一步詳情。
實施例
[0117]可備件件激活的PIK3CAH1047R小鼠樽型
[0118]材料和方法
[0119]可條件性激活的PIK3CA H1047R小鼠的生成
[0120]我們使用一種打靶載體模板(圖1)來裝配最終的打靶載體。使用來自C57B/6NES細(xì)胞的小鼠基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增涵蓋PIK3CA外顯子18-19的2.045kb片段(左臂)，含有PIK3CA野生型外顯子20的588bp區(qū)域(中臂)，和也含有外顯子20和額外的3’內(nèi)含子序列的3.137kb基因組DNA (左臂)，并用于構(gòu)建載體。在克隆入模板打靶載體之前，使用標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)突變由左臂中外顯子20編碼的密碼子1047以編碼組氨酸(R1047H)。在將中臂克隆入打靶模板載體時，通過添加載體中存在的高PolyA信號來修飾野生型外顯子20區(qū)域。新霉素表達(dá)盒，4x轉(zhuǎn)錄終止盒(Jackson, E.L.et al., Genes Devl5, 3243-8(2001))也由載體提供。在最終的構(gòu)造中，新霉素盒側(cè)翼為‘frt’位點以推動其在ES細(xì)胞修飾后切除。還有，經(jīng)修飾野生型外顯子側(cè)翼為‘loxP’位點以推動其切除，這能激活突變型外顯子20 (圖1)。通過Sanger測序來檢驗打靶載體的準(zhǔn)確性。將打靶構(gòu)建物電穿孔入C57B/6N ES細(xì)胞，并選擇新霉素抗性。通過5’和3’ Southern印跡鑒定出恰當(dāng)靶定的ES克隆。當(dāng)AflII消化和Southern印跡后測試恰當(dāng)靶定的基因組DNA時，5’探針識別
6.6kb野生型片段和9.1kb片段。類似地，3’探針識別SacI消化后適當(dāng)修飾的基因組區(qū)域的6.9kb野生型片段和4.8kb片段(圖lc)。切除neo盒及使用PCR和測序確認(rèn)編碼PIK3CA的經(jīng)修飾基因組區(qū)域的架構(gòu)后，將ES克隆注射入胚泡以生成嵌合小鼠。與野生型小鼠中的201bp 片段不同，利用使用引物 20F (AGCCAGCAGACAATAATTCTTAGCACA) (SEQ ID NO:1)和 20R(CAGTGCTTGAACATTGGAGGTCAGT) (SEQ ID NO: 2)生成的 290bpPCR 產(chǎn)物來跟蹤種系傳遞還有測定攜帶經(jīng)修飾PIK3CA等位基因的小鼠的基因型。為了激活乳腺中的潛伏PIK3CA H1047R突變型等位基因，我們將這種小鼠與MMTV-Cre( Jackson labs#003551)系交配。對于我們的終點研究，跟蹤具有可觸知腫瘤的小鼠，直至腫瘤達(dá)到~2500mm3，然后處以安樂死。還有，對展現(xiàn)任何身體條件得分〈2 (Ul Iman-Cul I ere, M.H.&Foltz, C.J.B LabAnim Sci49, 319-23(1999)),隆起姿態(tài)和體重?fù)p失>20%的小鼠也處以安樂死。依照科研動物護(hù)理和使用委員會(IACUC)指南在我們的動物房中維持所有小鼠。
[0121]DNA/RNA 制備
[0122]使用Qiagen AllPrep DNA/RNA試劑盒(Qiagen, CA)制備來自腫瘤/組織的DNA。使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen, CA)制備RNA樣品。
[0123]表達(dá)分析
[0124]分別使用N D-1000 分光光度計(Thermo Scientific, DE)和 Bioanalyzer2100(Agilent Technologies, CA)測定總RNA樣品的數(shù)量和質(zhì)量。按照制造商(AgilentTechno I ogi e s，CA )的用法說明書制備Cy染料標(biāo)記的cRNA和陣列雜交。簡言之，將總RNA樣品轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA，然后使用Agilent的快速擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒轉(zhuǎn)變成Cy染料標(biāo)記的cRNA。使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen，CA)純化經(jīng)過標(biāo)記的cRNA。使用ND-1000分光光度計(Thermo Scientific, Wilmington,DE)測定cRNA產(chǎn)率和Cy染料慘入。將750ng經(jīng)過標(biāo)記的cRNA片段化，并與Agilent的小鼠全基因組4x44K陣列雜交。用Cy5染料標(biāo)記所有樣品，并與Cy3染料標(biāo)記的通用小鼠參照(Stratagene, CA)雜交。將樣品在Pro Hybridizationstation HS4800 (Tecan US, NC)上以恒定搖動于65°C雜交17小時。雜交后，清洗陣列，干燥，并在Agilent掃描儀上掃描。使用Agilent的特征提取軟件10.7來分析獲得的陣列圖像。
[0125]自公用參照設(shè)計實驗中使用的兩色Agilent微陣列獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)。在Cy3通道中測量公用參照樣品，在Cy5通道中測量感興趣樣品。使用limma R包(Smyth，G.K.，StatAppl Genet Mol Biol3,Article3 (2004))中執(zhí)行的方法加工數(shù)據(jù)。首先，對數(shù)據(jù)修正背景，之后應(yīng)用陣列內(nèi)loess擬合和陣列間分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化(Smyth, G.K.&Speed, T., Methods31,265-73 (2003))。使用Iimma的線性模型擬合獲得差異表達(dá)基因標(biāo)簽，認(rèn)為FDR調(diào)整ρ值為0.05或更低和1g2變化為至少2的探針是差異表達(dá)的。使用歐幾里得距離度量和完全連鎖聚簇對均值集中基因表達(dá)概況計算樣品和EMT相關(guān)基因的分級聚簇。
