小麥穗長(zhǎng)主效qtl緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測(cè)引物與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測(cè)引物與應(yīng)用，分子標(biāo)記檢測(cè)引物包括分子標(biāo)記XWMC112的上游引物，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，分子標(biāo)記XWMC112的下游引物，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；分子標(biāo)記XCFD53的上游引物，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，分子標(biāo)記XCFD53的下游引物，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)了與小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記XWMC112和分子標(biāo)記XCFD53，利用分子標(biāo)記XWMC112和分子標(biāo)記XCFD53可以快捷地對(duì)小麥品種或品系是否具有穗長(zhǎng)的QTL進(jìn)行判斷，快速篩選出具有增加穗長(zhǎng)QTL的小麥品種或品系，加快高產(chǎn)小麥品種的育種進(jìn)程。
【專(zhuān)利說(shuō)明】小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測(cè)引物與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了一種小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測(cè)引物與應(yīng)用，涉及小麥分子生物技術(shù)與分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，其產(chǎn)量的高低影響國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和穩(wěn)定，因此，持續(xù)不斷的提高小麥產(chǎn)量一直是小麥重要的研究方向。影響產(chǎn)量性狀的因素較多，除了產(chǎn)量三要素外，穗長(zhǎng)也是麥類(lèi)作物產(chǎn)量的重要因素之一，也是育種目標(biāo)的重要性狀之一。傳統(tǒng)的育種方法在對(duì)產(chǎn)量相關(guān)性狀的選擇上具有周期時(shí)間長(zhǎng)、耗費(fèi)大、成本高、成果小的缺點(diǎn)，而隨著分子標(biāo)記和生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇育種成為可能，利用與性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記在不同世代、不受環(huán)境和發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)，而且選擇效果較好。已有研究表明穗長(zhǎng)不僅與產(chǎn)量息息相關(guān)，具有較高的遺傳力，且屬于數(shù)量性狀。因此，穗長(zhǎng)性狀一直被作為研究的重點(diǎn)。 [0003]許多學(xué)者對(duì)穗長(zhǎng)進(jìn)行了遺傳定位，發(fā)現(xiàn)控制穗長(zhǎng)性狀的QTL在小麥染色體組中廣泛存在，且牽涉的染色體較多；其中利用單體分析分子發(fā)現(xiàn)六倍體小麥4A、5A、6A、7A、1B、3B、4B、5B、6B、7D染色體明顯影響穗長(zhǎng)；1B、2D、5A、7A、3D和6D染色體具有增長(zhǎng)穗長(zhǎng)的功效；在巨穗小麥中3么、5么、28、10、60染色體上有控制穗長(zhǎng)的基因，其中2B染色體功效較大。QTL定位研究發(fā)現(xiàn)，在普通六倍體小麥中1A、1B、4A、7A染色體上檢測(cè)到影響穗長(zhǎng)的主效基因。
[0004]但是目前關(guān)于穗長(zhǎng)可用于實(shí)際分子育種的緊密連鎖的分子標(biāo)記卻很少。因此，研究有關(guān)糖長(zhǎng)的QTL/基因，利用分子標(biāo)記技術(shù)，提聞糖長(zhǎng)，進(jìn)而提聞糖粒數(shù)，最終提聞廣量獲得高產(chǎn)小麥新品種，在實(shí)際育種工作中具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測(cè)引物與應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0007]一種小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的檢測(cè)引物，包括分子標(biāo)記XWMC112的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，分子標(biāo)記XWMC112的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；分子標(biāo)記XCFD53的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，分子標(biāo)記XCFD53的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0008]一種小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的檢測(cè)引物在檢測(cè)小麥穗長(zhǎng)短中的應(yīng)用，步驟如下:
[0009]以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，分別用分子標(biāo)記XWMC112和分子標(biāo)記XCFD53的檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，如果分別得到大小為233bp和245bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，則所述待測(cè)小麥為長(zhǎng)穗小麥。
