專(zhuān)利名稱(chēng)：一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重pcr檢測(cè)引物組、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)引物組、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
鱧科魚(yú)類(lèi)(Channidae)是我國(guó)重要的淡水經(jīng) 濟(jì)魚(yú)類(lèi)，在我國(guó)分布廣泛，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其中斑鱧(Channa maculata)和烏鱧(Channa argus)和以斑鱧為母本，烏鱧為父本雜交獲得雜交鱧(Channa maculata早X C. argus )均是我國(guó)重要的養(yǎng)殖品種，也是我國(guó)外貿(mào)出口的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。隨著我國(guó)池塘鱧科魚(yú)類(lèi)高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖鱧科魚(yú)類(lèi)病害的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，導(dǎo)致鱧科魚(yú)類(lèi)發(fā)病病原包括嗜水氣單胞菌、諾卡氏菌、舒伯特氣單胞菌等。鱧內(nèi)臟類(lèi)結(jié)節(jié)病是近年來(lái)新暴發(fā)的鱧科魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性病，該病的特點(diǎn)是病魚(yú)體表無(wú)明顯變化，肝、脾、腎等內(nèi)臟組織出現(xiàn)白色類(lèi)結(jié)節(jié)癥狀，死亡率可達(dá)45%以上，通過(guò)分離鑒定確定該病的致病菌為舒伯特氣單胞菌。自2009年首次報(bào)道以來(lái)，鱧內(nèi)臟類(lèi)結(jié)節(jié)病在全國(guó)范圍內(nèi)均有發(fā)生，近幾年該病導(dǎo)致湖北省養(yǎng)殖烏鱧、廣東省養(yǎng)殖斑鱧和雜交鱧大面積死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病與鱧科魚(yú)類(lèi)另一主要疾病諾卡氏菌引起的結(jié)節(jié)病癥狀相似，養(yǎng)殖過(guò)程中容易誤診，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)。因此，研發(fā)一種能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的方法對(duì)于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步研究該菌及其致病機(jī)理具有極其重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一組能快速、準(zhǔn)確地對(duì)致病性鱧源舒伯特氣單胞菌進(jìn)行檢測(cè)的雙重PCR檢測(cè)引物組。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種能快速、準(zhǔn)確地對(duì)致病性鱧源舒伯特氣單胞菌進(jìn)行檢測(cè)的雙重PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種能快速、準(zhǔn)確地對(duì)致病性鱧源舒伯特氣單胞菌進(jìn)行檢測(cè)的雙重PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為
一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)引物組，包括檢測(cè)促旋酶的B亞單位基因(gyrB)的引物對(duì)和檢測(cè)溶血素基因(hlyA)的引物對(duì)，序列分別如下gyrB引物對(duì)
上游引物TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG (SEQ ID NO. I),
下游引物GCACCCTTACGGCAAGTCATC (SEQ ID NO. 2)； hlyA引物對(duì)
上游引物CAGGCTTCCAGCACTGAATACT (SEQ ID NO. 3),
下游引物CCAGTCCCACCACTTCACCT (SEQ ID NO. 4)。
一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)試劑盒，包括上述的檢測(cè)引物組、10 XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。所述陽(yáng)性質(zhì)控品為含有g(shù)yrB基因序列(GenBank登錄號(hào)JQ319030)的T載體克隆和含有hlyA基 因序列(GenBank登錄號(hào)JX996182)的T載體克隆，陰性質(zhì)控品為無(wú)菌ddH20。一種檢測(cè)致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR方法，包括以下步驟
1)從待檢鱧的組織器官分離細(xì)菌；
2)以分離菌株為模板，使用分別根據(jù)舒伯特氣單胞菌的促旋酶的B亞單位基因(gyrB)、溶血素基因(hlyA)基因序列設(shè)計(jì)合成的兩對(duì)引物，在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，其中引物序列如下
gyrB引物對(duì)
上游引物TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG (SEQ ID NO. I),
下游引物GCACCCTTACGGCAAGTCATC (SEQ ID NO. 2)； hlyA引物對(duì)
上游引物CAGGCTTCCAGCACTGAATACT (SEQ ID NO. 3),
下游引物CCAGTCCCACCACTTCACCT (SEQ ID NO. 4)；