[0126]比較基因組雜交(CGH)測定法
[0127]依照制造商的方案(Agilent Technologies, CA)在Agilent CGH陣列上對來自piK3CAe20Hi047E小鼠的乳腺腫瘤樣品測定概況。簡言之，用Alu I和Rsb I (PromegB, WI)消化腫瘤和參照樣品(C57BL/6J 小鼠，The JacksonLaboratory, ME) 二者的 500ng DNA,隨后用 QIAprep Spin Miniprep 試劑盒(QIAGEN GmbH, Germany)純化。使用升級版基因組 DNA標(biāo)記試劑盒(Agilent Technologies, CA)用 Cy5_dUTP (測試樣品)或 Cy3_dUTP (參照樣品)標(biāo)記經(jīng)過消化的樣品。將測試樣品與參照合并，隨后使用MicroConYM-30 (Millipore,Billerica, MA)純化。將經(jīng)過標(biāo)記的探針與Cot-1DNA (Invitrogen, CA), IOx封閉劑和2xH1-RPM雜交緩沖液(Agilent Technologies, CA)混合，并與Agilent的244K小鼠基因組CGH 微陣列雜交。將樣品在 ProHybridization station HS4800 (Tecan US,NC)上以恒定搖動于67°C雜交24小時。清洗陣列，干燥，并依照制造商的方案(Agilent Technologies, CA)在Agilent掃描儀上掃描。自Agilent特征提取軟件10.7版獲得減去背景的信號強(qiáng)度的個別 1g2 比。將 1g2 比集中至中值零,并使用 GLADCHupe,P., et al.,Bioinformatics20,3413-22 (2004))對每種探針的所得1g2比值分段。對給定GLAD衍生區(qū)段的基因組邊界內(nèi)的所有基因給予該區(qū)段內(nèi)的探針的均值拷貝數(shù)值?？截悢?shù)值>=0.41og2比單位代表增益，值〈=-0.41og2比單位代表損失。
[0128]外顯子組捕捉和測序
[0129]依照制造商的方案(Agilent Technologies, CA)使用3 μ g基因組DNA和SureSelectXT小鼠所有外顯子試劑盒實施靶定序列捕捉。小鼠所有外顯子試劑盒設(shè)計用于捕捉49.6Mb靶定區(qū)，而且覆蓋24，306種基因內(nèi)的221，784個外顯子。使用四輪PCR擴(kuò)增捕捉前文庫，但在捕捉后擴(kuò)增中使用12輪PCR。在BioanalyZer2100上使用DNA高靈敏度芯片(Agilent Technologies, CA)測定捕捉后擴(kuò)增文庫的片段大小分布。通過卡帕文庫定量試劑盒(Kapa Biosystems,MA)測量文庫的濃度。按照制造商的用法說明書(Illumina, CA)在HiSeq2000上對每個文庫測序以生成2x75bp讀出。使用缺省參數(shù)設(shè)置的BWA軟件(Li，
H.& Durbin, R.，Bioinformatics25,1754-60 (2009))將測序讀出定位至 UCSC 小鼠基因組(NCBI37/mm9)0 如先前描述的那樣(DePristo, M.A.et al.，Nature Genetics43,491-498
(2011))實施局部再比對，雙份標(biāo)記和原始變體呼叫。使用dbSNP Buildl31(Sherry，S.T.etal.，Nucleic Acids Res29, 308-11 (2001))中記載的SNP來清除已知的種系變異。另外，作為種系變異清除腫瘤和正常樣品中都存在的變體。預(yù)測腫瘤樣品中存在但匹配正常中缺失的剩余變異是體細(xì)胞的。另外過濾預(yù)測體細(xì)胞變異從而只包括具有腫瘤和匹配正常二者中最小IOx覆蓋以及匹配正常中觀察變異等位基因頻率〈1%的位置。使用SIFT(Ng，P.C.&Henikoff, S., Genome Res 12,436-46 (2002))和 PolyPhen (Ramensky, V., Bork, P.&Sunyaev,
S.Η.，Nucleic Acids Res30, 3894-900 (2002))預(yù)測蛋白質(zhì)體細(xì)胞突變對基因功能的影響(表 I)。
[0130]組織學(xué)，免疫組織化學(xué)和全封固分析
[0131]使用5μπι，福爾馬林固定，石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行例行蘇木精和曙紅(H&E)染色和組織學(xué)評估。
[0132]對于全封固分析，解剖乳腺，鋪開，并用Carnoy氏固定劑固定2_4小時。將組織水合并在Carmine明帆中染色過夜。
[0133]使用10 μ m切片Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek，CA)包埋冷凍樣品實施免疫熒光染色。將切片樣品在4%多聚甲醛中固定10分鐘，然后用含有1%BSA的PBT(含0.l%Triton的PBS)封閉30分鐘。然后在增濕室中將經(jīng)過封閉的切片用適宜的一抗(在含0.1%BSA的PBT中稀釋)于4°C染色過夜。將載玻片在PBT中清洗3次，然后在增濕室中與適宜的二抗一起于室溫溫育60分鐘。通過PBT清洗除去未結(jié)合的二抗。使用Prolong Gold抗褪色試劑(ant1-fade reagent) (Invitrogen,CA)封固載玻片。研究中使用的一抗是細(xì)胞角蛋白5 (Abeam, ab53121),細(xì)胞角蛋白 18 (Abeam, ab668), ER a (Thermo scientific, Ab_21), PR(Abeam, ab2764)和波形蛋白(Abeam, ab45939)。使用適宜的二抗(偶聯(lián)有Alexa488或647)(Molecular probes)來檢測結(jié)合的一抗。
