專利名稱：一株嗜松青霉及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用纖維素生物質(zhì)產(chǎn)酶及菌體蛋白的的方法。具體涉及利用嗜松青霉菌iPenicilliwn pinophilum)轉(zhuǎn)化纖維素生物質(zhì)高溫?zé)峤猱a(chǎn)物內(nèi)醚糖或熱解液產(chǎn)纖維素酶和菌絲體。
背景技術(shù)：
纖維素類生物質(zhì)是地球上最具開(kāi)發(fā)潛力的重要資源之一。隨著人口的增長(zhǎng)和化石資源的減少，開(kāi)發(fā)高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類等可再生資源的方法日益重要。對(duì)纖維素類生物質(zhì)的有效利用對(duì)緩解能源危機(jī)、環(huán)境問(wèn)題等有著重要的意義。
纖維素類生物質(zhì)主要指樹(shù)木、竹類、農(nóng)作物稻桿等(Mckendry P. Energy production from biomass (part I) : overview of biomass[J] . Bioresource Technology，2002, 83 :37_46)。研究表明，通過(guò)控制熱解條件，可以快速有效地將纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成含有高濃度內(nèi)醚糖(1，6-脫水-β-D-吡喃葡萄糖)的熱解液。
纖維素?zé)峤庵饕a(chǎn)物內(nèi)醚糖及熱解液本身的生物利用是人們近期關(guān)注的焦點(diǎn)之一。Nakagawa用內(nèi)醚糖作為唯一的碳源進(jìn)行了微生物的同化測(cè)試，僅發(fā)現(xiàn)曲霉屬 Aspergillus (I株)，假絲酵母屬Cryptococcus (I株),畢赤酵母屬Pichia (I株)，擲孢酵母屬株)菌能夠利用內(nèi)醚糖。其中土曲霉如/76 /沿77^/5· terreus利用內(nèi)醚糖轉(zhuǎn)化為衣康酸(Nakagawa M, Sakai Y, Yasui T. Itaconic acid fermentation of levoglucosan. Journal of Fermentation Technology, 1984, 62: 201-203)。
黑曲霉和土曲霉對(duì)脫水內(nèi)醚糖的同化作用在后來(lái)的研究中也有所發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)誘變的菌株45/76 /沿77" niger CBX-209可轉(zhuǎn)化內(nèi)醚糖為朽1檬酸(轉(zhuǎn)化率87. 5%) (Zhuang XL , Zhang HX, Yang J Z et al. preparation of Levoglucosan by pyrolysis of cellulose and its citric acid fermentation[J]. Bioresource Technology, 2001,79:63-66)。余志晟以脫水內(nèi)醚糖為唯一碳源對(duì)中國(guó)三大菌庫(kù)(CGMCC，ACCC, CICC)的89 種菌進(jìn)行了同化測(cè)試，發(fā)現(xiàn)了七株對(duì)內(nèi)醚糖有同化能力的菌株分別是擲孢酵母屬 {Sporobolomyces) I 株，紅酵母屬 iRhodotorula') I 株,根霉屬{Rhizopus') I 株，紅曲霉屬 (.Monascus) I株。他的后續(xù)工作對(duì)自然界319份土樣進(jìn)行了同化內(nèi)醚糖微生物的篩選,結(jié)果表明在77份土樣中可觀察到有明顯的微生物生長(zhǎng)。其中菌株對(duì)內(nèi)醚糖的利用率為64. 12% (余志晟，纖維素?zé)峤猱a(chǎn)物內(nèi)醚糖的微生物同化與乙醇發(fā)酵測(cè)試 [J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27(6) : 342-349)。目前，嗜松青霉對(duì)內(nèi)醚糖或熱解液的轉(zhuǎn)化利用還未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明以內(nèi)醚糖或纖維素?zé)峤庖簽樘荚矗?jīng)培養(yǎng)可得到大量的嗜松青霉菌體和發(fā)酵液。