一株肉桂柴正青霉及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株肉桂柴正青霉及其應(yīng)用，屬于解磷微生物肥料【技術(shù)領(lǐng)域】。該菌株為肉桂柴正青霉（Eupenicillium?cinnamopurpureum）WHP-1，保藏編號為CGMCC?No.8128。本發(fā)明還公開了含有上述菌株的微生物菌劑及其制備方法。實驗表明，本發(fā)明的肉桂柴正青霉菌株WHP-1具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、抗逆性強(qiáng)、解磷能力強(qiáng)，在植物根際能夠快速大量定殖等特點。該菌株的發(fā)酵液或菌劑中含有大量解磷菌，對土壤改良有一定的積極作用，其所具有的溶磷功能，對改善土壤結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)作物對肥料的吸收率等有積極影響。
【專利說明】一株肉桂柴正青霉及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于解磷微生物肥料領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一株能夠高效解磷真菌肉桂柴正青霉及其用途，以及采用該肉桂柴正青霉制備的菌劑。
【背景技術(shù)】
[0002]磷是植物細(xì)胞中遺傳物質(zhì)DNA和能量物質(zhì)ATP的基本構(gòu)成元素，在植物的整個生命過程中起著重要的作用。磷是植物生長發(fā)育的必需元素之一，高能磷酸鍵是能量的載體，植物的光合作用和體內(nèi)的生化過程都必須有磷參加。磷既是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要物質(zhì)保證，又是不可再生的礦質(zhì)資源。我國耕地土壤中全磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在0.2-1.lg/kg—1 (土)之間變動，許多土壤磷素供應(yīng)不足，因此利用解磷微生物定向地調(diào)節(jié)土壤磷素狀況和提高磷肥利用率是達(dá)到作物高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良的重要途徑之一。
[0003]肉桂柴正青霉屬于子囊菌門，散囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。解磷真菌在數(shù)量和種類上遠(yuǎn)不及解磷細(xì)菌，從同一土壤上分離出來的解磷細(xì)菌數(shù)目可以是解磷真菌的幾倍、幾十倍甚至上百倍。然而前人報道解磷真菌的解磷能力一般要強(qiáng)于細(xì)菌。真菌溶磷機(jī)理非常復(fù)雜，有些真菌溶磷主要是質(zhì)子起作用，有些主要是有機(jī)酸起作用，而有些菌株則兩種機(jī)制都存在，還有些菌株由于生長過程中產(chǎn)生其它的螯合物質(zhì)，從而導(dǎo)致磷礦粉的溶解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于高效解磷真菌菌株——肉桂柴正青霉WHP-1。本發(fā)明的肉桂柴正青霉菌株具有生長速度快、解磷能力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供一種采用該肉桂柴正青霉菌株WHP-1制備的能夠高效解磷的微生物菌劑。
[0006]本發(fā)明所提供的菌株為肉桂柴正青霉(Eupenicillium cinnamopurpureum)WHP-1，是從山東沿海濕地土壤中分離獲得的，已于2013年9月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC N0.8128。其具有以下生物學(xué)特性:分生孢子梗通常非常簡單，偶爾有一個分支不同，分支狀的?；谄淠┒藭只癁閮蓚€瓶梗，在孢梗莖上很少會產(chǎn)生2-3個不同的梗基，孢梗莖的長度可變，20-250 X 1.5-2.5 μ m,末端能夠膨大到5-6 μ m，?；嬖跁r為7-25 X 1.8-2.5 μ m。分生孢子在寬松的空間下由橢球形稍微變至近球形，孢子壁接近光滑，大小為2.2-3.2 X 1.8-2.8 μ m。子囊果是裸囊殼，為棕褐色，粉紅色的肉桂棕色，有時為深褐色，其包被由纖細(xì)菌絲交織而成，質(zhì)地從疏松至緊密，球形、近球形或近橢圓形，直徑為100-380 μ m,剛形成的時候非常堅硬，在成熟的6-8周內(nèi)，菌絲細(xì)胞相對短而且較寬，菌絲膨大且彎曲為螺旋狀，7-8.5 X 6-7 μ m ;子囊鏈生、單生，少數(shù)不規(guī)則生，球形、近球形或橢圓形，不規(guī)則排列，每個通常含8個子囊孢子；子囊孢子球形、近球形或橢圓形，直徑0.2-0.5 μ m，透明、黃色、少數(shù)帶紅色，壁平滑。[0007]本發(fā)明肉桂柴正青霉(Eupenicillium cinnamopurpureum)WHP-1的培養(yǎng)方法或繁殖方法包括:
[0008](1)普通培養(yǎng)保存采用PDA培養(yǎng)基，配方為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂12g，蒸餾水 1000mL ；