[0134]Western 印跡分析
[0135]將冷凍腫瘤稱重，并在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑(F.Hoffman-La Roche, Ltd.，Germany), ImM苯基甲基磺酰氯，和磷酸酶抑制劑混合物I和2 (Sigma, MO)的細(xì)胞提取物緩沖液(Invitrogen, CA)中用研棒 PP (Scienceware, NJ)裂解。使用 Pierce BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒(R ockford, IL)測定蛋白質(zhì)濃度。對于Western印跡，通過電泳穿過NuPage Bis-Tris4_12%梯度凝膠(Invitrogen, CA)將等量的蛋白質(zhì)分開,使用iBlot系統(tǒng)(Invitrogen, CA)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素孔膜上。用于印跡的一抗包括pAkt(Ser473),pAkt (Thr308)，總 Akt，pS6 (Ser235/236)，pS6 (Ser240/242)和總 S6 抗體(它們得自 CellSignaling Technology (Danvers, MA))，及抗肌動蛋白抗體(它購自 Sigma-Aldrich (St.Louis,MO))。采用與適宜的偶聯(lián)有的辣根過氧化物酶的IgG 二抗結(jié)合的化學(xué)發(fā)光Western印跡檢測(Amersham Biosciences, PA)來檢測一抗結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0136]藥物功效研究
[0137]將乳腺腫瘤碎塊皮下植入稱重20_25g之間的8-10周雌性C.B-17SCID米色小鼠(Charles River Laboratories, MA)的乳腺脂肪墊附近。監(jiān)測腫瘤，直至它們達(dá)到均值腫瘤體積200-300mm3，并將動物隨機(jī)分入4組，每組9只動物，之后啟動劑量給藥。在含
0.2%Tween80的0.5%甲基纖維素(MCT)媒介中溶解⑶C-0941，并通過口服管飼法每天一次給藥，持續(xù)13天,分三個劑量組:50,100和150mg/kg。在研究過程里每周兩次記錄腫瘤尺寸和小鼠體重。腫瘤體積用測徑器以二維測量并用下述公式計算:腫瘤尺寸(_3)=(長測量結(jié)果X短測量結(jié)果2) x0.5。使用下述公式計算百分比重量變化:組百分比重量變化=(新重量-初始重量)/初始重量)XlOO。計算均值腫瘤體積(+/-SEM)和百分比重量變化，并使用Kaleidagraph (4.03版,Synergy Software)繪制曲線圖。根據(jù)IAQJC指南,對腫瘤體積^ 2，OOOmm3或相對于它們初始體重的體重?fù)p失> 20%的小鼠迅速處以安樂死。為了分析隨時間來自同一動物的腫瘤體積的重復(fù)測量，使用一種混合建模辦法(Pinheiro，J.，Bates,D.，DebRoy, S.，Sarkar, D.& The R Core team, nlme:Linear and Nonlinear Mixed EffectsModels.R包3.1-89.版(2008))。這種辦法解決重復(fù)測量和研究結(jié)束前動物的任何非治療相關(guān)死亡所致的適度退出二者。使用三次回歸樣條將非線性曲線擬合每個劑量水平的1g2腫瘤體積的時間過程。然后在混合模型內(nèi)將這些非線性曲線與劑量聯(lián)系起來。以相應(yīng)每天劑量組與媒介相比的擬合曲線下面積(AUC)的百分?jǐn)?shù)，計算媒介百分?jǐn)?shù)(％TGI)形式的腫瘤生長抑制，這使用下述公式進(jìn)行:％TGI=100x(l-AUC劑量/AUC媒介)。為了得到％TGI的不確定度區(qū)間(UI)，使用擬合曲線和擬合協(xié)方差陣生成隨機(jī)樣本，作為％TGI分布的近似。隨機(jī)樣本由擬合-混合模型的1000次模擬實施構(gòu)成，其中對每次實施重新計算％TGI。我們報告的Π是9^61的重新計算值根據(jù)擬合模型有95%的機(jī)會會落在這個區(qū)域中的值。使用模擬分布的2.5和97.5百分位作為上和下UI。使用R (2.8.1版，R Development CoreTeam2008 ；R Foundation for Statistical Computing ;Vienna, Austria)和 Excel 生成曲線圖。使用R分析數(shù)據(jù)，并使用nlme包(Pinheiro et al.,見上文)在R內(nèi)擬合混合模型。[0138]結(jié)果
[0139]工程化改造可條件性激活的PIK3CA H1047R小鼠
