一種桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶p1的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域，具體涉及一種桔青霉半連續(xù)發(fā)酵生產核酸酶Pl的方法。
【背景技術】
[0002]5’-核苷酸已廣泛應用于食品、生化工業(yè)以及制藥工業(yè)。在食品行業(yè)中，己經由最初的食品助鮮劑，擴展為具有提高生物體免疫功能的功能性食品添加劑，可以添加在面包、餅干等食品中，尤其在嬰幼兒食品中的使用效果非常明顯，能夠有效增強嬰幼兒抵抗細菌性痢疾的能力，減少腹瀉的發(fā)生；在醫(yī)藥領域，5’ -核苷酸不但能夠作為藥物使用，而且還是許多抗病毒抗腫瘤藥物的生產原料；此外，核苷酸制劑還可以作為動植物生長調節(jié)劑，有著明顯的增產、增重功效。
[0003]核苷酸生產主要采取三種方法:化學合成法、微生物發(fā)酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四種核苷酸的混合物，且酶反應收率較高，國內外工業(yè)化生產核苷酸均采用此法。在酶解法制備核苷酸中所需的酶是核酸酶P1，它是一種能夠水解RNA獲得四種5’ -核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解產物雜質少后續(xù)分離工藝簡單，國外一般采用該方法進行核苷酸的生產。
[0004]桔青霉屬于不對稱青霉組，絨狀青霉亞組，桔青霉系，是核酸酶Pl的重要生產菌種。國內外生產核酸酶Pi主要通過桔青霉液體深層發(fā)酵，屬于分批發(fā)酵，該方法耗時較長。如何高效的生產核酸酶P1，降低生產成本，已成為核苷酸生產的首要任務。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明索要解決的技術問題是提供一種桔青霉半連續(xù)發(fā)酵生產核酸酶Pl的方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0007]一種桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，使用包含了維生素B類物質的發(fā)酵培養(yǎng)基，進行桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pi。
[0008]其中，所述的桔青霉為CGMCC N0.2014。該菌株記載在中國專利CN101067116A中。
[0009]其中，所述的維生素B類物質為泛酸、煙酸、生物素、葉酸、維生素B1、維生素B2、吡哆醇和氰鈷胺中的任意一種或幾種，優(yōu)選泛酸、煙酸、生物素、葉酸、維生素BI和維生素B2中的任意一種或幾種，最優(yōu)選泛酸、煙酸和葉酸三者的組合；發(fā)酵培養(yǎng)基中維生素B類物質總濃度為 0.001g/L ?lg/L，優(yōu)選 0.05-0.8g/L，最優(yōu)選 0.1-0.8g/L
[0010]其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下:葡萄糖0.5?50g/L，蛋白胨0.05?5g/L，磷酸二氫鉀0.01?5g/L，磷酸氫二鉀0.01?5g/L，硫酸鎂0.01?5g/L，氯化鈣0.01?5g/L，維生素B類物質0.001?lg/L，溶劑為水，pH5-8。
[0011]上述桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，優(yōu)選包括如下步驟:
[0012]a桔青霉在發(fā)酵罐中發(fā)酵一段時間，待核酸酶Pl酶活增長至穩(wěn)定后放出一定體積的發(fā)酵液，發(fā)酵罐中留存的發(fā)酵液作為下一批發(fā)酵種子；
[0013]b通過向發(fā)酵罐補加無菌發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，待酶活增至穩(wěn)定后再次放出一定體積的發(fā)酵液，發(fā)酵罐中留存的發(fā)酵液作為下一批發(fā)酵種子；
[0014]c重復步驟b直至桔青霉產酶能力下降至一定程度后停止發(fā)酵。
[0015]步驟a中，所述的發(fā)酵罐體積為20L?200T，優(yōu)選IT?50T ;所述的發(fā)酵一段時間，時間為10?100h，優(yōu)選20?60ho
[0016]步驟a和b中，所述的酶活增長至穩(wěn)定，是指酶活為3000?6500U/mL，優(yōu)選4000?6000U/mLo
[0017]步驟a和b中，所述的放出一定體積的發(fā)酵液，是指放出發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的20 %?95 %的發(fā)酵液，優(yōu)選60-90 %。
[0018]步驟c中，重復步驟b的次數(shù)為2?20次，優(yōu)選10?15次。
[0019]步驟c中，所述的桔青霉產酶能力下降至一定程度，是指核酸酶Pl酶活小于3000U/mLo
[0020]本發(fā)明中，核酸酶Pl酶活定義:將1.9ml的底物溶液(含有濃度為I %左右的RNA ；0.2M pH5.2的醋酸緩沖液以0.0005M的ZnS04)于70°C恒溫水浴1min后，加入0.1ml經適當稀釋的酶液，70°C保溫15min后加入2.0ml核酸沉淀劑(0.25%鉬酸銨-2.5過氯酸)，冰水浴20min后離心、取上清夜用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，測定其260nm處的吸光值為A260。以先加沉淀劑者作為對照，其它操作同前。在上述條件下，每分鐘所生成的核苷酸量在260nm處的吸光值的差值為1.0時定義為I個酶活力單位。
