專利名稱：棉花染色體分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及棉花染色體分離方法。
背景技術(shù)：
分子標(biāo)記育種是農(nóng)作物改良的重要技術(shù)之一。對(duì)重要的農(nóng)作物建立高密度的分子 標(biāo)記圖譜是實(shí)現(xiàn)農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記和利用定位克隆技術(shù)分離有用基因的先決條件。目前已 構(gòu)建的許多農(nóng)作物分子標(biāo)記連鎖圖譜是從整體基因組入手，通過各種分子標(biāo)記所作的基因 圖譜，其工作量大，且圖譜難以做得精細(xì)，如從單條染色體或染色體的片段入手，既可大大 提高工作效率，又有助于提高各種作物遺傳圖譜和物理圖譜的精細(xì)程度。1981年，Scaleghe 等創(chuàng)立的染色體微切割、微克隆技術(shù)為此提供了有力的手段。 染色體微切割、微克隆技術(shù)主要是通過采用微細(xì)玻璃針或激光，在倒置顯微鏡下 對(duì)目的基因所在的染色體或染色體區(qū)段進(jìn)行切割與分離，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)得到 擴(kuò)增產(chǎn)物，將產(chǎn)物插入到載體上，以構(gòu)建染色體或染色體區(qū)段特異性的DNA文庫。通過對(duì)文 庫的篩選，分離出染色體或染色體區(qū)段特異性的DNA位點(diǎn)標(biāo)記(STS) 、 DNA多態(tài)性片段和相 關(guān)基因，再用染色體步行法分離得到目的基因。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是能根據(jù)需要分離任意一條染 色體或特定染色體片段，建立相應(yīng)的DNA文庫，從中篩選出與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo) 記。 早期的微切割是對(duì)未顯帶染色體進(jìn)行切割，有些植物的一些染色體容易辨認(rèn)。例 如處于某些特殊時(shí)期的染色體、小麥帶有隨體的染色體等。Vega(1994)等用此方法成功切 割了小麥單體附加系中減數(shù)分裂中呈單價(jià)體狀態(tài)的染色體。Houben(1996)等微切割了黑 麥染色體組中帶有的B染色體。該方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)染色體沒有損傷，所建立的染色體DNA 文庫完整。其不足是只能在一些易于辨認(rèn)的染色體上進(jìn)行，使其應(yīng)用受到局限。染色體分 帶技術(shù)的應(yīng)用使細(xì)胞中染色體的辨認(rèn)易于進(jìn)行，在植物中通常采用C分帶及N分帶來辨認(rèn) 染色體，這就使得該技術(shù)的應(yīng)用對(duì)任何植物的任一染色體的任一區(qū)段的切割成為可能，大 大擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。其缺點(diǎn)是染色體分帶容易對(duì)染色體DNA造成損傷，使建立的該區(qū)段 DNA文庫的完整性及準(zhǔn)確性受到一定的影響。 顯微激光切割法的特點(diǎn)是染色體標(biāo)本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)皿上制作，借助 激光共聚焦掃描顯微鏡，利用激光所產(chǎn)生的高溫"燒掉"目標(biāo)染色體周圍的染色體，接著再 "燒掉"目標(biāo)染色體片段以外的其他染色體片段，然后用含有能消化染色體蛋白質(zhì)的蛋白酶 K的收集液，收集被切割的片段備用。該方法可自動(dòng)控制，因而具有操作簡便、容易掌握等優(yōu) 點(diǎn)。 分離到的染色體片段必須經(jīng)過體外擴(kuò)增才能滿足一系列分子生物學(xué)研究的需要。 LA-PCR是Sa皿der等發(fā)展的效率更高的微克隆方法，即將分離的染色體DNA用限制性內(nèi)切 酶(如Sau 3AI)進(jìn)行消化，根據(jù)酶切后產(chǎn)生的粘性末端的堿基序列，分別設(shè)計(jì)1個(gè)連接子
(Linker, 24mer的寡核苷酸，其5'端磷酸化)和1個(gè)銜接子(Ad即tor， 20mer的寡核苷酸， 其5'端非磷酸化)，并使二者混合后產(chǎn)生與某一內(nèi)切酶同樣的粘性末端。由于粘性末端不受限制，當(dāng)酶切后的染色體DNA與連接子銜接子混合后，可大大提高連接效率。再用其中的 連接子作PCR擴(kuò)增的引物，由于每個(gè)酶切產(chǎn)物都連接1個(gè)已知的連接子(弓l物)，這樣就可 擴(kuò)增任一未知DNA片段，在PCR反應(yīng)前無需分離程序，所構(gòu)建的染色體區(qū)帶特異性文庫不僅 減少分離等步驟，避免可能產(chǎn)生的污染，而且由于DNA丟失少而大大提高文庫的完整性。