[0140]為了研究PIK3CA突變在腫瘤啟動，發(fā)生和發(fā)展中的作用，我們工程化改造小鼠能夠條件性表達(dá)由其天然啟動子驅(qū)動的突變型PIK3CA H1047R等位基因。工程化小鼠PIK3CAe20mwt具有經(jīng)修飾含有側(cè)翼1xP位點的野生型PIK3CA外顯子20。經(jīng)修飾野生型外顯子后面是轉(zhuǎn)錄終止盒和一拷貝編碼H1047R突變的PIK3CA外顯子20 (圖la_d)。使用打靶載體(圖1b)修飾小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞中的內(nèi)源PIK3CA基因座。使用含有適宜修飾，通過Southern印跡鑒定(圖1f，g)的兩個獨立ES細(xì)胞克隆生成顯示PIK3CAe2°mwt等位基因種系傳遞的嵌合小鼠。涉及雜合PIK3CAe2°mwt/+小鼠的雜交以預(yù)期孟德爾比率產(chǎn)生具有適宜基因型的后代(圖 13)。與 PIK3CA-/-缺無小鼠(Bi，L., Okabe, et al.,JBiol Chem274，10963-8(1999))中觀察到的胚胎致死性不同，在Cre介導(dǎo)的重組之前，我們發(fā)現(xiàn)純合PIK3CAe2°mwt/e20mwt動物以預(yù)期孟德爾頻率出生，指示經(jīng)修飾PIK3CAe20mwt發(fā)揮與野生型PIK3CA等位基因類似的功能。
[0141]pIK3CAe20H1047E等位基因的乳腺特異性表達(dá)
[0142]由于PIK3CA在超過25%的人乳腺癌中是突變的(Zhao&Voigt，0ncogene27,5486-5496(2008))，通過將 PIK3CAe2Qniwt 小鼠與 MMTV-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠(Wagner，K.U.et al.，Nucleic Acids Res25,4323-30 (1997) ；ffagner, K.U.et al., Transgenic ReslO,545-53(2001))交配，我們測試PIK3CAH1047R在乳腺腫瘤發(fā)生中的作用。MMTV-Cre系在乳腺允許性MMTV LTR啟動子控制下表達(dá)PlCre重組酶，容許PIK3CAe2°H1°4?重組和表達(dá)。通過對與自piK3CAe20Hi047 E/+小鼠乳腺提取的PIK3CA mRNA對應(yīng)的cDNA測序，我們確認(rèn)PIK3CAe2_47R突變型等位基因和天然野生型PIK3CA等位基因的表達(dá)(圖lh)。相反，自腎提取的RNA只顯示來自PIKSCA^wt等位基因的野生型PIK3CA的表達(dá)(圖1i)，確認(rèn)突變型PIK3CAe2CIH1°47K等位基因的乳腺特異性表達(dá)。
[0143]PiK3CAe20m047R的表達(dá)導(dǎo)致增強(qiáng)的乳腺分支形態(tài)發(fā)生
[0144]先前的研究顯示癌基因的表達(dá)或腫瘤抑制基因(像PTEN)的喪失影響小鼠乳腺的分支和形態(tài)發(fā)生(Meyer, D.S.et al.，Cancer Research (2011) ；Li, G.et al.，Developmentl29,4159-70 (2002) ；Fishler, T.et al., 0ncogene29,4007-17 (2010)。因此，我們使用全封固染色研究PIK3CAe2°H1°47K表達(dá)對乳腺發(fā)育的影響。在12周時，與對照乳腺中的正常末端終蕾(TEB)相比，PIK3CAe20H1047E突變型乳腺顯示高度分支的導(dǎo)管和末端結(jié)構(gòu)(圖6a，b)。到第50周，與對照乳腺相比，PIK3CAe2°H1°47K突變型乳腺顯示羽毛狀的高度分支的形態(tài)(圖6c，d)。而且，在50周齡時PIK3CA~47R突變型乳腺的組織學(xué)切片顯示腫瘤小結(jié)的證據(jù)(圖6e，f)。這與涉及PTEN條件性缺無小鼠和具有PI3K途徑激活的其它乳腺特異性轉(zhuǎn)基因模型的先前研究(Meyer et al.，見上文；Li et al.，見上文)中報告的乳腺分支形態(tài)發(fā)生缺陷相似。
[0145]PIK3CAe20H1047E表達(dá)促進(jìn)乳腺腫瘤發(fā)生
[0146]在80周時段里對雌性PIK3CAe2°H1_/+，PIK3CAe20mwt/+和MMTV-Cre小鼠跟蹤乳腺腫瘤發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)雜合PIK3CA~a動物發(fā)生乳腺腫瘤(圖2a-c)，中值無腫瘤存活478.5天。大多數(shù)動物在胸部乳腺中發(fā)生腫瘤(#1，2，3，6，7和8)，而一些在腹股溝-腹部乳腺中發(fā)生腫瘤(#4，5，9和10)，而且少數(shù)在胸部和腹股溝-腹部乳腺二者中發(fā)生腫瘤。與pIK3CAe20H1047E/+不同，對照ρΙΚ3(^2(Μ/+和動物在研究期間保持沒有腫瘤。在自第二個獨立靶定ES克隆衍生的PIK3CA—/+小鼠中也觀察到具有相似潛伏期的乳腺腫瘤表型(圖2c)，進(jìn)一步確認(rèn)PIK3CAe2°H1°47K表達(dá)驅(qū)動的腫瘤表型的特異性。
[0147]MMTV啟動子在處女和哺乳乳腺中都驅(qū)動它控制下的基因的表達(dá)(Wagner，K.U.etal.，Nucleic Acids Res25，4323-30 (2010))。因此，我們比較未產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)小鼠中的腫瘤發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)潛伏期在經(jīng)產(chǎn)PIK3CAe2°H1°4?小鼠中與未產(chǎn)PIK3CAe2°H1°4?動物相比顯著縮短(圖7)，從492天到465天(p=0.0002)，提示妊娠相關(guān)乳腺變化有助于加速腫瘤發(fā)生。