其菌株在南方紅豆杉的根際也具有高效解磷的作用，從而促進(jìn)南方紅豆杉的生長(zhǎng)(任嘉紅，茹文明，張建國(guó)等.一種南方紅豆杉根際高效解磷嗜松青霉及其應(yīng)用.[P]，中國(guó)專利，CN102229891, 2011)。其液體發(fā)酵代謝物對(duì)植物寄生蟲(chóng)，特別是對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有毒力高、殺線蟲(chóng)效果明顯的突出特點(diǎn)(段玉璽，馬希斌，陳立杰.一種具殺線蟲(chóng)活力的青霉屬真菌及其制備方法和利用[P]，中國(guó)專利，CN1944628A，2007)。因此嗜松青霉是一種應(yīng)用潛力很大的微生物。
以纖維素?zé)峤獾玫降膬?nèi)醚糖或熱解液為碳源培養(yǎng)嗜松青霉，可使熱解液及內(nèi)醚糖得到有效的利用，變廢為寶，為充分利用生物質(zhì)資源提供有效的新途徑。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一株對(duì)纖維素生物質(zhì)的熱解主要產(chǎn)物一內(nèi)醚糖和熱解液能有效利用的嗜松青霉菌株iPenicillium pinophilum),以得到包括菌絲體在內(nèi)的發(fā)酵液和含纖維素酶的酶液。
本發(fā)明所述株嗜松青霉^Penicillium pinophilum) ZS2,保藏號(hào)為CGMCC NO. 6366。
本發(fā)明還公開(kāi)了嗜松青霉CGMCC NO. 6366在制備纖維素酶中的應(yīng)用。
利用嗜松青霉CGMCC NO. 6366制備纖維素酶的方法，是將嗜松青霉CGMCC NO. 6366 接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)I 一 5天，得到含纖維素酶的發(fā)酵液；所說(shuō)的產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為(W/W) 2%內(nèi)醚糖、1%蛋白胨、O. 3%MgS04、0. 5% KH2PO4,O.5%Κ2ΗΡ04、ρΗ3· 0-7. O ；或者是4% 纖維素?zé)峤庖骸?% 蛋白胨、O. 3%MgS04、0. 5% KH2PO4,0. 5%Κ2ΗΡ04、ρΗ3· 0-7. O。
菌體的篩選過(guò)程自南京師范大學(xué)校內(nèi)有機(jī)質(zhì)豐富的地方取土樣，將土樣用無(wú)菌水做成菌懸液，取上清液于固體平板上涂布(含1%內(nèi)醚糖、2%瓊脂)，長(zhǎng)出菌體后，對(duì)菌體單獨(dú)劃線分離純化，最后將純化好的菌體接入含不同濃度內(nèi)醚糖的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣 HPLC檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)其中菌株ZS2具有同化內(nèi)醚糖的能力。并且在內(nèi)醚糖濃度為2% (W/W) 時(shí)利用率最高。該菌在4%纖維素?zé)峤庖号囵B(yǎng)基中利用率也較高。
菌體生長(zhǎng)特點(diǎn)嗜松青霉菌在30°C培養(yǎng)時(shí)先長(zhǎng)出白色絲狀菌落，然后逐漸變成黃綠色，最后在菌落中間部位長(zhǎng)出綠色或暗綠色的孢子。分生孢子為球形或卵圓形。結(jié)合形態(tài)分析和18SrDNA序列測(cè)定及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，鑒定該菌為嗜松青霉菌株 pinophilum)。
2012年7月16日將菌株ZS2提交到中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏,保藏號(hào)為CGMCC NO. 6366 ;分類命名為鴻松著霉Penicillium pinophilum ;保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
嗜松青霉菌的酶活力測(cè)定采用DNS方法200ul O. 2%的七葉苷加入500ul的酶液，50°C水浴30min，加入Iml DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm測(cè)定吸光值，計(jì)算酶活力單位。