染色體描繪是研究染色體重組、畸變機(jī)制及進(jìn)化的一個(gè)強(qiáng)有力手段，染色體微切 割、微克隆則為其提供了豐富的探針源泉?？傊?，染色體微切割、微分離技術(shù)對(duì)于構(gòu)建高密 度遺傳圖譜、篩選與目的基因緊密連鎖的分于標(biāo)記并進(jìn)一步分離該基因及生物進(jìn)化等方面 的研究起著重要作用，并顯示其廣闊的應(yīng)用前景。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，該技術(shù)也將 會(huì)得到不斷完善和發(fā)展，在生命科學(xué)的研究中必將發(fā)揮更大的作用。 然而棉花染色體小而形態(tài)相近，且棉花組織富含棉酚、單寧和萜烯類等次生代謝 物質(zhì)。截止目前，既沒有棉花染色體顯微分離方面的的報(bào)道，更沒有棉花單染色體文庫建立 方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供棉花染色體分離方法。 本發(fā)明的另一 目的在于提供一種構(gòu)建棉花染色體DNA庫的方法。 根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟 1)取材及預(yù)處理，取種子在溫水中浸泡6 12h，然后暗培養(yǎng)，待根長至1 2cm 時(shí)，截取根尖以放線菌酮處理，將預(yù)處理過的根尖置于卡諾固定液中固定； 2)前低滲，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗固定過的根尖，在4t:蒸餾水中 前低滲15 20min ; 3)酶解，切取前低滲過的根尖2 3mm于混合酶解液中37。C酶解，所述混合酶解 液含4X的纖維素酶、優(yōu)選纖維素酶0nazuka R-10和1 %的果膠酶、優(yōu)選果膠酶Pectolyase Y-23，以75mmol/L KC1和7. 5mmol/L EDTA緩沖液配制，pH4. O，過濾除菌;
4)后低滲，用吸管小心吸除酶解液后，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗根尖 2次后，4。C蒸餾水中后低滲15 20min ; 5)染色及壓片，將后低滲過的根尖移置于蓋玻片上，去除根冠保留生長區(qū)，滴加 10 iU卡寶品紅染色5min，輕輕搗碎后反轉(zhuǎn)覆于固定于支架上的膜載片上，輕壓即可，立即 放于-2(TC中保存； 6)揭蓋片，取出-201:保存的制片，稍停后直接揭蓋片，601:烘烤膜載片lh，立即 使用或者4t:保存?zhèn)溆茫?7)在Cell Cut Plus激光顯微切割儀上切割收集目標(biāo)染色體，具體方法是將制備 好的染色體標(biāo)本放到Cell Cut Plus激光顯微切割儀載物臺(tái)上，在低倍鏡下找到目標(biāo)染色 體，然后轉(zhuǎn)至40倍或100倍鏡下進(jìn)行切割； 8)切割后的染色體用黏性的E卯endorf管蓋粘附收集，然后加入含10 y L50ng/ PL蛋白酶K溶液(1XT4DNA連接酶緩沖液配制)的0. 2mL黏性Eppendorf管中，高速離心 數(shù)秒鐘，-2(TC存放備用。 根據(jù)本發(fā)明的棉花單染色體擴(kuò)增池，其通過以下方法制備 1)取材及預(yù)處理，取種子在溫水中浸泡6 12h，然后暗培養(yǎng)，待根長至1 2cm時(shí)，截取根尖以放線菌酮處理，將預(yù)處理過的根尖置于卡諾固定液中固定； 2)前低滲，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗固定過的根尖，在4t:蒸餾水中
前低滲15 20min ; 3)酶解，切取前低滲過的根尖2 3mm于混合酶解液中37°C酶解，所述混合酶解 液含4X的纖維素酶、優(yōu)選纖維素酶0nazuka R-10和1 %的果膠酶、優(yōu)選果膠酶Pectolyase Y-23，以75mmol/L KC1和7. 5mmol/L EDTA緩沖液配制，pH4. O，過濾除菌;