[0010]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述待測(cè)小麥的基因組DNA采用如下方法提取:[0011]①取3~4片小麥嫩葉，置于離心管中，放入盛有液氮的容器內(nèi)，冷凍后研磨5~15min ；
[0012]②加入900 μ L65°C預(yù)熱的DNA提取工作液，65°C水浴lh，水浴過(guò)程中輕搖3~5次，充分混勻；
[0013]③室溫冷卻5min后加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(體積比25:24:1)充分混勻30min, 1000Og離心20min ;取上清液移入新離心管中，加入等體積的氯仿:異戍醇(體積比24:1)，輕輕混勻后1000Og離心20min ;
[0014]④取上清液移入新離心管中，加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，1000Og離心30min ；
[0015]⑤棄去上清液，用70% (體積百分比)的乙醇洗滌DNA沉淀2~3次；
[0016]⑥將DNA沉淀晾干，用100 μ LI X TE溶液溶解，制得待測(cè)小麥的基因組DNA;
[0017]取I μ L提取純化后的的基因組總DNAj 0.8wt%瓊脂糖(含EB終濃度0.5 μ g/ml)進(jìn)行電泳,檢測(cè)其濃度及純度。電泳儀為北京市六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8型，電泳槽為DYC-33B型。凝膠成像儀上觀察并照相，以檢測(cè)小麥基因組DNA的純度及有無(wú)降解情況。
[0018]每120mL的DNA提取工作液按如下步驟進(jìn)行配制:提取緩沖液母液(ExtractionBuffer Stock) 50mL、裂解緩沖液母液(Lysis Buffer Stock) 50mL、十二烷基肌氨酸鈉母液(Sarcosyl Stock) 20mL、焦亞硫酸鈉(Sodium disulfite) 0.6g、聚乙烯吡咯燒酮PVP-40 (K29-32) 2.4g，混合均勻制得。
[0019]提取緩沖液母液(Extraction Buffer Stock) 500mL配制步驟:31.9g山梨糖醇(Sorbitol),50mLlM Tris-HCl pH8.0、5mL0.5M EDTA pH8.0，水定容至 500mL，混勻制得。
[0020]裂解緩沖液母液(LysisBuffer Stock) 500mL 配制步驟:IOOmLlM Tris-HClpH8.0、50mL0.5M EDTA pH8.0、200mL5M NaClUOg CTAB，水定容至 500mL，混勻制得。
[0021]十二烷基肌氨酸鈉母液(Sarcosyl Stock)100mL配制步驟:5g十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)加水定容至IOOmL,混勻制得。
[0022]其他主要試劑
[0023](I)IM Tris-HCl (pH8.0):600mL H2O 中加入 121.1g 三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris)，用HCl調(diào)pH值至8.0，定容至1L，滅菌，備用；
[0024](2)0.5M 乙二胺四乙酸(EDTA) (pH8.0):600mL H2O 中加 186.1g Na2EDTA_2H20，用NaOH調(diào)pH值至8.0，定容至1L，滅菌，備用；
[0025](3) 100XTE (pH8.0):800mL H2O 中加 121.1g Tris,37.23g Na2EDTA_2H20，用 HCl調(diào)PH值至8.0，定容至1L，滅菌，備用；
[0026]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，為用每100mL聚丙烯酰胺溶液中含有7.Sg丙烯酰胺和0.2g的甲叉丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；用硝酸銀染色，顯影。
[0027]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μ 1，其中:
[0028]10Xbuffer (含 Mg2+) 2 μ L、dNTPl.6 μ L (10mmol L-1)、每條檢測(cè)引物 0.4 μ L、模板 DNA (50ngy L-1) I μ LUU Taq 聚合酶 0.2 μ L，ddH2014.4 μ I ；
[0029]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記Xwmcll2的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件分別為:
[0030]95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 50s，66°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min,8°C保存。
[0031]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記Xcfd53的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件分別為:
[0032]95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 50s，60°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min,8°C保存。
[0033]有益效果[0034]1、本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)了與小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記XWMC112和分子標(biāo)記XCFD53，利用分子標(biāo)記XWMCl 12和分子標(biāo)記XCFD53可以快捷地對(duì)小麥品種或品系是否具有穗長(zhǎng)的QTL進(jìn)行判斷，快速篩選出具有增加穗長(zhǎng)QTL的小麥品種或品系，加快高產(chǎn)小麥品種的育種進(jìn)程。
