擴(kuò)展青霉fp2菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種擴(kuò)展青霉菌株，命名為擴(kuò)展青霉FP2，學(xué)名為Penicillium expansum FP2，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2014040。采用本發(fā)明篩選的擴(kuò)展青霉FP2菌株用于制備棒曲霉素，在制備棒曲霉素的發(fā)酵步驟中，由于采用了蘋果培養(yǎng)基，所制備的粗提取液中棒曲霉素含量是PDA液體培養(yǎng)基制備量的300倍，產(chǎn)品的成本是sigma公司同類產(chǎn)品的1/380，大大降低了產(chǎn)品的成本。CCTCC NO：M20140402014.02.19
【專利說(shuō)明】擴(kuò)展青霉FP2菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到擴(kuò)展青霉的一種菌株。

【背景技術(shù)】
[0002] 霉菌能產(chǎn)生豐富多樣的具有各種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，一些霉菌在基質(zhì)上 生長(zhǎng)時(shí)也會(huì)產(chǎn)生有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物--真菌毒素，這些毒素能引起人和動(dòng)物發(fā)生各種疾 病。棒曲霉素（Patulin，PAT)，又稱展青霉素，是一種具有較強(qiáng)毒性的真菌代謝產(chǎn)物，晶體 無(wú)色棱形，分子式為C 7H604，分子量為154,化學(xué)名稱為4-羥基4-氫-呋喃（3, 2-碳）駢吡 喃-2(6-氫）酮[4_117(11'(?7-4-!1-;1!\11'0(3,2(3)口50^11-2(6!{)-0116]。在許多因霉菌腐敗的水 果，如蘋果、杏子、藍(lán)莓、櫻桃、葡萄、梨、桃子和李子及其制品中都有發(fā)現(xiàn)，以蘋果發(fā)霉最易 積累該種毒素。
[0003] 大量的研究表明，棒曲霉素具有基因毒性和細(xì)胞毒性，能導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA 損傷[Zhou SM等，2010]，染色體畸變和微核形成[Alves I等，2000 ;Melo FT等，2012]，并 具有致癌性，致畸性，免疫毒性和生殖毒性[Puel 0等，2010]，在動(dòng)物活體內(nèi)，會(huì)損害腎臟、 肝臟和腸等器官組織[Saxena N等，2011;Mohan HM等，2012]。因而它成為判斷食品質(zhì)量 安全的一個(gè)重要指標(biāo)，受到世界各國(guó)及國(guó)際組織的極大關(guān)注，例如歐盟在2004年就頒布了 限制含棒曲霉素食品進(jìn)口的法令。
[0004] 隨著棒曲霉素污染食品的問題日趨嚴(yán)重，對(duì)于其毒性、檢測(cè)方法和控制技術(shù)的研 究越來(lái)越廣泛。無(wú)論是基礎(chǔ)研究還是檢測(cè)和控制研究，都需要大量的毒素樣品。而市售的 棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，如：sigma公司98%以上純度的棒曲霉素 P1639-5MG(5mg)的價(jià) 格是1946.88元人民幣沖1639-101^(1011^)的價(jià)格是3601.26元人民幣。這大大增加了科 學(xué)研究工作的成本，一定程度上限制了研究工作。在食品【技術(shù)領(lǐng)域】，當(dāng)前急需解決的一個(gè)技 術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)棒曲霉素成本低、產(chǎn)量大、產(chǎn)品純度高的菌株。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題在于提供高產(chǎn)棒曲霉素的擴(kuò)展青霉FP2菌株。
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題在于為擴(kuò)展青霉FP2菌株提供一種新用途。
[0007] 解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：命名為擴(kuò)展青霉FP2菌株（Penicillium expansum FP2)，于2014年2月19日保藏于武漢武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號(hào)為 CCTCC NO :M2014040。
[0008] 擴(kuò)展青霉FP2菌株的ITS-5. 8S rDNA序列為：
[0009] ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgag ggccctttgg gtccaacctc 60 ccacccgtgt ttatttacct cgttgcttcg gcgggcccgc cttaactggc cgccgggggg 120 ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acacccccga actctgcctg aagattgtcg 180 tctgagtgaa aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt gaatcatcga 300 gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360 tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg gggacgggcc 420 cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480 tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggtga cctcggatca 540 ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 584
