間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑和間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題是提供能導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑。本發(fā)明提供含有選自菩提樹提取物、牡丹皮提取物、粗糠柴提取物、兒茶鉤藤提取物、舌巖白菜提取物和櫻提取物中的至少1種的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑。
【專利說明】間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑和間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法
[0001]本申請是申請日為2011年3月11日、申請?zhí)枮?01180026657.X、發(fā)明名稱為“間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑和間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法”的專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑和間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法。
【背景技術(shù)】
[0003]作為尚未分化、并能夠分化成各種組織細(xì)胞的干細(xì)胞，已知作為受精卵未分化的狀態(tài)的細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、作為已分化組織中所含有的尚未分化的狀態(tài)的細(xì)胞的成體干細(xì)胞等。[0004]成體干細(xì)胞存在于體內(nèi)的各種組織之中，作為成體干細(xì)胞，已知例如骨髓中存在的間充質(zhì)系干細(xì)胞。
[0005]間充質(zhì)系干細(xì)胞是指能夠分化成骨骼、肌肉、脂肪等屬于間充質(zhì)系的細(xì)胞但尚未分化的細(xì)胞。此外，該細(xì)胞作為還能分化為神經(jīng)細(xì)胞等外胚層性的細(xì)胞、肝細(xì)胞等內(nèi)胚層性的細(xì)胞也為人們所知。
[0006]并且，間充質(zhì)系干細(xì)胞作為能通過在已失去功能的組織中分化成其組織細(xì)胞來恢復(fù)組織的功能的細(xì)胞受到關(guān)注。具體地說，例如來自骨髓的間充質(zhì)系干細(xì)胞作為能夠隨著血流被導(dǎo)引而向有炎癥的組織或者受到損傷的組織聚集，受到用于誘導(dǎo)分化的分化誘導(dǎo)劑的影響而向該組織細(xì)胞分化的細(xì)胞而受到關(guān)注。
[0007]此外，一直以來，已知各種能使間充質(zhì)系干細(xì)胞分化為各種組織細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。例如已知含有作為血小板衍生生長因子(Platelet-Derived Growth Factor)的TOGF-BB、且能使間充質(zhì)系干細(xì)胞分化為肌肉組織細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑等(專利文獻(xiàn)I)。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)1:國際公開W02005/063967號小冊子
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]發(fā)明要解決的課題
[0012]然而，這種分化誘導(dǎo)劑雖然具有使間充質(zhì)系干細(xì)胞分化為特定組織細(xì)胞的性能，但存在如下問題:關(guān)于例如將隨著血流在體內(nèi)循環(huán)的來自骨髓的間充質(zhì)系干細(xì)胞向體內(nèi)特定組織導(dǎo)引等這樣的、導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞的性能，未必能滿足。
[0013]本發(fā)明的課題是，考慮上述的問題點(diǎn)，以提供能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑，并且提供通過所述導(dǎo)引劑來導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法。
[0014]用于解決課題的方法
[0015]本發(fā)明所涉及的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑的特征在于，含有選自菩提樹提取物、牡丹皮提取物、粗糠柴提取物、兒茶鉤藤提取物、舌巖白菜提取物和櫻提取物中的至少I種。
[0016]本發(fā)明所涉及的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法的特征在于，通過上述導(dǎo)引劑來導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞。
[0017]發(fā)明的效果
[0018]本發(fā)明的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑具有能導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞這樣的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是顯示細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)中的情況的示意圖。