[0035]2、本發(fā)明提供的兩對(duì)檢測(cè)引物及檢測(cè)方法可應(yīng)用于小麥育種的早代選擇，能夠極大減輕育種篩選的工作量，縮短育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為小麥育種提供了技術(shù)支持，提高高產(chǎn)小麥新品種的選擇效率和質(zhì)量。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1、穗長(zhǎng)主效QTL位點(diǎn)在2D染色體上的位置；
[0037]圖2、SSR標(biāo)記Xcfd53和Xwmcl 12在花培3號(hào)和豫麥57中的擴(kuò)增結(jié)果；
[0038]其中:M、Marker； 1、花培 3 號(hào)，2、豫麥 57 ；
[0039]圖3、SSR標(biāo)記Xcfd53和Xwmcll2在6個(gè)不同小麥品種(系)中的擴(kuò)增結(jié)果；
[0040]其中:M、DL2000 ;1、山農(nóng)19中短穗品種，2、山農(nóng)20中短穗品種，3、山農(nóng)8355中短穗品種；4、長(zhǎng)穗偃麥草，5、山農(nóng)62008長(zhǎng)穗品種，6、山農(nóng)08-29長(zhǎng)穗品種；
[0041]圖4、SSR標(biāo)記Xcfd53和Xwmc112在長(zhǎng)穗偃麥草與普通小麥回交的BC3F2群體中的擴(kuò)增結(jié)果；
[0042]其中:M:DL2000 ；1, 2, 3泳道屬于中短穗株系；4,5,6泳道屬于長(zhǎng)穗株系。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
[0044]實(shí)驗(yàn)材料
[0045]山農(nóng)19和山農(nóng)20購(gòu)自山東圣豐種業(yè)科技有限公司；
[0046]山農(nóng)8355購(gòu)自淄博禾豐種子有限公司；
[0047]花培3號(hào)和豫麥57購(gòu)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；
[0048]山農(nóng)62008和山農(nóng)08-29購(gòu)自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)檢測(cè)中心品質(zhì)
育種研究室；
[0049]長(zhǎng)穗偃麥草、小麥山農(nóng)20及其回交后代群體購(gòu)自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)檢測(cè)中心品質(zhì)育種研究室；
[0050]PCR儀型號(hào)為德國(guó)Eppendorf5531梯度PCR儀。
[0051]實(shí)施例1
[0052]小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取方法，包括以下步驟:[0053]( i )以豫麥57為父本、花培3號(hào)為母本進(jìn)行雜交獲得F1, F1通過(guò)小麥和玉米雜交誘導(dǎo)單倍體，經(jīng)染色體加倍獲得的含有168個(gè)家系DH群體。
[0054](ii )參照 Triticarte Pty.Ltd (http://www.triticarte.com.au)提供的 DNA 提取方法提取各株系的DNA，采簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR標(biāo)記)、基于表達(dá)序列標(biāo)簽的簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(EST-SSR標(biāo)記)、ISSR標(biāo)記和高分子量谷蛋白(HMW-GS)亞基，對(duì)所述株系進(jìn)行基因型分析，獲得所述DH群體的基因型資料。
[0055]其中SSR標(biāo)記、EST-SSR標(biāo)記和ISSR標(biāo)記分析是將篩選株系的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)分子標(biāo)記篩選結(jié)果，篩選出親本間有多態(tài)的引物，親本間有多態(tài)的引物在所選株系中進(jìn)行分析，獲得所述DH群體的基因型資料；
[0056]所述8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，為用每100mL聚丙烯酰胺溶液中含有7.8g丙烯酰胺和0.2g的甲叉丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；用硝酸銀染色，顯影。
[0057]HMW-GS亞基提取步驟:
[0058]稱(chēng)50mg樣品置于1.5ml離心管中；加入1ml提取液A，62°C水浴提取30min，其間攪動(dòng)兩次；20°C，1000Ormp離心3min，棄上清；重復(fù)前2個(gè)步驟(共三次)；離心管中加入160 μ I提取液BI混勻，62 °C水浴溶液提取30min ;加入160 μ I提取液Β2混勻，62°C水浴燒化60min ；20°C, 1000Orpm離心10min ;取上清液150 μ I (200 μ I)放入1.5ml新離心管(稱(chēng)重I)中，加入600 μ I (或800 μ I)的丙酮，放入35-40°C的水浴鍋中水浴30min ；20°C,1000Orpm，離心10min ;棄去上清液，沉淀凍干后(稱(chēng)重2)(兩管之差即為所提高低分子量谷蛋白亞基)，加入100 μ I樣品提取液(內(nèi)含2wt%SDS，10%甘油(v/v )，5% β -巰基乙醇(v/v )，
0.8wt%Tris,0.01wt%。溴芬蘭)35~40°C水浴溶解I小時(shí)后，即可用于上樣。
[0059]上述HMW-GS提取試劑的配制
[0060]提取液A:50% (體積百分比)異丙醇
[0061]提取液B:異丙醇 25.0ml+3MTris-HCl (ρΗ8.8) 1.33ml+ 水 23.67ml,總體積 50ml,ρΗ8.8ο