[0009](2)實驗室液體培養(yǎng)采用PDB培養(yǎng)基，配方為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。
[0010](3)固體培養(yǎng)基配方:固料和無機(jī)鹽溶液，按質(zhì)量比1:1.8的比例配制。其中所述固料由質(zhì)量比為85:15的稻糠和麩皮組成；按質(zhì)量百分比計，所述無機(jī)鹽溶液包括3.5%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水。
[0011](4)大量發(fā)酵培養(yǎng)配方:同(3)中固體培養(yǎng)基配方。
[0012]本發(fā)明還提供一種用于高效解磷的微生物菌劑，所述微生物菌劑包括肉桂柴正青霉菌株WHP-1。
[0013]本發(fā)明也提供了上述肉桂柴正青霉菌株WHP-1或者上述菌劑在為農(nóng)作物提供可利用的有效磷的用途。
[0014]本發(fā)明所述的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟:
[0015]( I)制備所述肉桂柴正青霉菌株WHP-1的種子液；
[0016](2)將步驟(I)制備的種子液接種到固體培養(yǎng)基中，28_30°C下恒溫培養(yǎng)；
[0017](3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物加入無菌水混合，過濾，將濾液接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基，在室溫28-30°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0018]所述制備方法，具體包括以下步驟:
[0019](I)將所述肉桂柴正青霉菌株WHP-1的孢子移植到PDB液體培養(yǎng)基中，28°C搖床振蕩培養(yǎng)3~5d得到種子液；
[0020](2)將步驟(I)制備的種子液按質(zhì)量比10%的比例接種到固體培養(yǎng)基中，28°C下振蕩培養(yǎng)3~5d ;
[0021](3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物用無菌水按質(zhì)量比1:15的比例混合，過濾，將濾液按體積比1:6的比例接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫28°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室中發(fā)酵培養(yǎng)8~9d。
[0022]其中，步驟(I)中的所述PDB液體培養(yǎng)基為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水IOOOmL ；
[0023]步驟(2)中的固體培養(yǎng)基由固料和無機(jī)鹽溶液組成，所述固料和無機(jī)鹽溶液的質(zhì)量比為1:1.8 ;所述固料由質(zhì)量比為85:15的稻糠和麩皮組成；按質(zhì)量百分比計，所述無機(jī)鹽溶液包含3.5%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水；
[0024]步驟(3)中的大量發(fā)酵培養(yǎng)基同步驟(2)的固體培養(yǎng)基。
[0025]實驗表明，本發(fā)明的肉桂柴正青霉菌株WHP-1具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、抗逆性強(qiáng)、解磷能力強(qiáng)，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此由該肉桂柴正青霉菌株制備的菌劑具有良好的應(yīng)用前景。該菌株的發(fā)酵液或菌劑中含有大量解磷菌，對土壤改良有一定的積極作用，其所具有的溶磷功能，對改善土壤結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)作物對肥料的吸收率等具有積極影響?！揪唧w實施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0027]實施例1
[0028]1、肉桂柴正青霉(E.cinnamopurpureum) WHP-1的分離與純化
[0029]本發(fā)明的肉桂柴正青霉(E.cinnamopurpureum) WHP-1是從土壤中采用稀釋平板法和平板劃線法分離獲得的，分離方法為:
[0030](I)肉桂柴正青霉菌株的分離:土樣的采集，在山東沿海濕地不同地區(qū)選取種植不同作物類型的地塊，采用5點取樣法，分別采集地塊四周和中央深度在10-20cm范圍內(nèi)的土壤適量，等量混勻。標(biāo)明采集地點、時間和采集人。稱取Ig 土樣于IOOmL無菌水中，置于30°C搖床中150rpm震蕩lOmin，取100 μ LlO'10'10-4稀釋液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，每個梯度涂布三個平行，在30°C培養(yǎng)2d后挑取PDA上的不同形態(tài)的微生物菌落于PDA上進(jìn)行劃線，定時觀察菌落生長情況。然后采用平板劃線法，純化鏈霉菌菌株，轉(zhuǎn)至PDA試管斜面分別編號保存?zhèn)溆谩?br> [0031](2)高效解磷木霉菌株的篩選