[0021]有益效果:本發(fā)明采用半連續(xù)發(fā)酵的方式，通過添加維生素B類物質進行半連續(xù)發(fā)酵，單批發(fā)酵時間由60h縮短至20h，酶活由3000U/mL提高至6500U/mL，可連續(xù)發(fā)酵12批以上。該方法可以顯著的縮短發(fā)酵工時，減少生產成本。
【具體實施方式】
[0022]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
[0023]實施例1:
[0024]發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂 0.2g/L，氯化鈣 0.2g/L，泛酸 0.01g/L，維生素 BI 0.05g/L，pH6，121°C滅菌15min，降溫至30°C左右備用。
[0025]50L攪拌罐中裝入30L培養(yǎng)基，滅菌后接入經麥芽汁斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)的桔青霉菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)。間隔一定時間取樣測定核酸酶Pl的酶活，培養(yǎng)56h后酶活穩(wěn)定在3300U/mL左右，放出24L發(fā)酵液，罐中留存6L作為下一批發(fā)酵的種子液。配制24L發(fā)酵培養(yǎng)基打入發(fā)酵罐再次培養(yǎng)。22h后酶活穩(wěn)定至4800U/mL，再次放出24L發(fā)酵液，同樣方法補入24L新鮮培養(yǎng)基。如此循環(huán)補料5次，第2、3次補料后培養(yǎng)酶活均在5000U/mL左右，第4次補料酶活下降至3460U/mL，第5次補料后酶活明顯下降，只有2850U/mL，停止半連續(xù)發(fā)酵。
[0026]用同樣的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件發(fā)酵，但是發(fā)酵培養(yǎng)基不加泛酸和維生素BI，58h后酶活穩(wěn)定至3800U/mL，放出24L發(fā)酵液，同樣方法補入24L新鮮培養(yǎng)基。發(fā)酵44h，酶活穩(wěn)定在2500U/mL，停止半連續(xù)發(fā)酵。
[0027]實施例2:
[0028]發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，磷酸二氫鉀lg/L，磷酸氫二鉀Ig/L，硫酸鎂 0.5g/L，氯化鈣 0.2g/L，生物素 0.lg/L,煙酸 0.06g/L，維生素 B2 0.2g/L，pH7，121°C滅菌15min，降溫至30°C左右備用。
[0029]2T攪拌罐中裝入1.2T培養(yǎng)基，滅菌后接入經麥芽汁斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)的桔青霉菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)。間隔一定時間取樣測定核酸酶Pl的酶活，培養(yǎng)58h后酶活穩(wěn)定在3700U/mL左右，放出IT發(fā)酵液，罐中留存0.2T作為下一批發(fā)酵的種子液。配制IT發(fā)酵培養(yǎng)基打入發(fā)酵罐再次培養(yǎng)。20h后酶活穩(wěn)定至5200U/mL，再次放出IT發(fā)酵液，同樣方法補入IT新鮮培養(yǎng)基。如此循環(huán)補料10次，第2-8次補料后培養(yǎng)酶活均在5400U/mL左右，第9次補料酶活下降至4200U/mL，第10次補料后酶活明顯下降，只有2800U/mL，停止半連續(xù)發(fā)酵。
[0030]用同樣的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件發(fā)酵，但是發(fā)酵培養(yǎng)基不加生物素、煙酸和維生素B2，57h后酶活穩(wěn)定至4600U/mL，放出IT發(fā)酵液，同樣方法補入IT新鮮培養(yǎng)基。55h后酶活穩(wěn)定至4200U/mL，第3次補料發(fā)酵55h后酶活明顯下降，只有2650U/mL，停止半連續(xù)發(fā)酵。
[0031]實施例3:
[0032]發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:葡萄糖40g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氫鉀lg/L，磷酸氫二鉀Ig/L，硫酸鎂 0.5g/L，氯化鈣 0.2g/L，泛酸 0.lg/L、煙酸 0.2g/L、葉酸 0.5g/L，pH7，121°C 滅菌15min，降溫至30°C左右備用。