[0020]圖2是顯示使用實(shí)施例1的導(dǎo)引劑進(jìn)行的細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
[0021]圖3是顯示使用實(shí)施例2的導(dǎo)引劑進(jìn)行的細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
[0022]圖4是顯示使用實(shí)施例3的導(dǎo)引劑進(jìn)行的細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
[0023]圖5是顯示使用實(shí)施例4的導(dǎo)引劑進(jìn)行的細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
[0024]圖6是顯示使用實(shí)施例5的導(dǎo)引劑進(jìn)行的細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
[0025]圖7是顯示使用實(shí)施例6的導(dǎo)引劑進(jìn)行的細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
[0026]圖8是顯示使用陰性對照和陽性對照進(jìn)行的細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下關(guān)于本發(fā)明的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑的實(shí)施方式進(jìn)行說明。
[0028]本實(shí)施方式的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑含有選自菩提樹提取物、牡丹皮提取物、粗糠柴提取物、兒茶鉤藤提取物、舌巖白菜提取物和櫻提取物中的至少I種
[0029]上述菩提樹提取物，是將椴樹科(Tiliaceae)的植物用提取溶劑提取而得到的物質(zhì)。作為鍛樹科(Tiliaceae)的植物,可列舉大葉鍛(Tilia platyphyllos Scop.)、心葉鍛(Ti lia.cor data Mill.)、歐洲鍛(Tilia.europaea L.)或其他近緣植物。其中，作為鍛樹科(Tiliaceae)的植物,在更能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的方面,優(yōu)選心葉鍛(Tilia.cordataMill.)。即，作為上述的菩提樹提取物，優(yōu)選為心葉椴提取物。
[0030]作為上述椴樹科植物的提取部位，不特別限定，可列舉例如，花、果實(shí)、樹皮等。其中，作為被提取的部位，在更能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的方面，優(yōu)選為花。
[0031]作為上述牡丹皮提取物，是將茍藥科茍藥屬牡丹(Paeonia suffruticosaAndrews)的根皮用提取溶劑提取而得的物質(zhì)。
[0032]上述粗糠柴提取物,是將屬于大戟科的粗糠柴(Mallotus philippinensis)用提取溶劑提取而得的物質(zhì)。
[0033]作為上述粗糠柴的提取部位，不特別限定，可列舉例如，葉、枝干、
[0034]樹干、樹皮、根等。其中，在更能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的方面，提取部位優(yōu)選為樹皮。
[0035]上述兒茶鉤藤提取物，是將兒茶鉤藤(Uncaria gambir)用提取溶劑提取而得的物質(zhì)。
[0036] 作為上述兒茶鉤藤的提取部位，不特別限定，可列舉例如，葉、嫩枝等。作為上述兒茶鉤藤提取物，在更能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的方面，優(yōu)選將葉和嫩枝雙方用提出溶劑提取而得的物質(zhì)。
[0037]上述舌巖白菜提取物，是將屬于虎耳草科巖白菜屬的舌巖白菜(Pashanbheda)的I種或2種以上用提取溶劑提取而得的物質(zhì)。作為舌巖白菜，可列舉Bergenialigulata(Wall.)Engl.> Bergenia stracheyi (Hook.f.& Thoms.)Engl> 或者 Bergeniaciliata (Haw.) Sternb等。其中，在更能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的方面,優(yōu)選將Bergenialigulata (Wall.)Engl.用提取溶劑提取而得的物質(zhì)。
[0038]作為上述舌巖白菜的提取部位，不特別限定，在更能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的方面，優(yōu)選為根莖。
[0039]上述櫻提取物是將屬于薔薇科(Roaceae)李屬(Primus)的植物用提取溶劑提取而得的物質(zhì)。作為屬于李屬(Prunus)的植物,可列舉例如樓亞屬(Subgen.Cerasus)的大島樓(Prunus.speciosa)、矮樓(Prunus.jamasakura)、大山樓(Prunus.sargentii)、垂枝樓(Prunus.spachiana)、豆樓(Prunus.1ncisa)、深山樓(Prunus.maximowiczii)、染井吉野樓(Prunus x yedoensis)、高嶺樓(Prunus.nipponica)、霞樓(Prunus.1eveilleana)、丁香樓(Prunus.apetala)、日本早樓(Prunus.subhirtella)、日本晚樓(Prunus.1annesiana)、寒樓(Prunus.kanzakura)等。其中，作為屬于李屬(Prunus)的植物,在更能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的方面，優(yōu)選為染井吉野樓(Prunus x yedoensis)。即，作為上述的樓提取物,優(yōu)選為染井吉野櫻提取物。[0040]作為屬于李屬(Prunus)的植物的提取部位，不特別限定，可列舉例如，花、根、葉、果實(shí)、種子等。其中，在更能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的方面，提取部位優(yōu)選為葉。