3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，然后根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行判定，其中g(shù)yrB擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)601 bp，hlyA 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 375 bp。 所述雙重PCR反應(yīng)體系為待檢囷液I旲板或陽(yáng)性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品2 μ I,10Xbuffer 2. 5 μ I, Taq DNA 聚合酶(5 U/ μ L) O. 125 μ L, MgCl2 (250 mmol/L) I. 5μ L,gyrB 上下游引物(20ymol/L)各 O. 4μ L，hlyA 上下游引物(20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，dNTP(2· 5mmol/L) 2μ L，ddH20 補(bǔ)齊至 25 μ I。所述雙重PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min ；94°C 30s, 55-58°C 30s, 72°C 30s，反應(yīng)30-35 次循環(huán)；72°C IOmin0優(yōu)選的，退火溫度為56°C。優(yōu)選的，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30次。本發(fā)明是以促旋酶的B亞單位基因(gyrB)和溶血素基因(hlyA)為靶基因設(shè)計(jì)了兩對(duì)針對(duì)致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的高度特異性引物。gyrB基因是單拷貝的看家基因，平均堿基替換率為每100萬(wàn)年變化O. 7°/Γθ. 8%，比16S rDNA的每5000萬(wàn)年變化1%的速度要快，而且不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，并普遍存在于各種細(xì)菌中。本發(fā)明人通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證gyrB基因比16S rRNA在區(qū)分和鑒定舒伯特氣單胞菌及其近緣種上具有更顯著的優(yōu)勢(shì)。hlyA基因最早是Aoki等(1991)從罐裝牛奶中分離的嗜水氣單胞菌ATCC7966菌株中克隆出來(lái)的。該基因在嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌等氣單胞菌屬菌株中均有分布。舒伯特氣單胞菌在毒力基因方面的研究還很少，目前僅有Chen等(2012)從感染斑鱧的舒伯特氣單胞菌中克隆了 hlyA基因；本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室從患病鱧中分離的舒伯特氣單胞菌中克隆了 hlyA基因(Genbank登陸號(hào)JX996182)。研究發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬模式菌株嗜水氣單胞菌基因表達(dá)的溶血素對(duì)宿主的破壞力非常強(qiáng)，所以對(duì)于毒力嗜水氣單胞菌的早期預(yù)測(cè)及防治變得尤為重要。Micheal等(1999)對(duì)臨床和環(huán)境(其中包括魚(yú)源)中的A. hydrophila進(jìn)行研究，96%菌株呈hlyA陽(yáng)性，認(rèn)為所有的毒力嗜水氣單胞菌株是hlyA陽(yáng)性。
本發(fā)明經(jīng)多次篩選后，以鱧源舒伯特氣單胞菌的gyrB基因和hlyA基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)了兩組高特異性的檢測(cè)引物，并由其建立起的雙重PCR檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法敏感性強(qiáng)、特異性高，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)致病性鱧源舒伯特氣單胞菌。同時(shí)避免了反復(fù)培養(yǎng)、冗長(zhǎng)的一系列生化反應(yīng)，節(jié)約時(shí)間、勞動(dòng)能力和成本。


圖I為特異性試驗(yàn)電泳圖譜(M為DNA Marker, 1-12依次為WL-2，溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、無(wú)乳鏈球菌、諾卡氏菌、遲緩愛(ài)德華菌、熒光假單胞菌、柱狀黃桿菌、哈氏弧菌、類(lèi)志賀鄰單胞菌、大腸桿菌和陰性對(duì)照);
圖2為敏感性試驗(yàn)電泳圖譜(M為DNA Marker, 1-7分別為WL-2的模版菌落個(gè)數(shù)分別為 3X ο。，3X IoiJxio2Jxio3Jxio4Jxio5Jxio6,8 為陰性對(duì)照)；
圖3為病料檢測(cè)試驗(yàn)電泳圖譜(1-21依次為21個(gè)待檢測(cè)菌株，22為陽(yáng)性質(zhì)控品，23為陰性質(zhì)控品)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施案例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但并不局限于此，凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中WL-2的gyrB基因序列(GenBank登錄號(hào)JQ319030)和hIyA基因序列(GenBank登錄號(hào)JX996182 )，設(shè)計(jì)和篩選出兩對(duì)特異性片段引物。各引物序列和預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如下
權(quán)利要求