本發(fā)明中所提到的熱解液是由本實(shí)驗(yàn)室制得，具體是將秸桿、竹子、木材等農(nóng)業(yè)廢料在100°C的條件下烘干并粉碎，利用管式爐熱解反應(yīng)器(主要由管式爐熱解器、電加熱器、 溫控儀、冷凝和真空系統(tǒng)組成)在高溫條件下進(jìn)行熱解，收集冷凝得到的組分即為熱解液。


圖I 2%內(nèi)醚糖發(fā)酵液發(fā)酵前的HPLC分析。
圖2 2%內(nèi)醚糖發(fā)酵液發(fā)酵后的HPLC分析(120h)。
圖34%纖維素?zé)峤庖喊l(fā)酵前的HPLC圖。
圖44%纖維素?zé)峤庖喊l(fā)酵后的HPLC圖(120h)。
圖5嗜松青霉在以2%內(nèi)醚糖為碳源的發(fā)酵液中的生物量變化。
圖6嗜松青霉在以2%內(nèi)醚糖為碳源的發(fā)酵液中的生物量變化。
圖7嗜松青霉轉(zhuǎn)化內(nèi)醚糖產(chǎn)葡萄糖苷酶的進(jìn)程。
圖8嗜松青霉轉(zhuǎn)化纖維素?zé)峤庖寒a(chǎn)β_葡萄糖苷酶的進(jìn)程。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)為本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，舉例是為了說(shuō)明本發(fā)明的過(guò)程，而非僅限于實(shí)施例。以下實(shí)施例所說(shuō)的菌體或菌液均指嗜松青霉QPeniCiIlium pinophilum)。實(shí)施例中纖維素酶活力測(cè)定以葡萄糖苷酶為例。
實(shí)施例I :配制O. 2%內(nèi)醚糖(W/W)的發(fā)酵液培養(yǎng)基，配方中的其他成份為1%蛋白胨、O. 1%ΚΗ2Ρ04、O.04%MgS04、0. 01%FeS04, pH5. 0.接入 10% 體積的菌液，于 30°C、180rpm 動(dòng)態(tài)培養(yǎng) 3 天，經(jīng) HPLC檢測(cè)，內(nèi)醚糖利用率為98%。
實(shí)施例2 配制20%內(nèi)醚糖(W/W)的發(fā)酵液培養(yǎng)基，配方中的其他成分同實(shí)施例1，接入10%體積的菌液，300C、180rpm動(dòng)態(tài)培養(yǎng)6天，經(jīng)HPLC檢測(cè)，內(nèi)醚糖的利用率為83%。
實(shí)施例3 配制2%內(nèi)醚糖(W/W)的發(fā)酵液培養(yǎng)基，配方中的其他成分同實(shí)施例1，接入10%體積的菌液，300C、180rpm動(dòng)態(tài)培養(yǎng)5天，HPLC檢測(cè)內(nèi)醚糖的利用率為100%，內(nèi)醚糖的利用率見(jiàn)圖 I和圖2，嗜松青霉的生物量變化見(jiàn)圖5。
實(shí)施例4 發(fā)酵液配方同實(shí)施例3，從固體斜面接入菌體，30°C、180rpm動(dòng)態(tài)培養(yǎng)5天，HPLC檢測(cè)內(nèi)醚糖的利用率為82%。
實(shí)施例5 發(fā)酵液配方同實(shí)施例3，但培養(yǎng)基pH為3. 0，接入10%的菌液，30 0C、180rpm動(dòng)態(tài)培養(yǎng)5 天，HPLC檢測(cè)內(nèi)醚糖的利用率為81%。
實(shí)施例6:發(fā)酵液配方同實(shí)施例3，但調(diào)pH為7. 0，內(nèi)醚糖為發(fā)酵底物的發(fā)酵液培養(yǎng)基，具體的同實(shí)施例3，接入10%的菌液，300C、180rpm動(dòng)態(tài)培養(yǎng)5天，HPLC檢測(cè)內(nèi)醚糖的利用率為87%。
實(shí)施例7 實(shí)施例I中的O. 2%內(nèi)醚糖換成O. 5%熱解液(5%活性炭脫毒)，HPLC檢測(cè)熱解液中內(nèi)醚糖的利用率為82%。
實(shí)施例8:實(shí)施例2中的20%內(nèi)醚糖換成10%熱解液(5%活性炭脫毒)，HPLC檢測(cè)，熱解液中內(nèi)醚糖的利用率為70%。
實(shí)施例9:實(shí)施例3中的2%內(nèi)醚糖換成4%熱解液(5%活性炭脫毒)，HPLC檢測(cè)熱解液中內(nèi)醚糖的利用率為90%.熱解液中內(nèi)醚糖的利用率見(jiàn)圖3和圖4，菌體生物量變化見(jiàn)圖6。