4)后低滲，用吸管小心吸除酶解液后，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗根尖 2次后，4。C蒸餾水中后低滲15 20min ; 5)染色及壓片，將后低滲過的根尖移置于蓋玻片上，去除根冠保留生長區(qū)，滴加 10 ii L卡寶品紅染色5min，輕輕搗碎后反轉(zhuǎn)覆于固定于支架上的膜載片上，輕壓即可，立即 放于-2(TC中保存； 6)揭蓋片，取出-201:保存的制片，稍停后直接揭蓋片，601:烘烤膜載片lh，立即 使用或者4t:保存?zhèn)溆茫?7)在Cell Cut Plus激光顯微切割儀上切割收集目標(biāo)染色體，具體方法是將制備 好的染色體標(biāo)本放到Cell Cut Plus激光顯微切割儀載物臺(tái)上，在低倍鏡下找到目標(biāo)染色 體，然后轉(zhuǎn)至40倍或100倍鏡下進(jìn)行切割； 8)切割后的染色體用黏性的E卯endorf管蓋粘附收集，然后加入含10 y L50ng/ PL蛋白酶K溶液(1XT4DNA連接酶緩沖液配制)的0. 2mL黏性Eppendorf管中，高速離心 數(shù)秒鐘，_201:存放備用； 9)采用Sau 3A連接接頭PCR (Linker-adaptor PCR， LA-PCR)的方法擴(kuò)增微分離 得到的染色體，Sau 3A接頭是由23堿基和19堿基的兩個(gè)寡核苷酸片段形成，23堿基的寡 核苷酸堿基序列為5' -6八1^0^^60^^八1"1^^(1:(:-3'，19堿基的寡核苷酸堿基序列為 5' -GGGTCGAATTCG AGCTCAG-3'，接頭的制備、染色體片段的蛋白酶K消化、接頭連接及兩輪 PCR擴(kuò)增反應(yīng)參照Albani (1993)和Chen (1995)的方法進(jìn)行并略加改動(dòng)，為了避免外源DNA 的污染，整個(gè)單染色體體外擴(kuò)增操作過程均在無菌條件下進(jìn)行，并設(shè)立嚴(yán)格的不含染色體 DNA的陰性對(duì)照和以10pg基因組DNA為模板的陽性對(duì)照，PCR擴(kuò)增進(jìn)行兩輪，從而獲得棉花 單染色體擴(kuò)增池。 根據(jù)本發(fā)明的方法采用前低滲、酶解、后低滲和壓片法結(jié)合進(jìn)行染色體膜制片的 準(zhǔn)備，細(xì)胞壁完全去除干凈，染色體經(jīng)輕壓后分散良好，形態(tài)清晰，利于目標(biāo)染色體的識(shí)別。
在Cell Cut Plus激光顯微切割儀下進(jìn)行目標(biāo)染色體的切割收集，減少了人工挑 取染色體的繁瑣程序和大的勞動(dòng)強(qiáng)度，也避免了外源DNA的污染，方便快捷地獲得目標(biāo)染 色體。 去蛋白和內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行LA-PCR擴(kuò)增，可以去除染色體上的蛋白質(zhì)以釋放DNA 雙鏈，在Sau3AI內(nèi)切酶的作用下形成粘末端，與人工合成的接頭連接進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，可以 得到有較大DNA片段的單染色體擴(kuò)增池。 為了驗(yàn)證所得單染色體探針池的來源和目標(biāo)，以Southern Blotting和FISH進(jìn)行 驗(yàn)證。 本發(fā)明的方法首次在棉花中解決了染色體膜載片的制備、染色體激光切割、單染 色體擴(kuò)增池的獲得和來源及目標(biāo)驗(yàn)證。
本發(fā)明方法所制備的單染色體擴(kuò)增池可用于棉花單染色體文庫的構(gòu)建、?；蛄?的克隆、RFLP分子標(biāo)記作圖、重要基因定位和分離等研究。


圖1是亞洲棉石系亞1號(hào)中期分裂相(A)及其核型圖(B); 圖2是亞洲棉石系亞1號(hào)的單染色體顯微分離過程(箭頭示5號(hào)染色體)； 圖3是亞洲棉石系亞1號(hào)的第5號(hào)單染色體的LA-PCR擴(kuò)增； 圖4是亞洲棉石系亞1號(hào)的第5號(hào)單染色體第2次LA-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Southern
雜交檢測(cè)； 圖5是熒光原位雜交結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明
本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例1棉花第5號(hào)染色體顯微分離技術(shù) 1材料和方法 1. 1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料是二倍體的亞洲棉品種石系亞1號(hào)，來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究 所。實(shí)驗(yàn)試劑纖維素酶0nazuka R-10和果膠酶Pectolyase Y-23購自Solarbio， Southern 試劑盒購自Boehringer Mannheim公司，地高辛探針標(biāo)記試劑盒購自Roche公司，純化回收 Kit購自上海生工公司，T-EasyVector購自Promega公司，PET膜載片和E卯endorf黏性收 集管購自基因有限公司，其他均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?