1.一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)引物組，包括檢測(cè)gyrB基因的引物對(duì)和檢測(cè)hlyA基因的引物對(duì)，序列分別如下 gyrB引物對(duì) 上游引物TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG (SEQ ID NO. I), 下游引物GCACCCTTACGGCAAGTCATC (SEQ ID NO. 2)； hlyA引物對(duì) 上游引物CAGGCTTCCAGCACTGAATACT (SEQ ID NO. 3), 下游引物CCAGTCCCACCACTTCACCT (SEQ ID NO. 4)。
2.一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求I所述的檢測(cè)引物組。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求I所述的檢測(cè)引物組、10 XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為含有g(shù)yrB基因序列(GenBank登錄號(hào)JQ319030)的T載體克隆和含有hlyA基因序列(GenBank登錄號(hào)JX996182)的T載體克??；陰性質(zhì)控品為無(wú)菌ddH20。
5.一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟 1)從待檢鱧的組織器官分離細(xì)菌； 2)以分離菌株為模板，使用分別根據(jù)舒伯特氣單胞菌的促旋酶的B亞單位基因(gyrB)、溶血素基因(hlyA)基因序列設(shè)計(jì)合成的兩對(duì)引物，在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，其中引物序列如下 gyrB引物對(duì) 上游引物TCAACTCCGCTGTCTCTAACCTG (SEQ ID NO. I), 下游引物GCACCCTTACGGCAAGTCATC (SEQ ID NO. 2)； hlyA引物對(duì) 上游引物CAGGCTTCCAGCACTGAATACT (SEQ ID NO. 3), 下游引物CCAGTCCCACCACTTCACCT (SEQ ID NO. 4)； 3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，然后根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行判定，其中g(shù)yrB擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)601 bp，hlyA 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 375 bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述雙重PCR反應(yīng)體系為待檢菌液模板或陽(yáng)性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品2 μ I, IOXbuffer2.5 μ I, Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L) O. 125 μ L，MgCl2 (250 mmol/L) I. 5μ L, gyrB 上下游引物(20ymol/L)各 O. 4μ L，hlyA 上下游引物(20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，dNTP (2. 5mmol/L)2μ L, ddH20 補(bǔ)齊至 25 μ I0
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述雙重 PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min ；94°C 30s，55_58°C 30s, 72°C 30s，反應(yīng) 30-35次循環(huán)；72°C IOmin。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)方法，其特征在于退火溫度為56°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)方法，其特征在于反應(yīng)循環(huán)數(shù)為 30次 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種致病性鱧源舒伯特氣單胞菌的雙重PCR檢測(cè)引物組、試劑盒及方法，通過(guò)設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物和優(yōu)選的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件，可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)致病性鱧源舒伯特氣單胞菌，為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步研究該菌及其致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)是建立的多重PCR反應(yīng)，敏感性強(qiáng)、特異性高，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出樣品中的致病性鱧源舒伯特氣單胞菌，同時(shí)避免了反復(fù)培養(yǎng)、冗長(zhǎng)的一系列生化反應(yīng)，節(jié)約時(shí)間、勞動(dòng)能力和成本。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102965438SQ201210467910
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者劉春 , 李凱彬, 王慶, 吳淑勤, 王芳, 常藕琴, 梁慧麗, 曾偉偉, 王英英 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所