[0041]上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑，可以單獨(dú)使用上述I種提取物，也可混用2種以上的上述提取物。
[0042]上述植物的各提取物，通?？梢詾槔蒙鲜鎏崛∪軇┑奶崛∫?、其稀釋液、其濃縮液、或除去該提取溶劑后的干燥物的形態(tài)。具體地說，各提取物可以為例如溶液狀、糊劑狀、凝膠狀、粉末狀等形態(tài)。
[0043]作為上述提取溶劑，可列舉水；或者甲醇、乙醇、丙醇等脂肪族一元醇，甘油、丙二醇、1，3- 丁二醇等脂肪族多元醇，丙酮等酮類，乙醚、二5惡烷、乙腈、乙酸乙酯等酯類，二甲苯、苯、甲苯等芳香族類，氯仿等鹵代烴類等有機(jī)溶劑。
[0044]這些有機(jī)溶劑可以單獨(dú)使用I種，或2種以上混合使用，對混合而成的提取溶劑的混合比不特別限定，可適宜調(diào)整。
[0045]作為上述提取溶劑，優(yōu)選為至少包含水的含水提取溶劑。
[0046]此外，作為上述提取溶劑，在更能夠?qū)бg充質(zhì)系干細(xì)胞的方面，更優(yōu)選包含脂肪族一元醇或脂肪族多元醇等脂肪族醇和水的提取溶劑，更優(yōu)選包含脂肪族一元醇和水的提取溶劑，最優(yōu)選包含水和乙醇的提取溶劑。
[0047]作為上述提取溶劑，具體地說，優(yōu)選將脂肪族一元醇或脂肪族多元醇等脂肪族醇和水以脂肪族醇:水=7:3~3:7的體積比混合而成的提取溶劑。
[0048]更具體地說，作為上述提取溶劑，優(yōu)選乙醇和水以乙醇:水=7:3~3:7的體積比混合而成的提取溶劑。
[0049]作為上述提取的方法，不特別限制，可以采用現(xiàn)有公知的一般提取方法。提取中，作為提取原料，可以將各植物的提取部分直接或者干燥使用。并且，通常，提取溶劑量為提取原料的5~15倍(重量比)，提取溫度為20°C~80°C，提取時(shí)間為2小時(shí)~3天。提取后，也可根據(jù)需要進(jìn)行適宜的過濾、脫味、脫色等純化處理。
[0050]作為上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑所含的上述各提取物的濃度，不特別限定，可列舉例如，干燥物換算為0.1%~5.0%重量。
[0051]干燥物換算是指換算成作為從提取液中除去提取溶劑后的殘?jiān)母稍镂锏闹亓俊?br> [0052]接下來，對于本發(fā)明的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法的實(shí)施方式進(jìn)行說明。本實(shí)施方式的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法，是通過上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑來導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞的的方法。
[0053]間充質(zhì)系干細(xì)胞包含于間充質(zhì)系組織的細(xì)胞中，不僅能分化為軟骨、脂肪、肌肉等中胚層性組織的細(xì)胞，還能夠向神經(jīng)等外胚層性組織、肝臟等內(nèi)胚層性組織的細(xì)胞分化。并且，作為所導(dǎo)引的間充質(zhì)系干細(xì)胞，在能夠比較容易地從骨髓采取的方面、已知在血液中也能存在的方面，優(yōu)選為骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞。
[0054]在上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法中,可以在體外(in vitro)、體內(nèi)(in vivo)或者原位(in situ)通過上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑來導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞。
[0055]具體地，例如在體外的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法中，可以實(shí)施使用具備在厚度方向有貫通的微細(xì)孔的膜(membrane)的裝置,在膜的一側(cè)加入間充質(zhì)系干細(xì)胞,另一側(cè)加入上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)弓丨劑，在規(guī)定的時(shí)間將間充質(zhì)系干細(xì)胞導(dǎo)引到膜的另一側(cè)的方法等。
[0056]此外，例如在體外的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法中，可以實(shí)施刮取接種在載玻片上的間充質(zhì)系細(xì)胞的一部分，在刮取的部分加入包含上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從而向刮取部分導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞的方法等。骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引程度可以通過確認(rèn)刮取部分的間充質(zhì)系干細(xì)胞的增殖來評價(jià)。