[0148]雖然MMTV啟動子自出生后第6天開始主要在乳腺上皮細(xì)胞中指導(dǎo)Cre表達(dá)，但是還知道它驅(qū)動唾液腺和雄性精囊中的表達(dá)(Wagner, K.U.et al., Transgenic ReslO,545-53 (2001))。在實施來自攜帶乳腺腫瘤的小鼠的唾液腺和來自年齡在35-41周之間的雄性的精囊的組織學(xué)分析時，我們沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤的證據(jù)(圖8a，b)。然而，與對照動物相比，PIK3CAe2°H1°47KA小鼠(n=3)中的精囊在形態(tài)上更大。精囊橫切片的組織學(xué)分析指示精囊液分泌量增多，導(dǎo)致導(dǎo)管膨脹和擴(kuò)大(圖8c，d)。然而，這不影響PIK3CA~/+雄性的生育力和交配。
[0149]PIK3CAe20H1047E驅(qū)動的腫瘤中的組織學(xué)和信號傳導(dǎo)激活
[0150]我們實施PIK3CA—腫瘤的組織學(xué)分析以了解它的病理學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤顯示與纖維腺癌一致的特征(76.9%[20/26])(圖2d)，而少數(shù)顯示腺癌(15.4%[4/26])(圖2e，f)或紡錘細(xì)胞瘤形成(7.7%[2/26])(圖2g)的組織病理學(xué)特征。
[0151]為了進(jìn)一步表征腫瘤，我們測試組織學(xué)不同腫瘤類型的PI3K途徑激活狀態(tài)。在所有腫瘤類型中，我們觀察到升高的PAKT和pS6激酶(圖2h)，二者都是PI3K的下游，指示這些腫瘤中該途徑的組成性激活。
[0152]在進(jìn)一步了解觀察到的乳腺腫瘤類型的努力中，我們研究組織學(xué)不同乳腺腫瘤類型中基底細(xì)胞角蛋白5(CK5)，內(nèi)腔細(xì)胞角蛋白18(CK18)，雌激素受體(ER)，孕酮受體(PR)，和波形蛋白(一種間充質(zhì)標(biāo)志物)的表達(dá)。雖然我們發(fā)現(xiàn)纖維腺癌和腺癌都是CK5，CK18，ER和PR陽性的，都是紡錘細(xì)胞腫瘤是ER_/PR_ (圖3η，ο)且CK5_的(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣的是，這讓人回想起人乳腺紡錘細(xì)胞腫瘤也是ER/PR陰性。另外，紡錘細(xì)胞腫瘤是CK18+/波形蛋白+的(圖3n，p)，指示所述細(xì)胞正經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)。
[0153]PIK3CAe20H1047E驅(qū)動的乳腺腫瘤的基因組分析
[0154]在實施PIK3CA H1047R乳腺腫瘤的基因組分析之前，鑒于腫瘤形成的長潛伏期，我們首先測試自乳腺腫瘤衍生的腫瘤外植體是否會像SCID小鼠中的異種移植物那樣生長。測試的大多數(shù)纖維腺癌，腺癌和紡錘細(xì)胞腫瘤形成腫瘤。有趣的是，自纖維腺癌外植體衍生的腫瘤的組織學(xué)顯示腺癌或紡錘細(xì)胞瘤形成的特征，指示纖維腺癌有可能是良性的且只是初始外植體內(nèi)具有致瘤潛力的細(xì)胞子集有助于傳代期間的腫瘤發(fā)生(圖9a-d)。然而，紡錘細(xì)胞腫瘤外植體在傳代期間維持它的組織學(xué)特征(圖9e，f)。
[0155]我們實施不同 乳腺腫瘤亞型和對照乳腺的基于微陣列的基因表達(dá)分析以進(jìn)一步了解腫瘤的分子特征。使用上皮細(xì)胞，干細(xì)胞和EMT標(biāo)志物的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行的分級聚簇(Weigelt，B.& Reis-FiIho，Nature Reviews Clinical 0ncology6, 718-730 (2009) ;Taube，J.H.et al.,Proceedings of the National Academy of Sciencesl07，15449-15454 (2010))顯示原代纖維腺癌，腺癌和來自這些腫瘤類型的外植體傳代衍生的腫瘤聚簇在一起，指示一種共同的起源和共享的基因表達(dá)變化集合(圖4a)。相反，紡錘細(xì)胞類型(原代和傳代腫瘤二者)聚簇在一起，展示EMT的特征,提示一種不同的細(xì)胞起源(圖4a)。
[0156]全外顯子組捕捉和測序用于鑒定基因組的編碼區(qū)中的體細(xì)胞突變(Varela，1.etal.，Nature469, 539-542 (2011))。為了了解在我們的模型中觀察到的各種乳腺腫瘤類型中次要突變的出現(xiàn)，我們實施選定樣品集合的全外顯子組捕捉和測序(圖14)。在工程化PIK3CA H1047R突變的存在之外，腫瘤還含有數(shù)種別的體細(xì)胞變化(表1)。我們發(fā)現(xiàn)纖維腺癌具有低水平的體細(xì)胞突變(介于2和5之間)，接著是腺癌(22種突變)和紡錘細(xì)胞腫瘤(61種突變)。值得注意地，在紡錘細(xì)胞腫瘤中，我們鑒定出Trp53(TP53)中密碼子245處Arg用His替換的突變(圖4b)。這種突變等同于密碼子248處的人TP53熱點突變(R248H)，而且是TP53的DNA結(jié)合域內(nèi)已經(jīng)充分表征的功能喪失性突變,使之作為顯性負(fù)蛋白質(zhì)(dominantnegative protein)起作用(Olivier, Μ., Hollstein, Μ.& Hainaut, P., Cold Spring HarborPerspectives in Biology2, a001008_a001008 (2010))。而且，TP53 突變和原代紡錘細(xì)胞腫瘤中鑒定的大多數(shù)突變也見于傳代后的外植體衍生腫瘤，指示原代紡錘腫瘤有可能雜合性較低(圖10)。正如在紡錘細(xì)胞腫瘤中觀察到的，原代腺癌中存在的大多數(shù)突變存在于移植后衍生的腫瘤中(圖10)。在腺癌中，在觀察到的22種突變中，12種(包括Plkl，Tssk2，和SMGl激酶中的突變)預(yù)測具有功能效果，因此可能作為驅(qū)動器起作用(表1和圖10)。有趣的是，人乳腺癌中的SMGl突變先前已有報告(Stephens, P.et al., Nature Genetics37,590-592 (2005))。
