一種新菌株及其獲取方法、應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明實(shí)施例提供了一種新菌株及其獲取方法、應(yīng)用，涉及環(huán)境污染物生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】，可以高效地降解5環(huán)以上多環(huán)芳烴和8種多環(huán)芳烴混合物。所述新菌株保藏名稱為：ZH-H2，分類名稱為：Fusarium dlaminii，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期：2014年06月11日，保藏號(hào)：CGMCC No.9316。所述新菌株在PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)4d后，菌落直徑為3.2cm；菌株產(chǎn)生紫色色素，基物表面黃色，背面色深，培養(yǎng)基無(wú)色，菌絲生長(zhǎng)致密，菌落表面棉絮狀；分生孢子鐮刀形，略彎曲，兩端漸尖，0-3個(gè)分隔，多數(shù)無(wú)隔。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗；厚垣孢子球形。CGMCC NO.93162014.06.11
【專利說(shuō)明】-種新菌株及其獲取方法、應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種降解5環(huán)W上多環(huán)芳姪 和8種多環(huán)芳姪混合物的新菌株及其獲取方法、應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 多環(huán)芳姪（PAHs)是目前人類發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最多、分布最廣的一類環(huán)境致癌物，其獨(dú) 特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有良好的穩(wěn)定性和強(qiáng)烈的憎水性，因此，難W被生物降解，且易在±壤中積 累。PAHs是一類廣泛分布并穩(wěn)定存在于自然環(huán)境中的含2個(gè)或2個(gè)W上苯環(huán)的有毒有機(jī) 污染物。由于其具有"H致（致癌、致崎、致突變）效應(yīng)，還會(huì)產(chǎn)生光致毒效應(yīng)，且其在±壤 中具有隱弊性大、潛伏期長(zhǎng)、涉及面廣、治理困難等特點(diǎn)，尤其是高環(huán)PAHs,不僅化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù) 雜、電子云密度高、很難被氧化，而且水溶性差、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、固水分配系數(shù)高、生物可利用 性低，帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題日益突出，從而倍受環(huán)境科學(xué)家的關(guān)注，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境 具有很大的潛在危害。美國(guó)環(huán)保局在20世紀(jì)80年代初就將16種PAHs列為環(huán)境中優(yōu)先監(jiān) 測(cè)污染物，我國(guó)也將PAHs列入環(huán)境優(yōu)先檢測(cè)的污染物黑名單中。多環(huán)芳姪已造成許多重點(diǎn) 工礦企業(yè)內(nèi)部和周邊±壤的嚴(yán)重污染，如在煤的抽提物中可檢測(cè)出上百種芳姪和環(huán)焼芳姪 化合物，因此，煤礦區(qū)煤炭開(kāi)采、加工、儲(chǔ)運(yùn)等活動(dòng)帶來(lái)了周圍環(huán)境PAHs的嚴(yán)重污染。在焦 化廠裝煤、出焦和運(yùn)輸3個(gè)工藝過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生大量的PAHs煙塵，其能夠影響到達(dá)2?3km 或更大范圍的地區(qū)。在一些重工業(yè)污染區(qū)，每千克±壤中PAHs含量可達(dá)上萬(wàn)幾萬(wàn)微克。在 農(nóng)業(yè)污灌區(qū)同樣存在污染問(wèn)題，研究表明，沈撫灌區(qū)±壤表層16種優(yōu)先控制PAHs的平均含 量達(dá)2. 22mg/kg，亞表層為0. 75mg/kg ;無(wú)論表層還是亞表層，多環(huán)芳姪均W 4環(huán)和5環(huán)為 主，其在總PAHs中所占比例均在34% W上。