[0033]20T攪拌罐中裝入12T培養(yǎng)基，滅菌后接入經麥芽汁斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)的桔青霉菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)。間隔一定時間取樣測定核酸酶Pl的酶活，培養(yǎng)56h后酶活穩(wěn)定在4500U/mL左右，放出8T發(fā)酵液，罐中留存4T作為下一批發(fā)酵的種子液。配制8T發(fā)酵培養(yǎng)基打入發(fā)酵罐再次培養(yǎng)。20h后酶活穩(wěn)定至5400U/mL，再次放出8T發(fā)酵液，同樣方法補入8T新鮮培養(yǎng)基。如此循環(huán)補料12次，第2-9次補料后培養(yǎng)酶活均在6500U/mL左右，第10次補料酶活下降至4850U/mL，第11次補料酶活下降至3680U/mL，第12次補料后酶活明顯下降，只有2400U/mL，停止半連續(xù)發(fā)酵。
[0034]用同樣的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件發(fā)酵，但是發(fā)酵培養(yǎng)基不加泛酸、煙酸和葉酸，57h后酶活穩(wěn)定至4500U/mL，放出IT發(fā)酵液，同樣方法補入IT新鮮培養(yǎng)基。55h后酶活穩(wěn)定至4000U/mL，第3次補料發(fā)酵58h后酶活明顯下降，只有2700U/mL，停止半連續(xù)發(fā)酵。
【主權項】
1.一種桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，使用包含了維生素B類物質的發(fā)酵培養(yǎng)基，進行桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl。
2.根據(jù)權利要求1所述的桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，所述的桔青霉為CGMCC N0.2014。
3.根據(jù)權利要求1所述的桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，所述的維生素B類物質為泛酸、煙酸、生物素、葉酸、維生素B1、維生素B2、吡哆醇和氰鈷胺中的任意一種或幾種，發(fā)酵培養(yǎng)基中維生素B類物質總濃度為0.001g/L?lg/L。
4.根據(jù)權利要求1或3所述的桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下:葡萄糖0.5?50g/L，蛋白胨0.05?5g/L，磷酸二氫鉀0.01?5g/L，磷酸氫二鉀0.01- 5g/L，硫酸鎂0.01- 5g/L，氯化鈣0.01- 5g/L，維生素B0.001?lg/L，溶劑為水，pH5-8。
5.根據(jù)權利要求1所述的桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，它包括如下步驟: a桔青霉在發(fā)酵罐中發(fā)酵一段時間，待核酸酶Pl酶活增長至穩(wěn)定后放出一定體積的發(fā)酵液，發(fā)酵罐中留存的發(fā)酵液作為下一批發(fā)酵種子； b通過向發(fā)酵罐補加無菌發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，待酶活增至穩(wěn)定后再次放出一定體積的發(fā)酵液，發(fā)酵罐中留存的發(fā)酵液作為下一批發(fā)酵種子； c重復步驟b直至桔青霉產酶能力下降至一定程度后停止發(fā)酵。
6.根據(jù)權利要求1所述的桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，步驟a中，所述的發(fā)酵罐體積為20L?200T ;所述的發(fā)酵一段時間，時間為10?100h。
7.根據(jù)權利要求1所述的桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，步驟a和b中，所述的酶活增長至穩(wěn)定，是指酶活為3000?6500U/mL。
8.根據(jù)權利要求1所述的桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，步驟a和b中，所述的放出一定體積的發(fā)酵液，是指放出發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的20%?95%的發(fā)酵液。
9.根據(jù)權利要求1所述的桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，步驟c中，重復步驟b的次數(shù)為2?20次。
10.根據(jù)權利要求1所述的桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶Pl的方法，其特征在于，步驟c中，所述的桔青霉產酶能力下降至一定程度，是指核酸酶Pl酶活小于3000U/mL。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶P1的方法，使用包含了維生素B類物質的發(fā)酵培養(yǎng)基，進行桔青霉半連續(xù)發(fā)酵制備核酸酶P1。本發(fā)明方法單批發(fā)酵時間由60h縮短至20h，酶活由3000U/mL提高至6500U/mL，可連續(xù)發(fā)酵12批以上。該方法可以顯著的縮短發(fā)酵工時，減少生產成本。
【IPC分類】C12N9-22, C12R1-80
【公開號】CN104560913
【申請?zhí)枴緾N201410818210
【發(fā)明人】應漢杰, 陳曉春, 張磊, 蔡家棟, 陳勇, 吳菁嵐, 周昌祝
【申請人】南京工業(yè)大學, 南京同凱兆業(yè)生物技術有限責任公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月24日