海南毒素-IV類似物rHNIV-01的表達(dá)載體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速、高純度的制備具有生物活性的重組海南毒素-IV類似物rHNIV-01的表達(dá)載體及其制備方法。rHNIV-01與天然海南毒素-IV(HNTX-IV)相比，氨基酸序列組成幾乎全部一樣，僅在C末端沒(méi)有進(jìn)行酰胺化修飾。該方法并不使用常規(guī)的親和層析純化融合蛋白，而是直接在破菌產(chǎn)物中加入蛋白激酶進(jìn)行切割，接著用三氯乙酸(TCA)抽提法直接將切割產(chǎn)物rHNIV-01進(jìn)行選擇性的活性抽提，最后使用RP-HPLC進(jìn)行純化。使用該方法能夠穩(wěn)定獲得3mg/L的高純度rHNIV-01。純化的rHNIV-01能夠選擇性的抑制大鼠DRG細(xì)胞上的TTX-S敏感型鈉電流。
【專利說(shuō)明】海南毒素-IV類似物rHN IV-01的表達(dá)載體及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種海南毒素-IV類似物rHNIV-ΟΙ的表 達(dá)載體及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肽類藥物由于其選擇性高，體內(nèi)無(wú)結(jié)存等特點(diǎn)，越來(lái)越受到各大制藥公司的青睞。 特別是含有多對(duì)二硫鍵的多肽分子比線性多肽分子具有更加優(yōu)秀的穩(wěn)定性和吸收性，因此 是藥物設(shè)計(jì)開發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。天然海南毒素-IV(HNTX-IV)是從我國(guó)特有的海南捕鳥蛛里 面分離到的一種神經(jīng)多肽類毒素。它含有35個(gè)氨基酸，C端有酰胺化修飾，含有三對(duì)二硫 鍵，且二硫鍵的配對(duì)是典型的ICK模體（Cys2-Cysl7, Cys9-Cys24, Cysl6-Cys31)。通過(guò)前 期研究結(jié)果表明HNTX-IV能夠選擇性的高效抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG)細(xì)胞上的河豚毒素 敏感（TTX-S)型電壓敏感鈉通道（VGSC)電流。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，HNTX-IV的結(jié)構(gòu)中 有一個(gè)富含正電荷的表面（Lys27，His28，Arg29，Lys32)，該表面對(duì)于HNTX-IV結(jié)合VGSC有 重要的作用。為了更好的研究和開發(fā)HNTX-IV，使其直接成藥或者作為藥物先導(dǎo)分子開發(fā)， 勢(shì)必需要制備一系列的HNTX-IV類似物以供研究。
[0003] rHNIV-ΟΙ作為一種重要的HNTX-IV類似物，與天然HNTX-IV相比，僅在C端缺少酰 胺化修飾，rHNIV-ΟΙ 對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為：ECLGFGKGCNPSNDQCCKSS NLVCSRKHRWCKYEI(SEQ ID NO. 11)。獲取rHNIV-01-般通過(guò)化學(xué)合成或者利用微生物進(jìn)行異源表達(dá)。根據(jù)專利申 請(qǐng)人多年的多肽制備經(jīng)驗(yàn)，氨基酸長(zhǎng)度在30個(gè)以上，同時(shí)含有多對(duì)二硫鍵的小分子多肽， 因需要反復(fù)的變復(fù)性（形成二硫鍵）和純化，導(dǎo)致其成本相當(dāng)昂貴；利用微生物進(jìn)行重組表 達(dá)則成本相對(duì)低廉很多。通過(guò)微生物獲取工業(yè)級(jí)別的大量重組多肽，只能是通過(guò)大腸桿菌 或者畢赤酵母。但是使用畢赤酵母，存在產(chǎn)物均一化程度不高的問(wèn)題，而且相對(duì)大腸桿菌制 備，有更高的技術(shù)門檻。目前還沒(méi)有使用大腸桿菌來(lái)制備rHNIV-ΟΙ類似物的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種海南毒素-IV類似物rHNIV-ΟΙ的表達(dá) 載體。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0006] 所述海南毒素-IV類似物rHNIV-ΟΙ的表達(dá)載體的序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0007] 本發(fā)明還提供了上述表達(dá)載體的制備方法，該方法是以pET_43a載體為模板，用 SEQ ID N0. 5 -10所示的引物進(jìn)行無(wú)縫克?。簩⒕幋aGST序列替換pET-43a載體中的NusA 序列，同時(shí)將編碼SUMO序列插入編碼GST序列的下游，再將編碼rHNIV-01序列插入編碼 SUM0序列ULP1酶切割識(shí)別位點(diǎn)的下游，得PCR產(chǎn)物；將PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpnl消化后直接轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌DH5 α培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證，即得rHNIV-01的表達(dá)載 體，命名為pWE-rHNIV-01，其序列如SEQ ID N0. 4所示；其中所述編碼GST序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼SUMO序列如SEQ ID NO. 2所示，編碼rHNIV-01序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了上述述海南毒素-IV類似物rHNIV-01的制備方法，包括如下步 驟：
[0009] (1)將上述表達(dá)載體pWE-rHNIV-ΟΙ轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，然后將大腸桿菌培養(yǎng)后進(jìn) 行rHNIV-01融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；