[0003] 為了保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康，有必要對(duì)PAHs污染±壤進(jìn)行修復(fù)。生物修復(fù)是 指利用特定的生物吸收、轉(zhuǎn)化、清除或降解環(huán)境污染物，從而修復(fù)被污染環(huán)境或消除環(huán)境中 污染物，實(shí)現(xiàn)環(huán)境凈化。在目前的修復(fù)方法中，生物修復(fù)相對(duì)于物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)還具 有諸多優(yōu)點(diǎn)，如費(fèi)用低、效果好、不產(chǎn)生二次污染等，是一類低耗、高效和環(huán)境安全的環(huán)境生 物技術(shù)，具有良好發(fā)展?jié)摿ΑＮ⑸镌谏镄迯?fù)中具有不可忽視的作用，篩選高效功能菌 株是生物修復(fù)的基礎(chǔ)。迄今為止，學(xué)者們已經(jīng)分離出許多可W降解多環(huán)芳姪的微生物，其 中細(xì)菌占主要地位。已經(jīng)富集分離并鑒定的降解高環(huán)PAHs的細(xì)菌主要包括；銷氨醇菌屬 (S地ingomonas sp.)、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.)和分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.) 等。其中，大多數(shù)降解菌能W四環(huán)PAHs為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，且可參與更高環(huán)PAHs的 共代謝降解過(guò)程。W往降解芳姪的微生物大多都是針對(duì)低分子量的多環(huán)芳姪，可降解高環(huán) PAHs的優(yōu)勢(shì)菌株很少，尤其五環(huán)W上則更少，且對(duì)高環(huán)多環(huán)芳姪的降解效果不甚理想。同 時(shí)，對(duì)于W煤礦區(qū)PAHs污染的±壤為介質(zhì)的降解菌篩選工作還較少關(guān)注。鑒于此，本專利 W唐山煤礦區(qū)周圍PAHs污染的±壤為對(duì)象，篩選五環(huán)W上高環(huán)芳姪和8種PAHs混合物的 降解菌，對(duì)多環(huán)芳姪污染的±壤修復(fù)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的實(shí)施例提供一種的新菌株，可W高效地降解5環(huán)W上多環(huán)芳姪和8種多 環(huán)芳姪混合物。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的實(shí)施例采用如下技術(shù)方案：
[0006] -種新菌株，所述新菌株ZH-肥保藏名稱為：化sarium dlaminii，保藏單位；中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中也，保藏日期：2014年06月11日，保藏號(hào)；CGMCC No.9316。
[0007] 所述新菌株在馬鈴墓葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基上3(TC培養(yǎng)4d后，菌落直徑為 3. 2cm ;菌株產(chǎn)生紫色色素，基物表面黃色，背面色深，培養(yǎng)基無(wú)色，菌絲生長(zhǎng)致密，菌落表面 棉絮狀；分生抱子鑲刀形，略彎曲，兩端漸尖，0-3個(gè)分隔，多數(shù)無(wú)隔，產(chǎn)抱細(xì)胞單瓶梗；厚垣 抱子球形。
[0008] -種上述新菌株的獲取方法，包括W下步驟：
[0009] 采樣；從唐山煤礦區(qū)周圍的草地，按照梅花型取樣方法取O-IOcm表層混合樣1份， 取樣完成后，在24小時(shí)內(nèi)迅速進(jìn)行下述步驟篩選出所述新菌株；
[0010] 富集：取Ig所述混合樣，采用無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基獲得富集菌液，取ImL富集菌液接 種到高氏一號(hào)H種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0011] 其中，所述無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基包括；M拆〇4. %00. 2g、CaCls. 2&00. 02g、 FeS〇4. 7&00. Olg、KH2PO4O. 4g、化2冊(cè)〇4〇. 6g、MnS〇4. &00. 02g NH4NO3I. Og、蒸觸水 IL ;高氏 一號(hào)培養(yǎng)基包括；可溶性淀粉2g、氯化軸0. 05g、硝酸鐘0. llg、磯酸氨二鐘0. 05g、硫酸鎮(zhèn) 0. 05g、硫酸亞鐵 0. 001、瓊脂 1. 5-2g、蒸觸水 IOOml,抑7. 4-7. 6 ;
[0012] 篩選與純化；將上述在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的富集菌液經(jīng)含PAHs的無(wú)機(jī)鹽 培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并經(jīng)多次轉(zhuǎn)接純化后，獲得多株純菌；
[0013] 馴化；將已篩選出的所有純菌接種到表層含120ug PAHs的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中 進(jìn)行沖擊，3(TC下培養(yǎng)7d后觀察菌落生長(zhǎng)狀況，得到目標(biāo)降解菌株；