實(shí)施例10 配制2%內(nèi)醚糖(W/W)的產(chǎn)酶 培養(yǎng)基，配方中的其他成份為為1%蛋白胨，O. 3%酵母粉，O.3% 無(wú)水 MgS04,0. 5% KH2P04,0. 5%K2HP04, pH 為 5. 0.接入10%的菌液30°C、180rpm動(dòng)態(tài)培養(yǎng)5天后,8000rpm離心15min,收集上清液,DNS法測(cè)定酶液活力，具體方法為200ul O. 2%的七葉苷加入500ul的酶液，50°C溫浴30min后， 加入Iml 了 DNS,沸水浴5min,定容至10ml, 540nm測(cè)定,酶活力為341. 5U/ml. ( β -葡萄糖苷酶活力變化見(jiàn)圖7)。
實(shí)施例11 產(chǎn)酶培養(yǎng)基配制方法同實(shí)施例10，DNS法測(cè)定酶活力，具體方法為200ul O. 2%的七葉苷加入500ul的酶液30°C溫浴30min后，加入Iml 了 DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm 下測(cè)定，算酶活力為127.3 U/ml。
實(shí)施例12 產(chǎn)酶培養(yǎng)基配制方法同實(shí)施例10，DNS法測(cè)定酶活力，具體方法為200ul O. 2%的七葉苷加入500ul的酶液70°C溫浴30min后，加入Iml 了 DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm 下測(cè)定，酶活力為94. 2 U/ml。
實(shí)施例13 產(chǎn)酶培養(yǎng)基配制方法同實(shí)施例10，DNS法測(cè)定酶活力，具體方法為200ul O. 2%的七葉苷加入500ul的酶液50°C溫浴20min后，加入Iml 了 DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm 下測(cè)定，酶活力為306.7 U/ml。
實(shí)施例14 產(chǎn)酶培養(yǎng)基配制方法同實(shí)施例10，DNS法測(cè)定酶活力，具體方法為200ul O. 2%的七葉苷加入500ul的酶液50°C溫浴40min后，加入Iml 了 DNS，沸水浴5min，定容至10ml，540nm 下測(cè)定，酶活力為332.6U/ml。
實(shí)施例15 將實(shí)施例10中的2%內(nèi)醚糖換成4%熱解液(5%活性炭脫毒)，測(cè)定酶活力為558. 9U/ ml. ( β-葡萄糖苷酶活力變化見(jiàn)圖8)。
權(quán)利要求
1.一株嗜松青霉/7i/7o/ Ai7tt ) ZS2,保藏號(hào)為 CGMCC NO. 6366。
2.嗜松青霉CGMCCNO. 6366在利用熱解液或內(nèi)醚糖制備纖維素酶中的應(yīng)用。
3.一種用嗜松青霉CGMCC NO. 6366制備纖維素酶的方法，其特征在于將嗜松青霉 CGMCC NO. 6366接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)I 一 5天，得到含纖維素酶的發(fā)酵液；所說(shuō)的產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為(W/W) 2%內(nèi)醚糖、1%蛋白胨、O. 3%MgS04、0. 5% KH2PO4,O.5%Κ2ΗΡ04、ρΗ3· 0-7. O ；或者是4% 纖維素?zé)峤庖骸?% 蛋白胨、O. 3%MgS04、0. 5% KH2PO4,0. 5%Κ2ΗΡ04、ρΗ3· 0-7. O。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)菌株對(duì)纖維素生物質(zhì)高溫?zé)峤庖汉蛢?nèi)醚糖的利用。所述嗜松青霉菌保藏號(hào)為CGMCC NO.6366；可利用內(nèi)醚糖和熱解液生長(zhǎng)得到嗜松青霉菌絲體并產(chǎn)纖維素酶，是對(duì)纖維素生物質(zhì)的有效利用。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102925370SQ201210467779
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者陳育如, 孫歡, 趙乙萱, 劉軍利, 衛(wèi)民 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)