[0010] 擴(kuò)展青霉FP2菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)：
[0011] 按照常規(guī)操作，接種擴(kuò)展青霉FP2菌株在PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)7天，菌落直徑 為30mm，有放射狀溝紋，絨毛狀，邊緣不規(guī)則，暗綠色后變橙褐色，邊緣白色。分生孢子梗自 表生菌絲生出，單生，簇生或孢梗束狀生，分生孢子梗莖200?300 μ mX 3 μ m，頂端呈帚狀 分枝，多為兩層輪生；分生孢子橢圓形，光滑，無(wú)色，單胞，3?3. 5μηιΧ 2. 5?3μηι，形成不 規(guī)則鏈狀。
[0012] 擴(kuò)展青霉FP2菌株的篩選方法如下：
[0013] 1、分離純化
[0014] 無(wú)菌接種針蘸取不同腐爛蘋果上的霉點(diǎn)，分別劃線接種于TOA固體培養(yǎng)基平板 上，28°C培養(yǎng)。待長(zhǎng)出的菌落有明顯孢子后，無(wú)菌接種針蘸取孢子分別劃線于PDA固體培養(yǎng) 基平板，28°C培養(yǎng)5天，挑取單菌落邊緣菌絲分別于PDA斜面上28°C培養(yǎng)7天，加入10mL無(wú) 菌水，無(wú)菌接種針蘸取孢子懸液于PDA固體培養(yǎng)基平板上劃線，純化，28°C培養(yǎng)7天，分別挑 取單菌落于PDA斜面4°C冰箱保藏。
[0015] 2、篩選
[0016] 每100g去皮蘋果塊裝入250mL三角瓶中，加 8層紗布塞，121°C滅菌20分鐘，制成 無(wú)菌蘋果培養(yǎng)基；
[0017] 將分離得到的12株霉菌分別用PDA斜面28°C活化7天后，各加入無(wú)菌水制備成 濃度為10 7cfu/mL的孢子懸液，分別取lmL孢子懸液接種于100g無(wú)菌蘋果培養(yǎng)基中，28°C培 養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)8天，分別取出培養(yǎng)物，研磨，各加入100mL乙酸乙酯，180r/min避光振蕩抽 提1小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，上層有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉過濾，下層培養(yǎng)物再次用100mL 乙酸乙酯抽提2次，合并3次乙酸乙酯抽提液，用無(wú)水硫酸鈉過濾后，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥， 用15mLpH為4. 0的冰醋酸水溶液溶出，-20°C保存，每株霉菌平行2組，用0. 22 μ m水系濾膜 過濾冰醋酸水溶液溶出物，按照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2008-2007 《進(jìn)出口果汁中棒曲霉毒素的檢測(cè)方法高效液相色譜法》進(jìn)行檢測(cè)，相同條件下比較棒曲霉 素的出峰面積，峰面積最大的樣品棒曲霉素含量最多。從而篩選出產(chǎn)棒曲霉素最多的菌株， 命名為FP2菌株，鑒定，送保藏中心保藏。
[0018] 上述檢測(cè)方法中使用色譜柱為：Diamonsil?C18柱，250mmX4. 6mm(內(nèi)徑），粒 徑 5 μ m〇
[0019] 采用擴(kuò)展青霉FP2菌株制備棒曲霉素的方法如下：
[0020] 1、發(fā)酵
[0021] 每個(gè)250mL三角瓶中裝入100g去皮蘋果塊作為培養(yǎng)基，加8層紗布塞，121°C滅菌 20分鐘。將擴(kuò)展青霉FP2菌株接種PDA試管斜面，28°C活化7天，每支試管斜面加入無(wú)菌 水制備成濃度為107cfu/mL孢子懸液，每個(gè)裝100g蘋果培養(yǎng)基的三角瓶中接入lmL濃度為 10 7cfu/mL的孢子懸液，28°C避光培養(yǎng)10天，獲得培養(yǎng)物。
[0022] 2、分離
[0023] 取培養(yǎng)物，分別研磨成糊狀，每100g加入乙酸乙酯lOOmL，150?200r/min避光振 蕩抽提1小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，收集上層乙酸乙酯抽提液，下層培養(yǎng)物中加入乙酸乙 酯100mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提2小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，收集乙酸乙 酯抽提液，下層培養(yǎng)物中再加入乙酸乙酯l〇〇mL/100g，150?200r/min避光振蕩抽提1小 時(shí)，靜置5?10分鐘分層，合并三次乙酸乙酯抽提液，用無(wú)水硫酸鈉過濾，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至 干燥，用pH為4. 0的冰醋酸水溶液定溶至50mL，用0. 22 μ m水系濾膜過濾，得到棒曲霉素的 粗提取液。
[0024] 取棒曲霉素的粗提取液500yL，稀釋100倍，按照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢 疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2008-2007《進(jìn)出口果汁中棒曲霉毒素的檢測(cè)方法高效液相色譜法》檢測(cè) 其中棒曲霉素含量。
[0025] 使用的色譜柱為：Diain〇nsil(E)C18柱，250mmX4. 6mm(內(nèi)徑），粒徑5 μ m。棒曲霉 素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于Sigma公司，準(zhǔn)確吸取2mL pH為4. 0的冰醋酸水溶液，充分溶解10mg棒曲霉 素標(biāo)準(zhǔn)品，吸取其中l(wèi)mL的棒曲霉素溶液，稀釋為30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/ L的標(biāo)準(zhǔn)液，以棒曲霉素的出峰面積X為橫坐標(biāo)，棒曲霉素含量Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：