[0014] 將所述目標(biāo)降解菌株接種到表層含5環(huán)W上單體PAHsl^g、24ug、48ug的無(wú)機(jī)鹽 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行逐級(jí)馴化，3(TC下恒溫培養(yǎng)7d后，生長(zhǎng)良好，將馴化后的菌株用甘油冷 凍保存；
[0015] 降解；目標(biāo)降解菌株經(jīng)接種至含5環(huán)單體PAHs的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中驗(yàn)證其降解 能力，最后得到一株能夠降解5環(huán)W上PAHs單體的高效降解菌株ZH-肥。
[0016] 所述的新菌株的應(yīng)用，包括；所述新菌株用于降解5環(huán)W上多環(huán)芳姪，其中所述5 環(huán)W上多環(huán)芳姪分別為苯并化）英意、二苯并（a, h)意、苯并（a)巧、巧并（1，2, 3-cd)巧、 苯并（g，h，U巧。
[0017] 所述的新菌株的應(yīng)用，包括；所述新菌株用于降解8種多環(huán)芳姪混合物；其中所述 8種多環(huán)芳姪混合物包括：巧、屈、苯并（a)意、苯并化）英意、二苯并（a,h)意、苯并（a)巧、 巧并（l，2,3-cd)巧、苯并（g，h，U巧。
[0018] 所述的新菌株的應(yīng)用，包括；所述新菌株在添加淀粉的情況下用于降解8種多環(huán) 芳姪混合物。
[0019] 上述技術(shù)方案提供的降解5環(huán)W上多環(huán)芳姪的新菌株及其獲取方法、應(yīng)用，通過(guò) 采樣、富集、篩選與純化、馴化、降解，獲得新菌株，可W高效降解5環(huán)PAHs單體，W及8種多 環(huán)芳姪混合物，并在添加淀粉的情況下提高對(duì)8種多環(huán)芳姪混合物的降解率，可W有效修 復(fù)多環(huán)芳姪污染場(chǎng)地。
[0020] 新菌株；ZH-肥
[0021] 拉下文名；Fusarium dlaminii
[0022] 保藏單位；中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中也CGMCC [002引保藏日期：2014年06月11日
[0024] 保藏編號(hào)；CGMCC NO. 9316

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為本發(fā)明提供的新菌株的一種形態(tài)示意圖；
[0026] 圖2為本發(fā)明提供的新菌株在不同淀粉添加量的情況下對(duì)8種多環(huán)芳姪總量降解 的影響直方圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍，下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方 法。
[0028] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種降解5環(huán)W上多環(huán)芳姪和8種多環(huán)芳姪混合物的新菌株 的獲取方法。所述方法包括W下步驟：
[002引 （1)采樣
[0030] 從唐山煤礦區(qū)周圍的草地，按照梅花型取樣方法取O-IOcm表層混合樣1份。取完 后在24小時(shí)內(nèi)完成步驟（2)-(4)篩選菌株。
[0031] 該里所述的煤礦區(qū)為區(qū)內(nèi)含有鋼鐵廠和焦化廠等工廠的煤礦區(qū)。
[0032] (2)富集
[0033] 取Ig所述混合樣，采用無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基獲得富集菌液，取ImL富集液接種到高 氏一號(hào)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0034] 其中，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基包括；M拆〇4. 7&00. 2g、CaCl2. 2&00. 02g、FeS〇4. 7&00. Olg、 KH2PO4O. 4g、化2冊(cè)〇4〇. 6g、MnS〇4. &00. 02gNH4N〇3l. Og、蒸觸水 11。
[00巧]高氏一號(hào)培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉2g、氯化軸0. 05g、硝酸鐘0. llg、磯酸氨二鐘 0. 05g、硫酸鎮(zhèn)0. 05g、硫酸亞鐵0. 001、瓊脂1. 5-2g、蒸觸水IOOml,抑7. 4-7. 6。
[003引 做篩選與純化
[0037] 將步驟（2)中在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的富集菌液經(jīng)含PAHs的無(wú)機(jī)鹽固體培 養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并經(jīng)多次轉(zhuǎn)接純化后，獲得多株純菌。