[0010] (2)將經(jīng)步驟（1)誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌菌體懸浮后破碎并離心，將離心所得上 清液經(jīng)透析并再次離心后用ULP1激酶消化，得消化產(chǎn)物；
[0011] (3)向消化產(chǎn)物中加入質(zhì)量百分比濃度為6-8%的TCA，抽提rHNIV-01融合蛋白， 得到rHNIV-01融合蛋白溶液，經(jīng)透析后冷干保存；
[0012] (4)將步驟（5)所得凍干保存的透析產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC純化后得純化后的 rHNIV-01〇
[0013] 本發(fā)明還提供了一種用于制備上述表達(dá)載體的試劑盒，所述試劑盒包括SEQ ID NO. 5 -10所示的引物。
[0014] 本發(fā)明中所涉及的其他各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作技術(shù)，文中沒(méi)有特 別說(shuō)明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書、科 技文獻(xiàn)或相關(guān)的說(shuō)明書、手冊(cè)等加以實(shí)施。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0016] 本發(fā)明將GST與SUM0蛋白一起作為助溶蛋白標(biāo)簽，該組合能有效的對(duì)含有三對(duì)二 硫鍵的rHNIV-01進(jìn)行助溶。同時(shí)SUM0序列本身也是ULP1激酶的切割識(shí)別位點(diǎn)，能夠使用 ULP1激酶來(lái)有效分離目的蛋白。
[0017] 本發(fā)明打破常規(guī)的思路（常規(guī)的TCA沉淀，目的是將目的蛋白沉淀下來(lái)），利用 rHNIV-01具有ICK結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（具有ICK結(jié)構(gòu)的多肽對(duì)極端的酸、堿環(huán)境具有很高的抗 性），采用TCA強(qiáng)酸作為變性劑能夠選擇性的變性并沉淀出絕大部分的細(xì)胞雜蛋白，從而能 夠快速的分離出具有生物活性結(jié)構(gòu)的rHNIV-01 (rHNIV-01以可溶的形式留在上清中），是 一種逆使用TCA沉淀法。
[0018] 通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)，最終純化的重組rHNIV-01，能夠顯著抑制大鼠 DRG細(xì)胞 上的TTX-S型VGSC電流。
[0019] 總之，本發(fā)明并不使用常規(guī)的親和層析純化融合蛋白，而是直接在破菌產(chǎn)物中加 入蛋白激酶進(jìn)行切割，接著用三氯乙酸（TCA)抽提法直接將切割產(chǎn)物rHNIV-01進(jìn)行選擇 性的活性抽提，最后使用RP-HPLC進(jìn)行純化。提供了一種較為理想的利用大腸桿菌來(lái)進(jìn)行 rHNIV-01的重組表達(dá)方案，并且提供一種較傳統(tǒng)方法（需要使用鎳柱、GST柱子等親和層 析）而言更為快速，低廉的純化方法。使用該方法能夠穩(wěn)定獲得3mg/L的高純度rHNIV-01。 純化的rHNIV-01能夠選擇性的抑制大鼠 DRG細(xì)胞上的TTX-S敏感型鈉電流。本發(fā)明該制 備策略同樣有可能適用于使用大腸桿菌制備基于的各種突變體或者類似物，而不僅僅限于 制備 rHNIV-01。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為表達(dá)載體pWE-rHNIV-ΟΙ的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021] 圖2為不同誘導(dǎo)溫度下rHNIV-01融合蛋白的可溶性分析；其中，泳道Μ是蛋白分 子量marker ;泳道1和3是將菌體超聲破碎后，離心后的上清；泳道2和4是將菌體超聲破 碎后，離心后的沉淀；
[0022] 圖3為不同濃度的TCA抽提效果；泳道Μ是標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker ;其余泳道均是不 同TCA濃度下的上清樣品；
[0023] 圖4是rHNIV-ΟΙ的RP-HPLC分離圖與質(zhì)譜鑒定；其中，圖A是rHNIV-ΟΙ的RP-HPLC 分離圖，*號(hào)標(biāo)記的峰含有rHNIV-01 ;圖B是*號(hào)標(biāo)記的峰的質(zhì)譜鑒定結(jié)果；
[0024] 圖5是rHNIV-ΟΙ對(duì)DRG細(xì)胞上的不同類型的電壓敏感鈉電流抑制作用；其中圖A 是不同濃度下的rHNIV-01對(duì)TTX-S電壓敏感鈉電流的抑制作用；圖B是10 μ m的rHNIV-01 對(duì)TTX-R電壓敏感鈉電流的抑制作用。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1表達(dá)載體pWE-rHNIV-ΟΙ的構(gòu)建及其使用
[0026] 以本實(shí)驗(yàn)室留存的pET_43a載體為模版，使用基于PCR原理的無(wú)縫克隆的方法 (具體實(shí)驗(yàn)方法，參見 Journal of Biochemicaland Biophysical Methods67 (1),67 - 74. (2006))，分別將編碼GST的序列（SEQ ID NO. 1)替換原有的NusA序列，同時(shí)將編碼SUMO的 序列（SEQ ID NO. 2)插入GST下游，最后將編碼rHNIV-01的序列（SEQ ID NO. 3)插入SUMO 的ULP1酶切割識(shí)別位點(diǎn)下游（圖1)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Dpnl消化后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α， 提取質(zhì)粒后經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證，最終獲得含有GST+SUM0+rHNIV-01表達(dá)框的原核表達(dá)質(zhì)粒，并 命名為pWE-rHNIV-01，序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0027] 所使用的引物如下，其中下劃線標(biāo)記的部分是與插入的質(zhì)粒互補(bǔ)，斜體標(biāo)記的部 分是與目的基因互補(bǔ)：