[0026] Y = 0· 4789X+0. 2114(R2 為 0· 9994)
[0027] 根據(jù)繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定出的棒曲霉素峰面積計(jì)算棒曲霉素的含量。
[0028] 3、純化
[0029] -70°C，100Pa冷凍干燥棒曲霉素粗提取液至干，用乙酸乙酯充分溶解，40°C旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)乙酸乙酯至10?15mL，200?300目硅膠柱層析純化，用丙酮與二氯甲烷體積比為1:30 的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含有棒曲霉素的情 況；將含有棒曲霉素的洗脫液合并，40°C避光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于10?15mL的石油醚與乙 酸乙酯體積比為1:1的溶劑中；再次200?300目硅膠柱層析，用石油醚與乙酸乙酯體積比 為1:1的洗脫劑洗脫，濕法裝柱，干法上樣，用薄層層析法檢測(cè)每管洗脫液中含棒曲霉素的 情況；將只含有棒曲霉素的溶液合并，避光40°C旋轉(zhuǎn)蒸干，溶于5?10mL的乙酸乙酯中，靜 止放置，得到棒曲霉素產(chǎn)物。
[0030] 上述薄層層析法的條件為：采用硅膠GF254層析板，乙酸乙酯與石油醚體積比1:2 為展開劑，展層3次，在254nm的紫外燈下，對(duì)比觀察樣品與從Sigma公司購(gòu)買棒曲霉素標(biāo) 準(zhǔn)品的R f值。
[0031] 4、鑒定
[0032] 采用核磁共振分析儀，按儀器的使用方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。用質(zhì)譜分析儀，以 ESI電離方式對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，確定產(chǎn)物的分子量。
[0033] 米用本發(fā)明篩選的擴(kuò)展青霉FP2囷株用于制備棒曲霉素，在制備棒曲霉素的發(fā)酵 步驟中，由于采用了蘋果培養(yǎng)基，所制備的粗提取液中棒曲霉素含量是PDA液體培養(yǎng)基制 備量的300倍，產(chǎn)品的成本是sigma公司同類產(chǎn)品的1/380,大大降低了產(chǎn)品的成本。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1是擴(kuò)展青霉FP2菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)照片。
[0035] 圖2是擴(kuò)展青霉FP2菌株在顯微鏡下放大400倍的菌絲及分生孢子照片。
[0036] 圖3是擴(kuò)展青霉FP2菌株基于ITS-5. 8S rDNA序列的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0037] 圖4是棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。
[0038] 圖5是采用蘋果培養(yǎng)基發(fā)酵擴(kuò)展青霉FP2菌株制備的棒曲霉素粗提取液稀釋100 倍的高效液相色譜圖。
[0039] 圖6是用擴(kuò)展青霉FP2菌株制備的棒曲霉素溶于pH為4. 0的冰醋酸水溶液的高 效液相色譜圖。
[0040] 圖7是由擴(kuò)展青霉FP2菌株制備的棒曲霉素的1H-NMR譜圖。
[0041] 圖8是由擴(kuò)展青霉FP2菌株制備的棒曲霉素的13C_NMR譜圖。
[0042] 圖9是Sigma公司公布的棒曲霉素核磁譜圖。
[0043] 圖10是由擴(kuò)展青霉FP2菌株制備的棒曲霉素的質(zhì)譜（ESI)分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
[0045] 實(shí)施例1
[0046] 命名為擴(kuò)展青霉FP2的菌株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2014040。
[0047] 擴(kuò)展青霉FP2菌株的ITS-5. 8S rDNA序列為：
[0048] ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgag ggccctttgg gtccaacctc 60 ccacccgtgt ttatttacct cgttgcttcg gcgggcccgc cttaactggc cgccgggggg 120 ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acacccccga actctgcctg aagattgtcg 180 tctgagtgaa. aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt gaatcatcga 300 gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360 tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg gggacgggcc 420 cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480 tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggtga cctcggatca 540 ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 584
[0049] 上述擴(kuò)展青霉FP2菌株的篩選方法如下：
[0050] 1、分離純化