[0038] (4)馴化
[003引將做中得到的多種菌株經(jīng)8種PAHs混合物進(jìn)行大劑量沖擊，即將已篩選出的所 有純菌接種到表層含120ug PAHs的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中進(jìn)行沖擊，3(TC下培養(yǎng)7d后觀察 菌落生長(zhǎng)狀況，得到目標(biāo)降解菌株。該菌株是經(jīng)高氏一號(hào)培養(yǎng)基富集篩選出來(lái)的。
[0040] 將所述目標(biāo)降解菌株接種到表層含5環(huán)W上單體PAHsl^g、24ug、48ug的無(wú)機(jī)鹽 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行逐級(jí)馴化，3(TC下恒溫培養(yǎng)7d后，生長(zhǎng)良好，將馴化后的菌株用甘油冷 凍保存。
[00川其中，所述無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基包括；M拆04.%00. 2g、CaCl2. 2&00. 02g、 FeS04. 7&00. Olg、KH2PO4O. 4g、化2冊(cè)040. 6g、MnS04. &00. 02g NH4NO3I. Og、瓊脂 15 ?20g、蒸 觸水IL。
[004引 妨降解
[004引將（4)中得到的目標(biāo)降解菌株分別接種至含5環(huán)W上單體PAHs和8種PAHs混合 物的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中驗(yàn)證其降解能力，最后得到一株能夠降解5環(huán)PAHs單體和8種 PAHs混合物的高效降解菌株，將其命名為；ZH-肥，其分類名為：化sarium dlaminii ;該菌 于2014年06月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中也（CGMCC)，其 保藏號(hào) CGMCC No. 9316。
[0044] W下為ZH-肥菌株的鑒定：
[004引 1、菌株形態(tài)
[0046] 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，菌株ZH-肥在馬鈴墓葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA)上3(TC培養(yǎng) 4d后，菌落直徑為3. 2cm。菌株產(chǎn)生紫色色素，基物表面黃色，背面色深，培養(yǎng)基無(wú)色，菌絲 生長(zhǎng)致密，菌落表面棉絮狀；分生抱子鑲刀形，略彎曲，兩端漸尖，0-3個(gè)分隔，多數(shù)無(wú)隔。產(chǎn) 抱細(xì)胞單瓶梗。厚垣抱子球形。
[0047] 2、菌株ZH-肥的18S rDNA基因的PCR擴(kuò)增和序列分析
[004引 W菌株ZH-肥的基因組DNA為模板，用真菌的通用引物（ITS1、ITS4)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增片段回收、測(cè)序，根據(jù)18S rDNA的測(cè)序結(jié)果，利用Blast 軟件在GenBank中與其它的18S rRNA序列進(jìn)行同源性比較，選擇相近的序列與菌株的序列 用MEGA軟件構(gòu)建菌株的18S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。鑒定為鑲刀菌屬，化sarium dlaminii，同 源性為99%。菌株ZH-肥的18S rDNA序列長(zhǎng)度為53化P，其DNA序列詳見(jiàn)序列表。
[0049] 本發(fā)明實(shí)施例還提供了上述新菌株在降解5環(huán)W上多環(huán)芳姪的應(yīng)用，其應(yīng)用實(shí)驗(yàn) 如下所述：
[0050] 將上述步驟（4)中多環(huán)芳姪單體馴化后保存的ZH-肥單菌落接種到高氏一號(hào)培養(yǎng) 基中活化4她后得到富集菌液。
[0051] 實(shí)例A =ZH-肥對(duì)5環(huán)W上多環(huán)芳姪類化合物單體的降解
[0052] 實(shí)施例A中應(yīng)用的降解公式為：降解效率=(培養(yǎng)后不接菌8種多環(huán)芳姪類的 總含量-培養(yǎng)后接菌8種多環(huán)芳姪類的總含量）-培養(yǎng)后不接菌8種多環(huán)芳姪類的總含 量X 100%。下述中的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基與上述步驟（2)中的相同。
[0053] (Al) ZH-H2對(duì)苯并K英意單體的降解