[0028] 用來(lái)將GST序列進(jìn)行無(wú)縫克隆的上下游引物分別為GST-001，GST-002
[0029] >GST-001
[0030] 5?-GAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCCCCTATACTAGGTTATTG-3' (S EQ ID NO. 5)
[0031] >GST-002
[0032] 5 '-GATGGTGATGGTGATGACCAGAACCACTAGTAGTCACGATGCGGCCGCTC-3 ' (SEQ ID Ν0· 6)
[0033] 用來(lái)將SUMO序列進(jìn)行無(wú)縫克隆的上下游引物分別為SUM0-001，SUM0-002
[0034] > SUM0-001
[0035] 5 '-TCCGGGAGCTCGTGGATCCGAATTCTCTGACTCTGAAGTTAACCAGGAAG-3 ' (SEQ ID Ν0· 7)
[0036] >SUM0-002
[0037] 5, -CGATGGTACCGTCGACGTCCTGCAGACCACCGATCTG TTCACGGTGAG-3,（SEQ ID NO. 8)
[0038] 用來(lái)將HNTX-IV序列進(jìn)行無(wú)縫克隆的上下游引物分別為rHNIV-01-001， rHNIV-01-002
[0039] >rHNIV-01-001
[0040] 5? -AAGCTCACCGTGAACAGATCGGTGGTGAGTGCTTAGGGTTTGGCAAGG-3 ' (SEQ ID Ν0· 9)
[0041] >rHNIV-01-002
[0042] 5 '-CGATGGTACCGTCGACGTCCTGCAGTTATATTTCATATTTACACCACCTATGTTTC-3 '（SEQ ID NO. 10)
[0043] 實(shí)施例2表達(dá)質(zhì)粒pWE-rHNIV-〇l的誘導(dǎo)表達(dá)
[0044] 采用常規(guī)的氯化鈣轉(zhuǎn)化法，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，然后涂布于1氨 芐抗性（100 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基，37度倒置放置16小時(shí)。次日，挑取1-2個(gè)單菌落， 接種于5mL氨芐抗性LB培養(yǎng)液，37度220rpm進(jìn)行培養(yǎng)，直到0D_到1附近（此步是種子 培養(yǎng)基的富集）。將5mL種子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入新鮮的500mL LB (100 μ g/mL氨芐）培養(yǎng)液，繼續(xù) 37度220rpm進(jìn)行培養(yǎng)，直至0D6QQ到0. 6附近，此時(shí)加入終濃度為0. 5mM的IPTG進(jìn)行37度 誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為4小時(shí)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，含有rHNIV-ΟΙ的融合蛋白在16度也可 以部分可溶的形式正常表達(dá)（圖2)。該表達(dá)質(zhì)粒同樣適用于Rosetta、Origami、SHuffle 系列的表達(dá)菌株。但是BL21(DE3)菌株是首選，因?yàn)橥瑯訔l件下其生長(zhǎng)速度最快，菌密度最 商。
[0045] 實(shí)施例3 rHNIV-ΟΙ融合蛋白的初步分離純化及蛋白激酶消化
[0046] 將實(shí)施例2中的誘導(dǎo)完成的菌體，4500g離心10分鐘，獲取菌體。然后加入合適體 積的PBS緩沖液重懸菌體，接著進(jìn)行超聲破碎。超聲破碎完成后，15000rpm離心10分鐘，獲 得上清與沉淀。取合適長(zhǎng)度的透析膜（截留分子量為35kDa)將離心后的超聲上清進(jìn)行透 析，4度透析過(guò)夜。透析完成后，將透析袋內(nèi)的液體進(jìn)行高速離心，取透析上清進(jìn)行后續(xù)實(shí) 驗(yàn)。在上清加入合適劑量的ULP1激酶（用以釋放rHNIV-ΟΙ)，30度消化4小時(shí)。
[0047] 實(shí)施例4 TCA沉淀
[0048] 向?qū)嵤├?中的消化產(chǎn)物加入終濃度在7%左右的TCA，4度放置15分鐘，最后 15000g離心15分鐘。此步驟可以選擇性的將切割釋放的rHNIV-ΟΙ抽提出來(lái)，而絕大部分 的細(xì)胞碎片會(huì)被TCA沉降。通過(guò)圖3,我們可以看出終濃度在6-8%的TCA對(duì)于rHNIV-01 的抽提效果最優(yōu)，此時(shí)雜蛋白最大限度的被變性沉淀，而最多的rHNIV-01以可溶形式在上 清中得到保留。
[0049] 離心后上清，用去離子水作為交換溶液，用透析袋（截留分子量在lkDa)迅速進(jìn)行 透析，4度透析4小時(shí)，中間換3次去離子水，最終透析袋內(nèi)的液體凍干暫時(shí)保留。
[0050] 實(shí)施例5 RP-HPLC純化
[0051] 實(shí)施例4中最終的凍干后的透析產(chǎn)物加入2mL去離子水進(jìn)行復(fù)溶，lOOOOrpm離心 5分鐘,取上清。使用0.45 μ m的濾頭將上一步的上清進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的液體進(jìn)行HPLC 純化。使用waters公司的SYMMETRY C18(4. 6mm X250mm)柱子，5-65%的乙腈洗脫梯度， 流速是lmL/min的分離體系，同時(shí)使用215nm與280nm的雙波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)洗脫的組分。分離的 每一個(gè)峰用質(zhì)譜鑒定其純度及精確分子量。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，洗脫時(shí)間在20. 5分鐘的峰含有 rHNIV-01 (圖 4)。
[0052] 實(shí)施例6電生理檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