[0057]此外，例如在體內(nèi)的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法中，可以實(shí)施將含有上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑的水性凝膠埋入普通小鼠的皮下，并向該小鼠的靜脈中注入表達(dá)綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,以下也稱為GFP)的小鼠的骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞，以規(guī)定時(shí)間飼育小鼠，從而向凝膠中導(dǎo)引骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞的方法等。骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引程度可通過測定凝膠中的熒光的強(qiáng)度來評價(jià)。
[0058]此外，例如在體內(nèi)的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法中，可以實(shí)施在將表達(dá)GFP的小鼠的骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞移植到創(chuàng)傷模型小鼠的骨髓的同時(shí)，向該小鼠的創(chuàng)傷部涂布上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑，從而向創(chuàng)傷部導(dǎo)引來自GFP小鼠的骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞的方法等。骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引程度可通過測定創(chuàng)傷部的熒光的強(qiáng)度來評價(jià)。
[0059]此外，例如在原位的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法中，可以實(shí)施在特定組織中應(yīng)用間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑，向該組織誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞的方法等。更具體地說，可以實(shí)施例如，在皮膚的表皮組織上應(yīng)用上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑，來將血液中存在的骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞向表皮組織導(dǎo)引的方法等。
[0060]上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法，在原位的情況下也可適用于除人以外的動(dòng)物。另外，在人中也可以非治療地應(yīng)用。
[0061]此外，作為原位的導(dǎo)引方法中的特定組織，不僅可列舉上述的表皮組織，還可列舉肌肉組織、軟骨組織、肝臟組織等各種組織。[0062]上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法中，可以將上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑稀釋使用。作為用于稀釋的液體不特別限定，例如，可以使用水、生理鹽水、間充質(zhì)系細(xì)胞的培養(yǎng)液等。使用間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑時(shí)，對將該導(dǎo)引劑稀釋而成的稀釋液中的提取物的濃度不特別限定，優(yōu)選以干燥物換算為0.00001~0.05重量％，通過使提取物的濃度以干燥物換算為0.00001重量％以上，具有導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞的性能更優(yōu)異的優(yōu)點(diǎn)。此外，在可以得到對間充質(zhì)系干細(xì)胞的毒性更低的稀釋液的方面，提取物的濃度以干燥物換算優(yōu)選為0.05重量％以下。
[0063]具體地說，在上述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法中，優(yōu)選以干燥物換算為0.00001~0.01重量％的濃度使用含有菩提樹提取物的導(dǎo)引劑，更優(yōu)選以0.0001~0.01
重量％的濃度使用。
[0064]此外，優(yōu)選以干燥物換算為0.00001~0.01重量％的濃度使用含有牡丹皮提取物的導(dǎo)弓丨劑，更優(yōu)選以0.0001~0.01重量％的濃度使用。
[0065]此外，優(yōu)選以干燥物換算為0.00001~0.01重量％的濃度使用含有粗糠柴提取物的導(dǎo)引劑，更優(yōu)選以0 .0001~0.01重量％的濃度使用。
[0066]此外，優(yōu)選以干燥物換算為0.0001~0.05重量％的濃度使用含有兒茶鉤藤提取物的導(dǎo)引劑，更優(yōu)選以0.001~0.01重量％的濃度使用。
[0067]此外，優(yōu)選以干燥物換算為0.00001~0.01重量％的濃度使用含有舌巖白菜提取物的導(dǎo)引劑，更優(yōu)選以0.0001~0.01重量％的濃度使用。
[0068]此外，優(yōu)選以干燥物換算為0.0001~0.05重量％的濃度使用含有染井吉野櫻提取物等櫻提取物的導(dǎo)引劑，更優(yōu)選以0.001~0.01重量％的濃度使用。