[0054] 接種10 %富集菌液至20血含有l(wèi)Omg/L苯并K英意的滅菌水相無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基 中做實(shí)驗(yàn)組，另做不加富集菌液的對(duì)照組，同時(shí)在150rmp，3(TC搖床中避光振蕩培養(yǎng)7天。 [00巧]培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，取25ml色譜純正己焼溶液加到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的H角瓶中，超 聲提取5分鐘，使粘在壁上PAHs全部浸提到正己焼溶液中，再將H角瓶置于250rmp振蕩器 中，震蕩提取40分鐘后，再次超聲提取5分鐘后，吸取上層正己焼溶液Iml轉(zhuǎn)移至2ml頂空 進(jìn)樣瓶中，采用氣普-質(zhì)譜聯(lián)用儀分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組溶液中多環(huán)芳姪的殘留率，然 后應(yīng)用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的殘留率，根據(jù)降解公式，計(jì)算降解效率。
[0056] 進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。苯并K英意的降解率91 %。
[0057] (A2)ZH-H2對(duì)苯并巧單體的降解
[0058] 接種10%富集菌液至20mL含有IOmg/苯并巧的滅菌水相無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中做 實(shí)驗(yàn)組，另做不加富集菌液的對(duì)照組，在150rmp，3(TC搖床中避光振蕩培養(yǎng)7天，提取PAHs 的方法同實(shí)例A (Al)，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組溶液中多環(huán)芳姪類化合物的殘留率，然后應(yīng) 用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的殘留率，根據(jù)降解公式，計(jì)算降解效率。進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。苯并巧的降解率56%。
[005引 （A3) ZH-肥對(duì)巧并巧單體的降解
[0060] 接種10%富集菌液至20mL含有l(wèi)Omg/L巧并巧的滅菌水相無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中做 實(shí)驗(yàn)組，另做不加富集菌液的對(duì)照組，在150rmp，3(TC搖床中避光振蕩培養(yǎng)7天，提取PAHs 的方法同實(shí)例A (Al)，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組溶液中多環(huán)芳姪類化合物的殘留率，然后應(yīng) 用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的殘留率，根據(jù)降解公式，計(jì)算降解效率。進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。巧并巧的降解率41%。
[0061] (A4) ZH-H2對(duì)二苯并意單體的降解
[006引接種10%富集菌液至20mL含有l(wèi)Omg/L二苯并意的滅菌水相無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基 中做實(shí)驗(yàn)組，另做不加富集菌液的對(duì)照組，在150rmp，3(TC搖床中避光振蕩培養(yǎng)7天，提取 PAHs的方法同實(shí)例A(Al),分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組溶液中多環(huán)芳姪類化合物的殘留率， 然后應(yīng)用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的殘留率，根據(jù)降解公式，計(jì)算降解效率。進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié) 果取平均值。二苯并意的降解率61%。
[006引 （A5) ZH-H2對(duì)苯并巧單體的降解
[0064] 接種10%富集菌液至20mL含有l(wèi)Omg/L苯并巧的滅菌水相無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中做 實(shí)驗(yàn)組，另做不加富集菌液的對(duì)照組，在150rmp，3(TC搖床中避光振蕩培養(yǎng)7天，提取PAHs 的方法同實(shí)例A (Al)，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組溶液中多環(huán)芳姪類化合物的殘留率，然后應(yīng) 用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的殘留率，根據(jù)降解公式，計(jì)算降解效率。進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。苯并巧的降解率52%。