[0053] 采用標(biāo)準(zhǔn)的SD大鼠 DRG細(xì)胞獲取方案，然后使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)DRG細(xì) 胞上的TTX-S或者TTX-R電壓敏感鈉通道電流。使用德國(guó)HEKA公司的EPC-10放大器與 Sutter公司的P-97電極拉制儀。細(xì)胞內(nèi)液的配方如下：145mM CsCl，4mM MgCl2,6H20，10mM HEPES，10mM EGTA，10mM Glucose，2mM ΑΤΡ9(ρΗ7·2);細(xì)胞外液的配方如下：145mM NaCl， 2. 5mM KC1，1. 5mM CaCl2,1. 2mM MgCl2 · 6H20, lOmM HEPES，lOmM D-Glucose(pH7. 4)。在檢 測(cè)TTX-R型電流時(shí)，在細(xì)胞外液中加入了終濃度為300nM的TTX毒素用來(lái)封閉DRG細(xì)胞上 的TTX-S敏感型鈉電流。通過(guò)檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，rHNIV-01，終濃度為100nM時(shí)，能夠顯著抑制 大鼠 DRG細(xì)胞上的TTX-S型鈉電流；而在終濃度為10 μ Μ時(shí)，rHNIV-01對(duì)TTX-R型鈉電流 卻無(wú)明顯抑制（圖5)。
[0001] SEQUENCE LISTING <110>中國(guó)人民解放軍國(guó)防科學(xué)技術(shù)大學(xué) <120>海南毒素-IV類似物rHNrV-01的表達(dá)載體及其制備方法 <160> 11 <1 70> Patcnthi version 3.3 <210> 1 <211> 717 <2I2> DNA <213>合成 <4()()> 1 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tegaettett 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agegegatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagegtgea gagatttcaa tgettgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgea tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga egetettgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc aciiaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagea 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ctggttccgc gtggatcccc gaattcccgg gtcgactcga gcggccgcat cgtgact 717 <2I0> 2 <211> 291 <2I2> DNA
[0002] <213>合成 <400> 2 tctgactctg aagttaacca ggaagctaaa ccggaagtta aaccggaagt taaaccggaa 60 acccacatca acctgaaagt ttctgacggt tcttctgaaa tcttcttcaa aatcaaaaaa 120 accaccccgc tgcgtcgtct gatggaagct ttcgctaaac gtcagggtaa agaaatggac 180 tctctgcgtt tcctgtacga cggMcugt attcaggctg accagacccc ggaagacctg 240 gacatggaag acaac^acat catcgaagct caccgtgaac agatcggtgg t 291 <2\0> 3 <211> 105 <212> ΟΝΛ <213> 合成 <400> 3 gagtgcttag ggtttggcaa gggatgcaac ccttcaaatg accagtgctg caagagctcg 60 aacctagttt gcagccggaa acataggtgg tgtaaatatg aaata 105 <2W> 4 <211> 6893 <2I2> [)ΝΛ <2I3> 含成 <400> 4 ttggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 60 gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 120 cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 180 ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 240 cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 300 tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 36U cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 420
[0003] aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttct ggcggcacga 480 tggcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 540 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 600 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 660 cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 720 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 780 cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 840 ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 900 aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 960 atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 1020 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 1080 gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 1140 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 1200 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 1260 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 1320 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttttactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 1380 nnciiggaiigg c;uu3Htgccg CHiUiiUKiggg iiiitiuigggcg HCiicggiuiat grtgiuitnct 1440 catactcttc ctttttcaat catgattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 1500 gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg tcatgaccaa aatcccttaa 1560 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1620 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1680 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1740
[0004] agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1800 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1860 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1920 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1980 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 2040 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 2lU〇 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2160 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2220 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2280 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2340 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2400 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2460 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2520 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2580 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2640 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2700 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2760 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2820 ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2880 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2940 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 3000 tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 3060
[0005] tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3120 cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3180 gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3240 ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgctagtca tgccccgcgc 3300 ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag atcccggtgc 3360 ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 3420 aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cg^ccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 3480 tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct 3540 tcaccgcctg gccctgagag agtt^cagca agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc 36U0 gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 3660 cgtatcccac taccgagatg tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 3720 ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 3780 tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 3840 ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 3900 ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 3960 gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 4020 tctggtcaga. gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 4080 tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 4140 gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 4200 cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 4260 gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 4^20 gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 4380
[0006] ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 4440 cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 4500 tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg 4560 ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag tagtaggttg 4620 aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt 4680 cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag 4740 tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct 4800 gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat cgatctcgat 4860 cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta 4920 gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gtccoctata ctaggttatt 4980 ggaaaattaa gggccttgtg caacccactc gacttctttt ggaatatctt gaagaaaaat 5U40 atgaagagca tttgtargag cgcgatgaag gtgataaatg gcgaaactuia aagtttgaat 51 ()() tgggtttgga gtttcccaat cttccttatt atattgatgg tgatgttaaa ttaacacagt 5160 ctatggccat catacgttat atagctgaca agcacaacat gttgggtggt tgtccaaaag 5220 agcgtgcaga gatttcaatg cttgaaggag cggttttgga tattagatac ggtgtttcga 5280 gaattgcata tagtaaagac tttgaaactc tcaaagttga ttttcttagc aagctacctg 5340 aaatgctgaa aatgttcgaa gatcgtttat gtcataaaac atatttaaat ggtgatcatg 5400 taacccatcc tgacttcatg ttgtatgacg ctcttgatgt tgttttatac atggacccaa 5460 tgtgcctgga tgcgttccca aaattagttt gttttaaaaa acgtattgaa gctatcccac 5520 aaattgataa gtacttgaaa tccagcaagt atatHgcatg gcctttgcag ggctggcaag 5580 ccacgtttgg tggtggcgac catcctccaa aatcggatct ggttccgcgt ggatccccga 5640 attcccgggt cgactcgagc ggccgcatcg tgactactag tggttctggt catcaccatc 5700
[0007] accatcactc cgcgggtaaa gaaaccgctg ctgcgaaatt tgaacgccag cacatggact 5760 cgccaccgcc aactggtctg gtcccccggg gcagcgcggg ttctggtacg attgatgacg 5820 acgacaagag tccgggagct cgtggatccg aattctctga ctctgaagtt aaccaggaag 5880 ctaaaccgga agttaaaccg gaagttaaac cggaaaccca catcaacctg aaagtttctg 5940 acggttcttc tgaaatcttc ttcaaaatca aaaaaaccac cccgctgcgt cgtctgatgg 6000 aagctttcgc taaacgtcag ggtaaagaaa tggactctct gcgtttcctg lacgacggta 6060 tccgtatcca ggctgaccag accccggaag acctggacat ggaagacaac gacatcatcg 6120 aagctcaccg tgaacagatc ggtggtgagt gcttagggtt tggcaaggga tgcaaccctt 6180 caaatgacca gtgctgcaag agctcgaacc tagtttgcag ccggaaacat aggtggtgta 6240 aatatgaaat ataactgcag gacgtcgacg gtaccatcga tacgcgttcg aagcttgcgg 6300 ccgcacagct gtatacacgt gcaagccagc cagaactcgc tcctgaagac ccagaggatc 6360 tcgagcacca ccaccaccac cactaatgtt aattaagttg ggcgttccta