[0157]在全外顯子組突變分析之外，我們在CGH陣列上測定腫瘤的概況以了解染色體拷貝數(shù)改變。有趣的是，反映在纖維腺癌和腺癌中觀察到的低水平的體細(xì)胞突變，這兩種腫瘤類型都具有很少區(qū)域的拷貝數(shù)異常。與纖維腺癌和腺癌形成對比，在紡錘細(xì)胞腫瘤樣品中，我們發(fā)現(xiàn)與正常乳腺相比具有拷貝數(shù)改變的數(shù)個區(qū)域。我們觀察到染色體11中一個~3Mb區(qū)域的廣泛擴(kuò)增和染色體I和4中的局灶性增益。更多詳情參見YuanW.et al.,Oncogene
(2012), 1-9,包括 Oncogene 網(wǎng)站(http://www.nature, com/one)上伴隨該論文的補(bǔ)充信息，它們都通過述及明確收入本文。紡錘細(xì)胞腫瘤也表征為落在染色體11和12內(nèi)的兩個區(qū)域的染色體丟失，二者都含有數(shù)種編碼基因。特別地，染色體11中的刪除導(dǎo)致Nfl喪失(圖4C)，而且與它下調(diào)的表達(dá)一致(1g2比率-2.09 ；p=8.338e-05，圖4A)，提示Ras-MAPK途徑可能也參與這些腫瘤。
[0158]pIK3CAe20H1047E乳腺腫瘤響應(yīng)PI3K抑制劑
[0159]遺傳工程化小鼠模型為臨床前背景中的候選藥物測試提供理想平臺(Singh，M.etal.，Nat Biotechnol28, 585-93 (2010))。由于這項研究中的小鼠在長潛伏期后發(fā)生乳腺腫瘤，我們使用我們的腫瘤外植體衍生腫瘤模型來測試它在評估藥物功效中的效用。將自具有TP53突變的紡錘細(xì)胞腫瘤衍生的外植體皮下植入乳腺脂肪墊附近，并一旦腫瘤達(dá)到至少~200mm3 就用 PI3KCA 抑制劑 GDC-0941 (Edgar, K.A.et al.，Cancer Research70,1164-1172 (2010) ；Folkes, A.et al.，W02007127175)進(jìn)行治療。分 4 組(每組 9 只動物)用50，100和150mg/kg⑶C-0941或媒介處理荷瘤小鼠。我們發(fā)現(xiàn)用⑶C-0941處理的動物顯示最高的腫瘤生長抑制(TGI)，150mg/kg為85%，盡管與媒介處理相比在測試的其它劑量也觀察到腫瘤生長抑制(圖5a)，指示這些腫瘤的生長仍然依賴于突變型PIK3CA信號傳導(dǎo)。而且，這些進(jìn)展前時間數(shù)據(jù)的時序檢驗顯示與媒介對照處理動物相比，所有藥物治療組在測試的所有劑量顯示統(tǒng)計學(xué)顯著差異(150mg/kg的p〈0.0OOl ;圖12)。與觀察到的TGI —致，來自用GDC-0941治療的小鼠的腫瘤顯示pAKT和pS6的顯著降低，至少延續(xù)至治療后10小時(圖5b)，確認(rèn)PI3K抑制在腫瘤生長抑制中的貢獻(xiàn)。
[0160]討論
[0161]癌癥的遺傳工程化小鼠模型對于了解腫瘤啟動，進(jìn)展和治療評估是無價的(Tuveson, D.& Hanahan, D.，Nature471, 316-7 (2011))。另外，將下一代測序技術(shù)應(yīng)用于這些模型能提供關(guān)于腫瘤發(fā)展期間發(fā)生的分子異常的有價值信息。在此，我們描述乳腺癌的可條件性激活的PIK3CAH1047R小鼠模型，并顯示這些小鼠發(fā)生多種組織學(xué)類型的乳腺腫瘤，包括纖維腺癌，腺癌和紡錘細(xì)胞瘤形成。我們發(fā)現(xiàn)腺癌對于激素受體和細(xì)胞角蛋白(CK5+/CK18+)是陽性的，指示它們是上皮起源的。相反，雖然紡錘細(xì)胞腫瘤是細(xì)胞角蛋白18陽性的，但是區(qū)別在于它們是ER/PR陰性的，但波形蛋白陽性的。這讓人回想起人乳腺紡錘腫瘤(Khan, H., European Journal of Surgical 0ncology29,600-603 (2003) ；Carter,M.R.,et al.，Am J Surg Pathol 30，300-9(2006))。在我們的乳腺癌模型中觀察到的多種組織學(xué)類型與先前涉及小鼠中PIK3CA H1047R驅(qū)動乳腺癌的轉(zhuǎn)基因模型的研究一致(Adams，J.R.et al., Cancer Research71, 2706-2717 (2011) ；Meyer, D.S.et al., Cancer Research(2011))。然而，我們的模型中乳腺腫瘤發(fā)生的潛伏期與PIK3CA H1047R突變型cDNA在使用MMT-Cre激活其表達(dá)后在R0SA26基因座啟動子(中值存活，A系為150天；NLST系>500天)或雞肌動蛋白啟動子(平均214±22.6天)控制下表達(dá)的兩項研究相比更長。這有可能反映下述事實，即我們的敲入模型自其以其正?；蚪M構(gòu)造存在的內(nèi)源啟動子表達(dá)突變型PIK3CA等位基因，因此更加精確地模擬體內(nèi)PIK3CA H1047R驅(qū)動的腫瘤發(fā)生。