[0065] 實(shí)例B、本發(fā)明實(shí)施例還提供了上述新菌株ZH-肥在對(duì)8種多環(huán)芳姪混合物的降解 應(yīng)用。
[0066] l〇mg/L8種多環(huán)芳姪混合液是指巧、屈、苯并（a)意、苯并似英意、二苯并（a, h) 意、苯并（a)花、巧并（l，2,3-cd)花、苯并（g，ha)巧8種均勻混合后總量的濃度lOmg/L。
[0067] 接種10%富集菌液至20血含有10mg/L8種多環(huán)芳姪混合液的滅菌水相無(wú)機(jī)鹽液 體培養(yǎng)基中做實(shí)驗(yàn)組，另做不加富集菌液的對(duì)照組，在150rmp，3(TC搖床中避光振蕩培養(yǎng)7 天，提取PAHs的方法同實(shí)例A (Al)，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組溶液中8種多環(huán)芳姪的殘留 率，然后應(yīng)用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的殘留率，根據(jù)降解公式，計(jì)算總降解效率。進(jìn)行五次重復(fù)實(shí) 驗(yàn)，結(jié)果取平均值。8種多環(huán)芳姪總降解率48%。
[0068] 實(shí)施例B中的降解公式為：降解效率=(培養(yǎng)后不接菌8種多環(huán)芳姪類的總 含量-培養(yǎng)后接菌8種多環(huán)芳姪類的總含量）-培養(yǎng)后不接菌8種多環(huán)芳姪類的總含 量 X100%。
[0069] 實(shí)例C、本發(fā)明實(shí)施例還提供了上述新菌株ZH-肥在添加淀粉后對(duì)8種多環(huán)芳姪混 合物的降解應(yīng)用。
[0070] (1)準(zhǔn)備5個(gè)H角瓶，處理編號(hào)分別為CK、DO、D1、D2、D3。其中CK為不加菌不加 淀粉的對(duì)照組。向3個(gè)H角瓶D1、D2、D3中分別依次加入0. 005g、0. 01g、0. 02g滅菌淀粉， 然后向D0、D1、D2、D3該4個(gè)H角瓶中分別加入2血ZH-肥菌液向3個(gè)試管中分別加入8種 PAHs混合液（如實(shí)施例B)和滅菌的水相無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，再向5個(gè)H角瓶中分別加入 8種PAHs混合液（如實(shí)施例B) W及滅菌的水相無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基然后向每個(gè)試管中加入2mL ZH-肥菌液，使5個(gè)H角瓶試管的終體積均為20血。其中，DO、Dl、D2、D3中8種PAHs總量 的終濃度為 l〇mg/L(CO = lOmg/L)，淀粉終濃度分別為 0mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L。
[0071] (2)5個(gè)H角瓶置于150rmp，3(TC搖床中避光振蕩培養(yǎng)7天。提取PAHs的方法同 實(shí)例A(Al)，測(cè)定溶液中8種多環(huán)芳姪總量的殘留，應(yīng)用對(duì)照組的殘留率W及D0、D1、D2、D3 的殘留率，分別計(jì)算DO、D1、D2、D3的總降解效率。
[0072] 進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。降解率的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。無(wú)淀粉添加處理 DO的PAHs降解率為39%。Dl處理的降解率為51%，D2處理的降解率為65%，D3處理的 降解率高達(dá)84% (見(jiàn)圖2)。相比較無(wú)淀粉添加的降解率增加了 36%。該說(shuō)明在降解體系 中添加淀粉，ZH-H2可W顯著促進(jìn)對(duì)8種混合多環(huán)芳姪的降解。
[0073] 8種PAHs總量的降解率計(jì)算；降解效率=(培養(yǎng)后不接菌8種多環(huán)芳姪類的總 含量-培養(yǎng)后接菌8種多環(huán)芳姪類的總含量）-培養(yǎng)后不接菌8種多環(huán)芳姪類的總含 量 X100%。
[0074] W上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何 熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明掲露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)所述W權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
[00 巧] 序列表 531 DNA

【權(quán)利要求】