[0032]①初篩:采用蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，制備PDA平板，將分離獲得的純菌株在PDA斜面上活化2-3代，然后分別點接種于蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，觀察有無溶磷圈，并根據(jù)溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值的大小來初步確定解磷能力將有溶磷作用的菌株作好記錄備用。
[0033]②復(fù)篩:根據(jù)上述溶磷圈法初篩的結(jié)果，選擇溶磷效果較好的菌株，利用搖瓶培養(yǎng)基測定其溶磷量，進(jìn)行盆栽試驗和田間試驗。
[0034]本發(fā)明人通過大量篩選工作得到一株能夠高效解磷的肉桂柴正青霉(E.cinnamopurpureum) WHP-1。實驗證明，具有生長速度快、解磷能力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應(yīng)用前景。
[0035]其中，PDA培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200g(去皮)，葡萄糖20g，瓊脂14g，蒸餾水1000mL。解磷菌篩選采用蒙金娜無機(jī)磷固體培養(yǎng)基:葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g, NaCl0.3g，KC10.3g，F(xiàn)eSO4.7Η200.03g, MnSO4.4Η200.03g, Ca3(PO3)2IOg,酵母浸提物 0.4g，瓊脂 20g，去離子水IOOOmL, pH 調(diào)至 7.0。
[0036]2、菌株鑒定
[0037](I)微生物學(xué)特性:分生孢子梗通常非常簡單，偶爾有一個分支不同，分支狀的?；谄淠┒藭只癁閮蓚€瓶梗，在孢梗莖上很少會產(chǎn)生2到3個不同的?；?，孢梗莖的長度可變，20-250X 1.5-2.5μπι，末端能夠膨大到5-6 μ m，?；嬖跁r為7-25X 1.8-2.5 μ m。分生孢子在寬松的空間下由橢球形稍微變至近球形，孢子壁接近光滑，大小為2.2-3.2X1.8-2.8 μ m0子囊果是裸囊殼，為棕褐色，粉紅色的肉桂棕色，有時為深褐色，其包被由纖細(xì)菌絲交織而成，質(zhì)地從疏松至緊密，球形、近球形或近橢圓形，直徑為100-380 μ m，剛形成的時候非常堅硬，在成熟的6-8周內(nèi)，菌絲細(xì)胞相對短而且較寬，菌絲膨大且彎曲為螺旋狀，7-8.5X6-7 μ m;子囊鏈生、單生，少數(shù)不規(guī)則生，球形、近球形或橢圓形，不規(guī)則排列，每個通常含8個子囊孢子；子囊孢子球形、近球形或橢圓形，直徑
0.2-0.5 μ m，透明、黃色、少數(shù)帶紅色，壁平滑。
[0038](2)分子生物學(xué)特性
[0039]該菌株的rDNA基因序列測定結(jié)果(ITS-5.8S-1TS2區(qū))如下(SEQ N0.1):
[0040]CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTCAGGCCGCCGGGGGCTTCGTGCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGAAGACACCATTGAACGCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCGATTAGCTAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTTGTTGGGTCTACGTCCCCCCGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCATCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCAACCATTTTCTCAGGTGACCTCGATCAGTACGAGTACC
[0041]實施例2
[0042]1、肉桂柴正青霉菌株WHP-1發(fā)酵過程
[0043]PDB培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200g (去皮)，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。
[0044]大量固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方(質(zhì)量百分含量):
[0045]固料:稻糠85%，麩皮15% ；
[0046]無機(jī)鹽溶液:磷酸二氫鉀3.5%，硫酸鎂0.04%,硫酸銨4%，剩余為水。
[0047]固液比為1:1.8 (質(zhì)量比)。
[0048]肉桂柴正青霉(E.cinnamopurpureum) WHP-1大量固體發(fā)酵過程:
[0049]①菌種種子液培養(yǎng):將肉桂柴正青霉(E.cinnamopurpureum) WHP-1從試管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液體培養(yǎng)基中，28°C搖床振蕩培養(yǎng)3~5d，此為種子液。