[0162]下一代測序技術(shù)的出現(xiàn)容許在序列水平綜合表征癌癥(Stratton，M.R.，et al.，Nature458，719-724 (2009))。在應(yīng)用下一代測序技術(shù)時，我們表征了自我們的小鼠模型衍生的腫瘤以了解PIK3CA H1047R突變型等位基因表達(dá)后乳腺腫瘤發(fā)生所需要的別的打擊。在可能與PIK3CAH1°4?合作的數(shù)種候選次要打擊中，我們報告紡錘細(xì)胞腫瘤中TP53K245H突變的發(fā)生。R245H突變等同于在人癌癥中觀察到的R248H熱點顯性-負(fù)突變型。功能喪失性TP53K245H突變的自發(fā)出現(xiàn)，TP53突變與PIK3CA突變在乳腺癌中共發(fā)生的事實(Boyault，S.et al.,Breast Cancer Research and Treatment (2011))及 TP53 喪失在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中顯示與致癌性 PIK3CA 合作(Adams，J.R.et al., Cancer Research71，2706-2717 (2011))提示這有可能是合作性驅(qū)動突變。這指示我們的模型模擬有助于人乳腺腫瘤發(fā)生的損傷，因此會是研究突變型PIK3CA驅(qū)動的乳腺腫瘤中的治療性干預(yù)的理想模型。據(jù)此，我們演示該模型的效用，即在具有EMT特征的乳腺腫瘤子集中測試PI3K抑制劑GDC-0941的功效。一份先前的報告在PIK3CAH1047R轉(zhuǎn)基因肺腫瘤模型中研究雙重泛PI3K和哺乳動物雷帕霉素靶物(mTOR)抑制劑NVP-BEZ235的功效。然而，鑒于PIK3CA突變在人乳腺癌中更加頻繁，我們的模型可充當(dāng)遺傳限定系統(tǒng)來測試PI3K抑制劑在乳腺癌中的功效及潛在幫助模擬用于臨床藥物測試的治療方案。
[0163]除了在研究乳腺腫瘤發(fā)生中的效用之外，通過使用適宜的組織特異性Cre系激活突變型PIK3CA等位基因，該模型還可用于研究已經(jīng)觀察到PIK3CA突變的其它癌癥。而且，該模型與下一代測序技術(shù)結(jié)合可用于發(fā)現(xiàn)和了解在別的腫瘤類型中與突變型PIK3CA合作的其它驅(qū)動基因。鑒于已經(jīng)將PI3K途徑激活與對治療的抗性聯(lián)系起來，PI3KCA H1047R小鼠還可用于模擬藥物 抗性及研究治療策略以克服抗性。
【權(quán)利要求】
1.一種非人轉(zhuǎn)基因動物，其包含經(jīng)修飾內(nèi)源PIK3CA基因座，其中所述經(jīng)修飾內(nèi)源PIK3CA基因座包含與野生型外顯子20相鄰的編碼H1047R的休眠突變型PIK3CA外顯子20，且其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物能夠進(jìn)行PIK3CA H1047R (PIK3CAe2°H1°4?)突變型等位基因的條件性表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中所述突變型等位基因的條件性表達(dá)處于PIK3CA內(nèi)源啟動子控制之下。
3.權(quán)利要求3的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中所述條件性表達(dá)是由所述突變型等位基因通過Cre介導(dǎo)的重組的激活觸發(fā)的。
4.權(quán)利要求1的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中所述條件性表達(dá)是組織特異性的。
5.權(quán)利要求4的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中所述條件性表達(dá)是乳腺特異性的。
6.權(quán)利要求1的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中所述條件性表達(dá)導(dǎo)致突變型PIK3CAH1047R表達(dá)和腫瘤發(fā)生。
7.權(quán)利要求1至6任一項的非人轉(zhuǎn)基因動物，其為嚙齒類動物。
8.權(quán)利要求7的非人轉(zhuǎn)基因動物，其為小鼠或大鼠。
9.一種荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物，其條件性表達(dá)處于PIK3CA內(nèi)源啟動子控制之下PIK3CAH1047R (PIK3CAe20H1047E)突變型等位基因。
10.權(quán)利要求9的 荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物，其以組織特異性方式表達(dá)PIK3CAH1047R突變型等位基因。
11.權(quán)利要求10的荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物，其中所述PIK3CAH1047R突變型等位基因在所述動物的乳腺中表達(dá)且所述腫瘤是乳腺腫瘤。
12.權(quán)利要求11的荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物，其對于PIK3CAH1047R突變型等位基因是雜合的。
13.權(quán)利要求11的荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物，其對于PIK3CAH1047R突變型等位基因是純合的。
14.權(quán)利要求11的荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物，其中所述乳腺腫瘤選自下組:纖維腺癌，腺癌和紡錘細(xì)胞瘤形成。
15.權(quán)利要求9的荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物，其為嚙齒類動物。
16.權(quán)利要求15的荷瘤非人轉(zhuǎn)基因動物，其為小鼠或大鼠。
17.一種用于生成權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物的方法，其包括放置一拷貝編碼H1047R突變的外顯子20，與編碼野生型PIK3CA等位基因的外顯子20相鄰。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述編碼野生型PIK3CA等位基因的外顯子20側(cè)翼為IexP位點，接著是轉(zhuǎn)錄終止盒和一拷貝編碼H1047R突變的PIK3CA外顯子20。