1. 2染色體標(biāo)本制備 1. 2. 1取材及預(yù)處理。取種子在溫水中浸泡6 12h，然后置于消毒過的濕沙中 3(TC暗培養(yǎng)，待根長至1 2cm時(shí)，截取根尖于2. 5X10—5g L_l的放線菌酮中，2(TC處理lh 30min。將預(yù)處理過的根尖置于卡諾固定液中固定10min后，立即移入70X乙醇中于4t:保 存待用。 1. 2. 2前低滲。用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗固定過的根尖2次后，4t:蒸 餾水中前低滲15 20min。 1. 2. 3酶解。切取前低滲過的根尖2 3mm于混合酶解液中(含4%的纖維素酶 0nazukaR-10和lX的果膠酶Pectolyase Y_23， 75mmol/L KC1和7. 5mmol/L EDTA緩沖液 配制，pH4. 0，過濾除菌)，37。C酶解45min。 1. 2. 4后低滲。用吸管小心吸除酶解液后，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗根 尖2次后，4t:蒸餾水中后低滲15 20min。 1. 2. 5染色及壓片。將后低滲過的根尖移置于蓋玻片上，去除根冠保留生長區(qū)，滴 加10 ii L卡寶品紅染色5min，輕輕搗碎后反轉(zhuǎn)覆于固定于支架上的膜載片上，輕壓即可，立 即放于-2(TC中保存。 1. 2. 6揭蓋片。取出-20°〇保存的制片，稍停后直接揭蓋片，601:烘烤膜載片lh，立
即使用或者4t:保存?zhèn)溆谩?br> 1. 3染色體的顯微分離 將制備好的染色體標(biāo)本放到Cell Cut Plus激光顯微切割儀載物臺(tái)上，在低倍 鏡下找到目標(biāo)染色體，然后轉(zhuǎn)至40倍或IOO倍鏡下進(jìn)行切割。切割后的染色體用黏性的 E卯endorf管蓋粘附收集，然后加入含10 y L 50ng y L—1蛋白酶K溶液(1XT4DNA連接酶緩 沖液配制，用于LA-PCR)的0. 2mL黏性E卯endorf管中，高速離心數(shù)秒鐘，-2(TC存放備用。
1. 4Sau 3A接頭的制備及染色體片段的體外擴(kuò)增 采用Sau 3A連接接頭PCR(Linker-adaptor PCR， LA-PCR)的方法擴(kuò)增微分離得 到的染色體，Sau 3A接頭是由23堿基和19堿基的兩個(gè)寡核苷酸片段形成。23堿基的寡 核苷酸堿基序列為5' -GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3' ， 19堿基的寡核苷酸堿基序列為 5' -GGGTCGAATTCG AGCTCAG-3'，均由上海生工公司合成。接頭的制備、染色體片段的蛋白 酶K消化、接頭連接及兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)參照Albani (1993)和Chen (1995)的方法進(jìn)行并 略加改動(dòng)。為了避免外源DNA的污染，整個(gè)單染色體體外擴(kuò)增操作過程均在無菌條件下進(jìn) 行，并設(shè)立嚴(yán)格的不含染色體DNA的陰性對(duì)照和以10pg基因組DNA為模板的陽性對(duì)照。
1. 4. ISau 3A人工接頭的制備。 制備接頭按照Albani (1993)和Chen (1995)方法進(jìn)行，用稀釋緩沖液(1XT4連接 酶緩沖液，20mmo1 L—^TP)將接頭稀釋至5ng yL—M寺用。 1. 4. 2蛋白酶K的解離。將上述含單條目標(biāo)染色體的O. 2mLE卯ondorf管置于37。C 下2h，5(TC下2h，蛋白酶K充分消化去蛋白，然后置于75°CT 20min滅活蛋白酶K。