[0069]本實(shí)施方式的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑及間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法如上所例示，但本發(fā)明不限于上述例示的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑及間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法。此外，在本發(fā)明中，在不影響本發(fā)明效果的范圍內(nèi)也可采用在一般的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑及間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法中采用的各種方式。
[0070]實(shí)施例
[0071]下面舉實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
[0072]首先，如下所示，通過調(diào)制各提取物來制造僅由各提取物組成的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑。對于其詳細(xì)進(jìn)行說明。
[0073](實(shí)施例1)
[0074]作為實(shí)施例1的菩提樹提取物，調(diào)制心葉椴提取液。詳細(xì)地，將心葉椴(Tilia.cordata Mill)的花干燥粉碎后，取100g加入50體積％的乙醇水溶液1L，在室溫(20°C )下進(jìn)行提取操作3天，再進(jìn)行過濾處理。然后由過濾所得的液體通過減壓干燥而獲得干燥物，將該干燥物用1，3-丁二醇稀釋而調(diào)制心葉椴提取液。該心葉椴提取液由通過減壓干燥法除去提取溶劑后的干燥物重量計(jì)算，包含干燥物0.45重量％。
[0075](實(shí)施例2)
[0076]作為實(shí)施例2的牡丹皮提取物，調(diào)制牡丹皮提取液。詳細(xì)地，將牡丹(Paeoniasuffruticosa Andrews)的根皮干燥粉碎后,取100g加入50體積％的乙醇水溶液1L,在室溫(20°C )下進(jìn)行提取操作3天，再進(jìn)行過濾處理。然后由過濾所得的液體通過減壓干燥而獲得干燥物，將該干燥物用1，3-丁二醇稀釋而調(diào)制牡丹皮提取液。該牡丹皮提取液由通過減壓干燥法除去提取溶劑后的干燥物重量計(jì)算，包含干燥物0.90重量％。
[0077](實(shí)施例3)
[0078]作為實(shí)施例3的粗糠柴提取物，調(diào)制粗糠柴提取液。詳細(xì)地，將粗糠柴(Mallotusphilippinensis Mueller-Argoviensis)的樹皮干燥粉碎后，取200g加入50體積％的乙醇水溶液2L，在保持60~80°C的同時(shí)進(jìn)行提取操作2天，再進(jìn)行過濾處理。然后由過濾所得的液體通過減壓干燥而獲得干燥物，將該干燥物用1，3- 丁二醇稀釋而調(diào)制粗糠柴提取液。該粗糠柴提取液由通過減壓干燥法除去提取溶劑后的干燥物重量計(jì)算，包含干燥物0.20重量％。
[0079](實(shí)施例4)
[0080]作為實(shí)施例4的兒茶鉤藤提取物，調(diào)制兒茶鉤藤提取液。詳細(xì)地，將兒茶鉤藤(Uncaria gambir Roxburgh)的葉和嫩枝干燥粉碎后,取100g加入50體積％的乙醇水溶液2L，在一邊攪拌一邊保持50~70°C的同時(shí)進(jìn)行提取操作3小時(shí)，再進(jìn)行過濾處理。然后由過濾所得的液體通過減壓干燥而獲得干燥物，將該干燥物用1，3- 丁二醇稀釋而調(diào)制兒茶鉤藤提取液。該兒茶鉤藤提取液由通過減壓干燥法除去提取溶劑后的干燥物重量計(jì)算，包含干燥物4.10重量％。
[0081](實(shí)施例5)
[0082]作為實(shí)施例5的舌巖白菜提取物，調(diào)制舌巖白菜提取液。詳細(xì)地，將舌巖白菜(Bergenia ligulata (Wall.) Engl.)的根莖干燥粉碎后，取200g加入50體積％的乙醇水溶液3kg，一邊攪拌一邊在50°C進(jìn)行提取操作8小時(shí)，將粗提取物進(jìn)行冷卻、過濾操作后，進(jìn)行濃縮，將濃縮液通過填充有合成吸附體(商品名“夕^ Y ^才> HP — 20”三菱化學(xué)社制)的柱。之后進(jìn)行水洗，將以30體積％乙醇水溶液溶出的溶出液進(jìn)行減壓干燥，然后再溶解于1，3-丁二醇而調(diào)制舌巖白菜提取液。該舌巖白菜提取液由通過減壓干燥法除去提取溶劑后的干燥物重量計(jì)算，包含干燥物0.50重量％。
[0083](實(shí)施例6)
[0084]作為實(shí)施例6的櫻提取物，調(diào)制染井吉野櫻提取液。詳細(xì)地，將染井吉野櫻(Prunus x yedoensis)的葉干燥粉碎后,取100g加入50體積％的乙醇水溶液1L, 一邊攪拌一邊在室溫(20°C)下進(jìn)行提取操作3天，再進(jìn)行過濾處理。然后由過濾所得的液體通過減壓干燥而獲得干燥物，將該干燥物用1，3-丁二醇稀釋而調(diào)制染井吉野櫻提取液。該染井吉野櫻提取液由通過減壓干燥法除去提取溶劑后的干燥物重量計(jì)算，包含干燥物2.00重量％。
[0085]然后，使用調(diào)制的各提取物作為間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)弓丨劑，通過細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)進(jìn)行評價(jià)。圖1為顯示該評價(jià)方法的情況的示意圖。以下參照圖1對評價(jià)方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0086]〈細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)〉