[0062]提取液BI:8ml提取液B中加入0.024克DTT (二硫蘇糖醇)
[0063]提取液B2:8ml提取液B中加入112微升4_2_乙烯基吡啶(4-2-Vinylpynolin)。
[0064]HMW-GS 電泳:
[0065]參考劉現(xiàn)鵬，田紀(jì)春，張永祥在《中國(guó)糧油學(xué)報(bào)》(2002，02)中發(fā)表的名稱(chēng)為:山東省不同年代主要栽培小麥品種系高分子量谷蛋白亞基分布一文中所用方法；用10wt%的分離膠和3.75wt%的濃縮膠，膠厚度Imm ；20個(gè)上樣孔，同一種樣品上樣時(shí)所用體積應(yīng)保持濃度一致。重復(fù)3次。電流15mA。北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-22A型電泳裝置。電泳完畢后，用0.05 %考馬斯亮蘭R25tl染色24小時(shí)，然后用蒸餾水脫色2天。用ChemiImager?IS-4400凝膠成像掃描系統(tǒng)進(jìn)行凝膠分析。以中國(guó)春和馬奎斯為對(duì)照，參照Payne和Lawrence (1983)帶型命名方法讀取DH群體各株系的HMW-GS組成。
[0066]葉片中DNA提取方法:
[0067]取3~4片10日齡 小麥嫩葉，置于2mL離心管中，放入盛有液氮的容器內(nèi)，冷凍后充分研磨，加入900 μ L65°C預(yù)熱的DNA提取工作液，65°C水浴lh，水浴過(guò)程中小心輕搖數(shù)次，充分混勻；室溫冷卻5min后加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(V/V/V=25:24:1)充分混勻30min, 1000Oxg離心20min ;取上清夜加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，可見(jiàn)絮狀DNA析出，1000Oxg離心30min ;棄去上清液，用70%的乙醇洗滌沉淀2次，將DNA沉淀晾干，用IOOyLlXTE溶液溶解。
[0068](iii)利用MAPMAKER3.0作圖軟件將獲得的所述DH群體的基因型資料構(gòu)建一個(gè)含有323個(gè)標(biāo)記的小麥分子遺傳圖譜，以LOD ^ 3.0為準(zhǔn)，分布于小麥21條染色體上；其中323個(gè)標(biāo)記包括284個(gè)SSR、37個(gè)EST-SSR、I個(gè)ISSR及I個(gè)HMW標(biāo)記。
[0069](iv)將所述DH群體按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行田間種植，大田試驗(yàn)于2010-2011年將材料種植在泰安山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)試驗(yàn)站(36.57’ N，116.36’ E)和河南濟(jì)源(35.5’ N112.38’ E);盆栽試驗(yàn)于2011-2012年在泰安取相同地塊土壤種植盆栽試驗(yàn)，盆栽試驗(yàn)所用花盆直徑為28cm，深23cm，每盆裝土 28斤，每盆6株，每家系2盆。泰安試驗(yàn)點(diǎn)土壤表層O~20cm的有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀含量分別為:17.58g/kg、23.46mg/kg、45.08mg/kg和153.5mg/kg ;濟(jì)源試驗(yàn)點(diǎn)有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀含量分別為:13.7g/kg、67.97mg/kg、29.7mg/kg和 137.7mg/kg。[0070](V )試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，TO為不施氮處理；處理Tl為返青期追施純氮120kg/hm2，處理T2為拔節(jié)期追施純氮120kg/hm2，處理T3為挑旗期追施純氮120kg/hm2，Tl、T2、T3底肥均施純氮120kg/hm2。4個(gè)處理均于冬前、返青期、拔節(jié)期、挑旗期各澆I次水。2年試驗(yàn)均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，親本及DH群體的每個(gè)株系種植3行，行長(zhǎng)1.0m，株行距2.2cmX0.26m，每個(gè)環(huán)境兩次重復(fù)。試驗(yàn)材料于生長(zhǎng)期內(nèi)沒(méi)有發(fā)生倒伏和其他嚴(yán)重病蟲(chóng)害。
[0071](Vi)性狀調(diào)查:大田試驗(yàn)以株系為單位，取中間I行，于開(kāi)花期-成熟期選取10株調(diào)查小麥穗長(zhǎng)，取其平均值用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；盆栽試驗(yàn)于開(kāi)花期-成熟期將所有單株調(diào)查小麥穗長(zhǎng)，取其平均值用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
[0072](vii)利用QTLNetwork2.0 (Yang等，2005)軟件將每個(gè)標(biāo)記的群體基因型資料和相應(yīng)每個(gè)株系的穗長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，以P=0.005作為統(tǒng)計(jì)檢測(cè)閾值，即當(dāng)標(biāo)記的P值小于統(tǒng)計(jì)檢測(cè)閾值時(shí)，則認(rèn)為該標(biāo)記處存在I個(gè)與性狀有關(guān)的QTL。
[0073](viii)由QTL分析可知，在Ρ〈0.001時(shí)，多個(gè)環(huán)境下在染色體2D上的XWMCl 12-XCFD53區(qū)間內(nèi)都定為到穗長(zhǎng)的主效QTL位點(diǎn)。如圖1，表1所示。
[0074]表1不同環(huán)境下穗長(zhǎng)的QTL定位結(jié)果
[0075]
【權(quán)利要求】