[0050]②固體生產(chǎn)菌種的培養(yǎng):將種子液按10%的比例接種到固體培養(yǎng)基(500mL三角瓶)中，28°C恒溫培養(yǎng)3~5d，中間多次振蕩。
[0051]③大量固體發(fā)酵:將②中固體培養(yǎng)的培養(yǎng)物用無菌水按1:15比例稀釋，并用滅菌紗布過濾，出去粗渣，即為生產(chǎn)菌液，接種比例按1:6接種于大量發(fā)酵培養(yǎng)基。將接種的原料置于發(fā)酵室(28°C和相對濕度85%以上)中發(fā)酵培養(yǎng)8~9d，即可得到肉桂柴正青霉原粉，其有效活菌數(shù)大于2X 108cfu/g。
[0052]實施例3肉桂柴正青霉(E.cinnamopurpureum) WHP-1水稻小區(qū)試驗
[0053]試驗材料:肉桂柴正青霉(E.cinnamopurpureum) WHP-1的發(fā)酵液(步驟①得到的種子液)，具有溶磷的功效，有效活菌數(shù)大于2.5X108cfu/mL.[0054]試驗時間:2012年6月~2012年11月
[0055]試驗地點:莒南縣筵賓鎮(zhèn)杜家莊村
[0056]供試作物:臨稻16
[0057]試驗土壤:粘土
[0058]試驗設(shè)計:以不同稀釋度(10倍、20倍、30倍)的肉桂柴正青霉(E.cinnamopurpureum) WHP-1發(fā)酵液拌種水稻種子作為示范，以基質(zhì)培養(yǎng)基拌種水稻種子作為對照(CK)，每個處理三個平行，小區(qū)面積20m2，隨機(jī)分布。
[0059]施肥量與施肥方法:播種前，采用不同稀釋度(10倍、20倍、30倍)的肉桂柴正青霉(E.c i nnamopurpur eum )WHP-1發(fā)酵液和基質(zhì)培養(yǎng)基拌種,其他措施同當(dāng)?shù)?統(tǒng)一燒水、間苗、
除草等田間管理措施。
[0060]農(nóng)藝性狀及產(chǎn)質(zhì)量調(diào)查:于收獲前一天測量全株葉片數(shù)、株高、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重。
[0061]表1水稻農(nóng)藝性狀調(diào)查表
【權(quán)利要求】
1.肉桂柴正青霉(Eupenicilliumcinnamopurpureum)菌株WHP-1,所述菌株的保藏編號為 CGMCC N0.8128。
2.權(quán)利要求1所述的肉桂柴正青霉(Eupenicilliumcinnamopurpureum)菌株WHP-1在為農(nóng)作物提供可利用的有效磷方面的用途。
3.一種微生物菌劑，包括權(quán)利要求1所述的肉桂柴正青霉(Eupenicilliumcinnamopurpureum)菌株 WHP-1。
4.一種制備權(quán)利要求3所述的微生物菌劑的方法，其特征是，包括以下步驟: (O制備肉桂柴正青霉菌株WHP-1的種子液； (2)將步驟(I)制備的種子液接種到固體培養(yǎng)基中，28-30°C下恒溫培養(yǎng)； (3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物加入無菌水混合，過濾，將濾液接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基，在室溫28-30°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； 所述步驟(2)中的固體培養(yǎng)基由固料和無機(jī)鹽溶液組成，所述固料和無機(jī)鹽溶液的質(zhì)量比為1:1.8 ;所述固料由質(zhì)量比為85:15的稻糠和麩皮組成；按質(zhì)量百分比計，所述無機(jī)鹽溶液包含3.5%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水；所述步驟(3)中的大量發(fā)酵培養(yǎng)基同步驟(2)的固體培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是， (1)將肉桂柴正青霉菌株WHP-1的孢子移植到PDB液體培養(yǎng)基中，28°C搖床振蕩培養(yǎng)3~5d得到種子液；所述PDB液體培養(yǎng)基為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水IOOOmL ； (2)將步驟(I)制備的種子液按質(zhì)量比10%的比例接種到固體培養(yǎng)基中，28°C下振蕩培養(yǎng)3~5d ; (3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物加入其質(zhì)量15倍的無菌水混合，過濾，將濾液按體積比1:6的比例接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫28°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室中發(fā)酵培養(yǎng)8~9d。
6.權(quán)利要求4所述的微生物菌劑在在為農(nóng)作物提供可利用的有效磷方面的用途。
【文檔編號】C09K101/00GK103468593SQ201310444785
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】劉幸紅, 牛贍光, 王清海, 段春華, 鄭香軍, 周峰 申請人:山東省林業(yè)科學(xué)研究院