1. 一種新菌株，其特征在于，所述新菌株保藏名稱為：ZH-H2,分類名稱為：Fusarium dlaminii，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期：2014年 06 月 11 日，保藏號(hào)：CGMCC No. 9316。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新菌株，其特征在于，所述新菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng) 基PDA培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)4d后，菌落直徑為3. 2cm ;菌株產(chǎn)生紫色色素，基物表面黃色，背 面色深，培養(yǎng)基無(wú)色，菌絲生長(zhǎng)致密，菌落表面棉絮狀；分生孢子鐮刀形，略彎曲，兩端漸尖， 0-3個(gè)分隔，多數(shù)無(wú)隔，產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗；厚垣孢子球形。
3. -種權(quán)利要求1-2所述的新菌株的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟： 米樣：從唐山煤礦區(qū)周圍的草地，按照梅花型取樣方法取〇_l〇cm表層混合樣1份，取樣 完成后，在24小時(shí)內(nèi)迅速進(jìn)行下述步驟篩選出所述新菌株； 富集：取lg所述混合樣，采用無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基獲得富集菌液，取lmL富集菌液接種到 高氏一號(hào)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)； 其中，所述無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基包括:MgS04. 7H200. 2g、CaCl2. 2H200. 02g、 FeS04. 7H200. Olg、KH2P040. 4g、Na2HP040 . 6g、MnS04. H200. 02g NH4N031. 0g、蒸餾水 1L ;高氏 一號(hào)培養(yǎng)基包括：可溶性淀粉2g、氯化鈉0. 05g、硝酸鉀0. llg、磷酸氫二鉀0. 05g、硫酸鎂 〇? 05g、硫酸亞鐵 0? 001、瓊脂 1. 5-2g、蒸餾水 100ml，pH7. 4-7. 6 ; 篩選與純化：將上述在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的富集菌液經(jīng)含PAHs的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng) 基進(jìn)行篩選，并經(jīng)多次轉(zhuǎn)接純化后，獲得多株純菌； 馴化：將已篩選出的所有純菌接種到表層含120ug PAHs的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中進(jìn)行 沖擊，30°C下培養(yǎng)7d后觀察菌落生長(zhǎng)狀況，得到目標(biāo)降解菌株；所述無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基包 括：MgS04. 7H200. 2g、CaCl2. 2H200. 02g、FeS04. 7H200. 01g、KH2P040. 4g、Na2HP040. 6g、MnS04. H200. 02g NH4N031. 0g、瓊脂 15 ?20g、蒸餾水 1L ; 將所述目標(biāo)降解菌株接種到表層含5環(huán)以上單體PAHsl2ug、24ug、48ug的無(wú)機(jī)鹽固體 培養(yǎng)基中進(jìn)行逐級(jí)馴化，30°C下恒溫培養(yǎng)7d后，生長(zhǎng)良好，將馴化后的菌株用甘油冷凍保 存； 降解：目標(biāo)降解菌株經(jīng)接種至含5環(huán)單體PAHs的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中驗(yàn)證其降解能 力，最后得到一株能夠降解5環(huán)以上PAHs單體的高效降解菌株ZH-H2。
4. 一種權(quán)利要求1-2所述的新菌株的應(yīng)用，其特征在于，包括：所述新菌株用于降解5 環(huán)以上多環(huán)芳烴，其中所述5環(huán)以上多環(huán)芳烴為苯并（k)熒蒽、二苯并（a，h)蒽、苯并（a) 芘、茚并（l，2,3-cd)芘、苯并（g，h，i)茈。
5. -種權(quán)利要求1-2所述的新菌株的應(yīng)用，其特征在于，包括：所述新菌株用于降解8 種多環(huán)芳烴混合物；其中所述8種多環(huán)芳烴混合物包括：芘、屈、苯并（a)蒽、苯并（k)熒蒽、 二苯并（a，h)蒽、苯并（a)花、諱并（l，2,3_cd)花、苯并（g，h，i)花。
6. -種權(quán)利要求1-2所述的新菌株的應(yīng)用，其特征在于，包括：所述新菌株在添加淀粉 的情況下用于降解8種多環(huán)芳烴混合物。
【文檔編號(hào)】C12R1/77GK104357331SQ201410432336
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】楊志新, 李玉靈, 趙歐亞, 馮圣東, 王偉, 石維, 嚴(yán)愛(ài)華 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)