1.一種小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的檢測(cè)引物，其特征在于，包括分子標(biāo)記XWMC112的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，分子標(biāo)記XWMC112的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；分子標(biāo)記XCFD53的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，分子標(biāo)記XCFD53的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
2.一種小麥穗長(zhǎng)主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的檢測(cè)引物在檢測(cè)小麥穗長(zhǎng)短中的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下: 以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，分別用權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記XWMC112和分子標(biāo)記XCFD53的檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，如果分別得到大小為233bp和245bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，則所述待測(cè)小麥為長(zhǎng)穗小麥。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述待測(cè)小麥的基因組DNA采用如下方法提取: ①取3~4片小麥嫩葉，置于離心管中，放入盛有液氮的容器內(nèi)，冷凍后研磨5~15min ； ②加入900μ L65°C預(yù)熱的DNA提取工作液，65°C水浴lh，水浴過(guò)程中輕搖3~5次，充分混勻； ③室溫冷卻5min后加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合溶液，酚:氯仿:異戊醇體積比為25:24:1,充分混勻30min, 1000Og離心20min ;取上清液移入新離心管中，加入等體積的氯仿和異戊醇的混合溶液，氯仿和:戊醇的體積比為24:1，輕輕混勻后1000Og離心20min ； ④取上清液移入新離心管中，加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，1000Og離心30min ； ⑤棄去上清液，用70%(體積百分比)的乙醇洗滌DNA沉淀2~3次； ⑥將DNA沉淀晾干，用100μ LI X TE溶液溶解，制得待測(cè)小麥的基因組DNA ； 取I μ L提取純化后的的基因組總DNA，用含EB終濃度0.5 μ g/ml的0.8wt%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，檢測(cè)其濃度及純度。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述DNA提取工作液每120mL按如下步驟進(jìn)行配制:提取緩沖液母液50mL、裂解緩沖液母液50mL、十二烷基肌氨酸鈉母液20mL、焦亞硫酸鈉0.6g、聚乙烯吡咯烷酮PVP-402.4g，混合均勻制得。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述提取緩沖液母液500mL配制步驟如下:31.9g 山梨糖醇、50mLlM Tris-HCl pH8.0、5mL0.5M EDTA pH8.0，水定容至 500mL，混勻制得。 裂解緩沖液母液500mL配制步驟如下:100mLlM Tris-HCl ρΗ8.0、50mL0.5M EDTApH8.0、200mL5M NaClUOg CTAB，水定容至 500mL，混勻制得。 十二烷基肌氨酸鈉母液IOOmL配制步驟如下:5g十二烷基肌氨酸鈉加水定容至IOOmL,混勻制得。
6.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，為用每100mL聚丙烯酰胺溶液中含有7.Sg丙烯酰胺和0.2g的甲叉丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；用硝酸銀染色，顯影。
7.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μ1，其中:含 Mg2+ 的 10×buffer2μ L、濃度 1Ommol L-1 的 dNTPl.6 μ L、每條檢測(cè)引物 0.4μL、濃度 50ng μL-1 的模板 DNAlμL、1U Taq 聚合酶 0.2 μ L, ddH2014.4 μ1。
8.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分子標(biāo)記Xwmc112的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件分別為: 95°C預(yù)變性5min ;95℃變性50s，6695℃退火lmin，72℃延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸1Omin, 8℃ 保存。
9.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分子標(biāo)記Xcfd53的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件分別為: 95°C預(yù)變性5min ;95°C變性50s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸1Omin, 8℃保存。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882143SQ201410143497
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】田紀(jì)春, 鄧志英, 崔勇, 李繼發(fā) 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)