1. 4. 3單染色體體外擴(kuò)增。在上述去蛋白處理的E卯endorf管中加入2ii LSau 3A， 37。C酶切染色體DNA 3h，70。C 20min使酶失活。加入制備好的接頭2 y L(5ng y L—0 ， T4DNA 連接酶0. 5 ii L (3U ii L—0 ，連接反應(yīng)最終體積為24. 5 ii L。 16。C連接過夜后，70°C 20min失活 連接酶。 PCR擴(kuò)增分二輪進(jìn)行。第一輪擴(kuò)增在上述同一Eppendorf管中進(jìn)行，除原先的反 應(yīng)物外，再加入lOXTaq酶緩沖液10iiL，10mmo1 L—MNTPs 2 ii L， 19mer引物liiL(250ng ii L—0 ， Taq DNA聚合酶0. 5 y L(4U y L—0 ，紫外線照射過的超純水補(bǔ)至體積100 y L，混勻， 覆蓋一滴滅菌的石蠟油。然后94t:預(yù)變性5min ;進(jìn)行94" lmin、5(TC 1. 5min、72°C 3min循 環(huán)35圈；最后72"延伸15min，4t:保溫。 第二輪PCR擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物5 ii L為模板，其它反應(yīng)成分不變；PCR反應(yīng)程 序基本同上，只是將35個(gè)循環(huán)降至25個(gè)循環(huán)。 上述過程設(shè)兩種嚴(yán)格對(duì)照陽性對(duì)照加入約10pg基因組DNA為初始底物，陰性對(duì) 照中不加任何底物，其它所有操作過程同上。
1. 5Southern雜交分析 亞洲棉石系亞1號(hào)基因組DNA的提取和純化按照宋國立等的方法。取適量的基因 組DNA(l 3ii g)用Eco RI于37。C酶切過夜，然后與棉花第5染色體的第2輪LA-PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物一起，在8g L—4京脂糖凝膠上電泳。之后，按照奧斯伯等的方法自上向下毛細(xì)管轉(zhuǎn)移 法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。紫外交聯(lián)后，用Eco RI酶切并經(jīng)Dig標(biāo)記的石系亞l號(hào)棉花基因組DNA為探 針進(jìn)行Southern雜交。具體過程參考Dig DNA Labeling andDetection Kit (Boehringer Mannheim)說明。
1. 6熒光原位雜交分析
通過隨機(jī)引物法用DIG(Digoxigenin-dUTP， Roche)標(biāo)記第2輪LA-PCR產(chǎn)物作為 探針，在石系亞1號(hào)根尖有絲分裂中期染色體標(biāo)本上進(jìn)行原位雜交。雜交過程及雜交后的 信號(hào)檢測(cè)按Zhang(2005)和王春英等(1999)的方法進(jìn)行。
2試驗(yàn)結(jié)果 2. 1采用酶解、低滲和壓片相結(jié)合的制片方法，獲得了在膜載片上分散較好的中期 染色體分裂相(圖l)。以Cell Cut Plus激光顯微切割儀分離染色體，成功地獲取了若干 條第5染色體，以單染色體形式保存于Eppendorf管中(圖2)。 2. 2亞洲棉石系亞1號(hào)的第5號(hào)單染色體DNA經(jīng)第一輪LA-PCR擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)顯 示不太明顯的連續(xù)擴(kuò)增帶型，如圖3A中所示的第2、3泳道，DNA片段長度為400 1800bp。 經(jīng)第二輪LA-PCR擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)顯示明顯的連續(xù)擴(kuò)增帶型，如圖3B中所示的第2、3泳 道，DNA片段長度為300 2500bp，另外設(shè)立了不加任何DNA的陰性對(duì)照和lOpg基因組DNA 的陽性對(duì)照，如圖3A、3B所示第1泳道為陰性對(duì)照，沒有發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，說明沒有外源DNA 的污染，如圖3A、3B所示第4泳道為陽性對(duì)照，亦能擴(kuò)增出類似的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物帶略寬一 勝。 2. 3Southern雜交結(jié)果(圖4)顯示，目標(biāo)染色體的擴(kuò)增產(chǎn)物(第2、3泳道)與lOpg 基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物(第4泳道)和基因組DNA的酶切的譜帶(第5泳道) 一樣均出現(xiàn) 明顯的雜交信號(hào)，而陰性對(duì)照(第1泳道)沒有信號(hào)，說明單染色體的擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)來自棉 花基因組。 2. 4用地高辛標(biāo)記第2次LA-PCR產(chǎn)物做探針，在石系亞1號(hào)有絲分裂中期染色體 標(biāo)本上進(jìn)行熒光原位雜交，如圖5所示，熒光信號(hào)較集中的分布于第5號(hào)染色體，初步證實(shí) 擴(kuò)增產(chǎn)物來自被分離的染色體，而不是來自基因組的其他染色體。同時(shí)，在其他部分染色體 上也有較微弱。