[0087]將各實(shí)施例的提取液分別按0.01體積％。0.1體積％或I體積％進(jìn)行稀釋，從而調(diào)制試驗(yàn)用樣本。稀釋使用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’ s Modified EagleMedium) [DMEM “FBS (-)，P/S (-) ” ]培養(yǎng)基。這里[]內(nèi)的FBS表示10%胎牛血清，P/S是表示100單位的青霉素和lmg/mL的鏈霉素。此外，(_)的記號表示未配合。
[0088] 另一方面，作為陰性對照樣本(以下也稱為N.C.)，準(zhǔn)備DMEM“FBS㈠，P/S㈠”，作為陽性對照樣本(以下也稱為P.C.)，準(zhǔn)備20ng/mL PDGF-BB (血小板衍生生長因子PEPROTECH社制)。
[0089]此外，將小鼠骨髓間充質(zhì)系干細(xì)胞(以下也稱為mMSC)培養(yǎng)至匯合并進(jìn)行回收，用10%FBS/DMEM “P/S(_) ”以IxlO7個(gè)細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行懸浮，準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液。
[0090]接下來準(zhǔn)備趨化小室(Boyden chamber) (NeuroProbe社制)，該趨化小室具備多個(gè)獨(dú)立的孔，如圖1(a)所示，孔被膜M分割成上部孔P和下部孔Q。設(shè)定成各試驗(yàn)用樣本的任一種與陰性對照樣本和陽性對照樣本能夠在同一趨化小室中進(jìn)行試驗(yàn)?zāi)菢?，在該趨化小室的各下部孔中分別加樣各樣本為28 μ I。此外，作為趨化小室的膜，采用商品名“Polycarbonate Membranes” (NeuroProbe 社制，細(xì)孔尺寸為 8 μ m)。
[0091]接著，向趨化小室的上部孔中接種上述細(xì)胞懸浮液各50μ 1，在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)4小時(shí)(參照圖1(b))。[0092]培養(yǎng)4小時(shí)后，如圖1 (C)所示，使用附帶的過濾器擦凈器R剝?nèi)ノ匆苿?dòng)的mMSC，僅將向膜的下側(cè)移動(dòng)的mMSC通過Diff-Quik染色法(使用Sysmex社制試劑盒)進(jìn)行染色。
[0093]然后，將染色像數(shù)字化后而輸入電腦，為了將圖像二進(jìn)制化成黑白兩色，以被染成藍(lán)色部分變?yōu)榘咨姆绞竭M(jìn)行轉(zhuǎn)換，然后使用圖像編輯軟件(商品名“Photoshop”)的功能測定各孔范圍內(nèi)的平均亮度。通過將陰性對照樣本和陽性對照樣本的亮度與各試驗(yàn)用樣本的亮度進(jìn)行比較，來評價(jià)各實(shí)施例的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑的mMSC導(dǎo)引活性。
[0094]實(shí)施例1~6的評價(jià)結(jié)果分別示于圖2~圖7。
[0095]此外，作為參考實(shí)驗(yàn)，改變陽性對照樣本所使用的TOGF-BB濃度通過與上述同樣的方法進(jìn)行了細(xì)胞導(dǎo)引試驗(yàn)。其結(jié)果示于圖8。
[0096]產(chǎn)業(yè)可利用性
[0097]本發(fā)明的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑及間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法，例如，可以適合用于對各種組織的各間充質(zhì)系干細(xì)胞，評價(jià)經(jīng)過游走而聚集(被導(dǎo)引)的性能的差。
[0098]此外，本發(fā)明的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑及間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法，例如，可以適合在通過在體內(nèi)的特定組織中注射或者涂布導(dǎo)引劑等來應(yīng)用于體內(nèi)的組織，為了在該組織中使間充質(zhì)系干細(xì)胞向特定的組織分化，而將通過血流在體內(nèi)循環(huán)的間充質(zhì)系干細(xì)胞導(dǎo)引到特定組織使其聚集的方法中使用。
[0099]符號說明
[0100]P:上部孔，Q:下部孔，M:膜，R:過濾器擦凈器
【權(quán)利要求】
1.非治療目的的間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引方法，其特征在于，通過間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑來導(dǎo)引間充質(zhì)系干細(xì)胞，所述間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑含有牡丹皮提取物。
2.牡丹皮提取物用于制造間充質(zhì)系干細(xì)胞的導(dǎo)引劑的用途。
【文檔編號】C12N5/0775GK103937740SQ201410143479
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2010年6月1日
【發(fā)明者】北村圭子, 稻見雄太, 仲尾次浩一, 濱田和彥, 前田明人, 古元義, 金田安史, 玉井克人 申請人:碧雅詩株式會社, 國立大學(xué)法人大阪大學(xué)