[0051] 無(wú)菌接種針分別蘸取3個(gè)不同腐爛蘋果上的霉點(diǎn)，分別劃線接種于6個(gè)PDA固體 培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)。待長(zhǎng)出的菌落有明顯孢子后，用無(wú)菌接種針蘸取孢子分別劃線于 PDA固體培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)5天。挑取單菌落邊緣菌絲分別于12個(gè)PDA斜面上28°C培 養(yǎng)7天，加入10mL無(wú)菌水，用無(wú)菌接種針蘸取孢子懸液于12個(gè)PDA固體培養(yǎng)基平板上劃線， 純化。28°C培養(yǎng)7天，分別挑取單菌落于PDA斜面4°C冰箱保藏。
[0052] 2、篩選
[0053] 每100g去皮蘋果塊裝入250mL三角瓶中，加8層紗布塞，121°C滅菌20分鐘，制成 無(wú)菌蘋果培養(yǎng)基。
[0054] 將分離得到的12株霉菌分別用PDA斜面28°C活化7天，各加入無(wú)菌水制備成濃 度為10 7cfu/mL的孢子懸液，分別取lmL孢子懸液接種于100g無(wú)菌蘋果培養(yǎng)基中，28°C培 養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)8天，分別取出培養(yǎng)物，研磨，加入100mL乙酸乙酯，150?200r/min避光 振蕩抽提1小時(shí)，靜置5?10分鐘分層，上層有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉過濾，下層培養(yǎng)物再次 用100mL乙酸乙酯抽提2次，合并3次乙酸乙酯抽提液，用無(wú)水硫酸鈉過濾后，40°C旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)至干燥，用15mL pH為4.0的冰醋酸水溶液溶出，-20°C保存。每株霉菌平行2組。用 0. 22 μ m水系濾膜過濾冰醋酸水溶液溶出物，按照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)SN/T2008-2007《進(jìn)出口果汁中棒曲霉毒素的檢測(cè)方法高效液相色譜法》進(jìn)行檢測(cè)，相 同條件下比較棒曲霉素的出峰面積，峰面積最大的樣品棒曲霉素含量最多。從而篩選出產(chǎn) 棒曲霉素最多的菌株，命名為FP2菌株。
[0055] 上述檢測(cè)方法中使用色譜柱為：Diamonsil?C18柱,250mmX4. 6mm(內(nèi)徑），粒 徑 5 μ m〇
[0056] 對(duì)采用本實(shí)施例篩選的擴(kuò)展青霉FP2菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定以及分子生物學(xué)分 類鑒定，各種試驗(yàn)情況如下：
[0057] 1、形態(tài)學(xué)鑒定
[0058] 按照常規(guī)操作，擴(kuò)展青霉FP2在PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)7天，菌落直徑為30mm，有 放射狀溝紋，絨毛狀，邊緣不規(guī)則，暗綠色后變橙褐色，邊緣白色，菌落形態(tài)照片見圖1。分生 孢子梗自表生菌絲生出，單生，簇生或孢梗束狀生，見圖2箭頭A所示；分生孢子梗莖200? 300 μ mX 3 μ m，頂端呈帚狀分枝，多為兩層輪生，見圖2箭頭B所示；分生孢子呈橢圓形，光 滑，無(wú)色，單胞3?3. 5μπιΧ2. 5?3μπι，形成不規(guī)則鏈狀，見圖2箭頭C所示（圖2中標(biāo) 尺為20 μ m)。
[0059] 2、分子生物學(xué)分類鑒定
[0060] 采用ITS-5. 8S rDNA序列進(jìn)行分類鑒定：采用CTAB法提取基因組DNA，20 μ L的 PCR反應(yīng)體系，具體見表1，其中引物ITS1的堿基序列為5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，引 物 ITS4 的堿基序列為 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0061] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種擴(kuò)展青霉菌株，命名為擴(kuò)展青霉FP2,學(xué)名為Penicillium expansum FP2,保藏 編號(hào)為CCTCC NO :M2014040,擴(kuò)展青霉FP2菌株的ITS-5. 8S rDNA序列為： ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgag ggccctttgg gtccaacctc 60 ccacccgtgt ttatttacct cgttgcttcg gcgggcccgc cttaactggc cgccgggggg 120 ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acacccccga actctgcctg aagattgtcg 180 tctgagtgaa aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt gaatcatcga 300 gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360 tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg gggacgggcc 420 cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480 tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggtga cctcggatca 540 ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 584〇
2. 權(quán)利要求1所述的擴(kuò)展青霉FP2菌株在制備棒曲霉素中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK104250619SQ201410408759
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】張曉瑞, 郭玉蓉, 馬瑜, 柴永海 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)