權(quán)利要求
棉花染色體分離方法，其特征在于，包括以下步驟1)取材及預(yù)處理，取種子在溫水中浸泡6～12h，然后暗培養(yǎng)，待根長至1～2cm時(shí)，截取根尖以放線菌酮處理，將預(yù)處理過的根尖置于卡諾固定液中固定；2)前低滲，滴加無菌雙蒸水沖洗固定過的根尖，在4℃蒸餾水中前低滲15～20min；3)酶解，切取前低滲過的根尖2～3mm于混合酶解液中酶解，所述混合酶解液含4％的纖維素酶、和1％的果膠酶；4)后低滲，吸除酶解液，滴加無菌雙蒸水沖洗根尖，4℃蒸餾水中后低滲15～20min；5)染色及壓片；6)揭蓋片；7)染色體的顯微分離，找到目標(biāo)染色體，然后進(jìn)行切割；8)收集染色體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述纖維素酶為纖維素酶 Onazuka R-IO。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述果膠酶為果膠酶Pectolyase Y-23。
4. 一種棉花單染色體擴(kuò)增池，其特征在于，所述棉花單染色體擴(kuò)增池通過以下方法制備1) 取材及預(yù)處理，取種子在溫水中浸泡6 12h，然后暗培養(yǎng)，待根長至1 2cm時(shí)，截 取根尖以放線菌酮處理，將預(yù)處理過的根尖置于卡諾固定液中固定；2) 前低滲，滴加無菌雙蒸水沖洗固定過的根尖，在fC蒸餾水中前低滲15 20min ;3) 酶解，切取前低滲過的根尖2 3mm于混合酶解液中酶解，所述混合酶解液含4%的 纖維素酶、和1%的果膠酶；4) 后低滲，吸除酶解液，滴加無菌雙蒸水沖洗根尖，4t:蒸餾水中后低滲15 20min ;5) 染色及壓片；6) 揭蓋片;7) 染色體的顯微分離，找到目標(biāo)染色體，然后進(jìn)行切割；8) 收集染色體；9) 采用Sau 3A連接接頭PCR的方法擴(kuò)增微分離得到的染色體，其中PCR擴(kuò)增進(jìn)行兩 輪，從而獲得棉花單染色體擴(kuò)增池。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，在步驟9)中，所述Sau 3A接頭包括23bp和 19bp的兩個(gè)寡核苷酸片段，所述23bp寡核苷酸序列為5'-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3'， 所述19bp寡核苷酸堿基序列為5' -GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述纖維素酶為纖維素酶 Onazuka R-IO。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述果膠酶為果膠酶Pectolyase Y-23。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及棉花染色體分離方法，所述方法包括以下步驟取材及預(yù)處理、前低滲、酶解、后低滲、染色及壓片、揭蓋片、染色體的顯微分離以及收集染色體。根據(jù)本發(fā)明的方法采用前低滲、酶解、后低滲和壓片法結(jié)合進(jìn)行染色體膜制片的準(zhǔn)備，細(xì)胞壁完全去除干凈，染色體經(jīng)輕壓后分散良好，形態(tài)清晰，利于目標(biāo)染色體的識(shí)別。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101724624SQ20091008330
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者劉方, 宋國立, 張香娣, 彭仁海, 王為, 王坤波, 王春英, 王玉紅, 黎紹惠 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所