19.一種對受試者篩選腫瘤存在情況的方法，該方法包括對自所述受試者獲得的生物學(xué)樣品測試PIK3CA H1047R等位基因或相應(yīng)基因產(chǎn)物的存在情況。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述腫瘤選自下組:纖維腺癌，腺癌和紡錘細(xì)胞瘤形成。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述腫瘤選自下組:乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸直腸癌，胃癌，肺癌，肝細(xì)胞癌，甲狀腺癌，子宮內(nèi)膜癌，白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述腫瘤為乳腺癌。
23.權(quán)利要求19的方法，其進(jìn)一步包括對所述樣品測試次要體細(xì)胞突變的存在情況或拷貝數(shù)改變。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述次要體細(xì)胞突變在TP53基因中。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述次要體細(xì)胞突變?yōu)镽248H，A135V或I195NTP53突變。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述次要體細(xì)胞突變?yōu)镽248HTP53突變。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述次要體細(xì)胞突變在Plkl，Tssk2或SMGl基因中。
28.—種篩選用于治療腫瘤的藥物候選物的方法，其包括(a)將藥物候選物施用于權(quán)利要求9的荷瘤非人動物，并(b)測量所述腫瘤對所述治療的響應(yīng)。
29.權(quán)利要求28的方法，其中步驟(b)包括評估所述藥物 候選物引起至少一種選自下組的響應(yīng)的能力:減少腫瘤細(xì)胞數(shù)目，縮小腫瘤尺寸或腫瘤負(fù)荷，抑制腫瘤細(xì)胞浸潤入周圍器官，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，和抑制腫瘤生長。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述腫瘤選自下組:纖維腺癌，腺癌和紡錘細(xì)胞瘤形成。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述腫瘤選自下組:乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸直腸癌，胃癌，肺癌，肝細(xì)胞癌，甲狀腺癌，子宮內(nèi)膜癌，白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述腫瘤為乳腺癌。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所述藥物候選物為小分子，肽，多肽，或抗體。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述藥物候選物為抗體。
35.一種鑒定用于治療藥物抗性癌癥的抗癌劑的方法，其包括(a)將藥物候選物施用于權(quán)利要求9的荷瘤非人動物，(b)測量所述腫瘤對所述治療的響應(yīng)，并(C)若所述腫瘤對所述治療展現(xiàn)正面響應(yīng)，則將所述藥物候選物鑒定為用于治療藥物抗性癌癥的抗癌劑。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述正面響應(yīng)選自下組:減少腫瘤細(xì)胞數(shù)目，縮小腫瘤尺寸或腫瘤負(fù)荷，抑制腫瘤細(xì)胞浸潤入周圍器官，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，和抑制腫瘤生長。
37.一種用于鑒定PI3K抑制劑的方法，其包括(a)將PI13K抑制劑候選物施用于權(quán)利要求9的荷瘤非人動物，(b)測量所述腫瘤對所述治療的響應(yīng),并(C)若所述腫瘤對所述治療展現(xiàn)正面響應(yīng)，則將所述候選物鑒定為PI13K抑制劑。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述癌癥為乳腺癌。
39.權(quán)利要求9的荷瘤非人動物在篩選用于治療腫瘤的藥物候選物的方法中的用途，其包括(a)將藥物候選物施用于權(quán)利要求9的荷瘤非人動物，并(b)測量所述腫瘤對所述治療的響應(yīng)。
40.權(quán)利要求9的荷瘤非人動物在鑒定用于治療藥物抗性癌癥的抗癌劑的方法中的用途，其包括(a)將藥物候選物施用于權(quán)利要求9的荷瘤非人動物，(b)測量所述腫瘤對所述治療的響應(yīng)，并(C)若所述腫瘤對所述治療展現(xiàn)正面響應(yīng)，則將所述藥物候選物鑒定為用于治療藥物抗性癌癥的抗癌劑。
41.權(quán)利要求9的荷瘤非人動物在用于鑒定PI3K抑制劑的方法中的用途，其包括(a)將PI13K抑制劑候選物施用于所述荷瘤動物，(b)測量所述腫瘤對所述治療的響應(yīng),并(c)若所述腫瘤對所述治療展現(xiàn)正面響應(yīng)，則將所述候選物鑒定為PI13K抑制劑。
【文檔編號】A01K67/027GK104010494SQ201280046858
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月28日
【發(fā)明者】S.塞沙吉里 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司