ggctgataaa 6420 acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga 6480 agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg 6540 ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 6600 gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gggagcggatttgaacgttg 6660 cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcatui 6720 ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact cttttgttta 6780 tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg 6840 cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc gga 6893 <2I0> 5 <21l> 61
[0008] <212> DNA <213>合成 <400> 5 gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gtcccctata ctaggttatt 60 g 61 <21()> 6 <21l> 50 <212> DNA <213>合成 <400> 6 gatggtgatg gtgatgacca gaaccactag tagtcacgat gcggccgctc 50 <2!0> 7 <211> .50 <212> DNA <213> 合成 <400> 7 tccgggagct cgtggatccg aattctctga ctctgaagtt aaccaggaag 50 <210> 8 <21l> 48 <212> DNA <213> 合成 <400> 8 cgatggtacc gtcgacgtcc tgcagaccac cgatctgttc acggtgag 48 <210> 9 <21!> 48 <212> DNA <213>合成 <400> 9 aagctcaccg tgaacagatc ggtggtgagt gcttagggtt tggcaagg 48
[0009] <2Ι0> ΙΟ <21 卜 56 <2I2> DMA <213>合成 <400> 10 cgatggtacc gtcgacgtcc tgcagttata tttcatattt acaccaccta tgtttc 56 <2I0> 11 <211> 35 <2I2> PRT <213>合成 <400> 11 Glu Cys Leu Gly Phc Gly Lys Gly C、ys /\sn Pro ScrAsn Asp Gin Cys 1 5 10 15 Cys Lys Ser SerAsn Leu Val Cys Ser /\rg Lys His Arg Trp Cys Lys 20 25 30 TyrGlu lie 35
【權(quán)利要求】
1. 一種海南毒素-IV類似物rHNIV-01的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體序列如 SEQ ID NO. 4 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，所述方法是以pET-43a載體 為模板，用SEQ ID NO. 5 -10所示的引物進(jìn)行無(wú)縫克?。簩⒕幋aGST序列替換pET-43a載 體中的NusA序列，同時(shí)將編碼SUMO序列插入編碼GST序列的下游，再將編碼rHNIV-01序 列插入編碼SUMO序列ULP1酶切割識(shí)別位點(diǎn)的下游，得PCR產(chǎn)物；將PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpnl消化 后轉(zhuǎn)入大腸桿菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證正確，即得rHNIV-01的表達(dá)載體，命名為 pWE-rHNIV-01，其序列如SEQ ID NO. 4所示；其中所述編碼GST序列如SEQ ID NO. 1所示， 編碼SUMO序列如SEQ ID NO. 2所示，編碼rHNIV-01序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌為大腸桿菌DH5a。
4. 如權(quán)利要求1所述海南毒素-IV類似物rHNIV-01的制備方法，其特征在于，所述方 法包括如下步驟： (1) 將權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，然后將大腸桿菌培養(yǎng)后進(jìn) 行rHNIV-01融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)； (2) 將經(jīng)步驟（1)誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌菌體懸浮后破碎并離心，將離心所得上清液 經(jīng)透析并再次離心后用ULP1激酶消化，得消化產(chǎn)物； (3) 向消化產(chǎn)物中加入質(zhì)量百分比濃度為6 - 8%的TCA，抽提rHNIV-01融合蛋白，得 到rHNIV-01融合蛋白溶液，經(jīng)透析后冷干保存； (4) 將步驟（5)所得凍干保存的透析產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC純化后得純化后的rHNIV-01。
5. 用于制備權(quán)利要求1所述表達(dá)載體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括SEQ ID NO. 5 -10所示的引物。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK104099362SQ201410330373
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月11日
【發(fā)明者】孟爾, 張東裔, 張輝, 鮑邵衡, 李文穎, 吳磊, 朱凌云, 柳瓏 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍國(guó)防科學(xué)技術(shù)大學(xué)