質(zhì)譜法鑒別肉制品中動物源性成份的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測肉制品中動物源性的引物系統(tǒng)。該引物系統(tǒng)包括一對擴增引物和6條延伸引物，其中，擴增引物對序列選自SEQ?ID?No：1-2，延伸引物序列分別選自SEQ?ID?No：3-8?；谠撘锵到y(tǒng)所制備的產(chǎn)品，能鑒別肉制品中豬、牛、羊、雞、鴨、兔源性成分。使用該產(chǎn)品，可以實現(xiàn)對肉制品來源進行鑒定，在打擊食品摻假偽造、審核食品標(biāo)簽、保障消費者知情權(quán)等方面有重要作用。
【專利說明】質(zhì)譜法鑒別肉制品中動物源性成份
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于鑒定肉制品中動物源性成分的檢測方法及產(chǎn)品，具體而言是利用PCR技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，對豬、牛、羊、雞、鴨、兔源性成分進行檢測的方法及相應(yīng)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]肉制品是人類飲食中的重要食品，其含有優(yōu)質(zhì)蛋白和多種必須氨基酸，具有很高的營養(yǎng)價值。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，增加了對肉類食品的需求，市場上出現(xiàn)了很多以次充好、假冒牛肉和羊肉的現(xiàn)象，例如，常見的使用雞鴨豬肉充當(dāng)羊肉，選用豬兔肉冒充牛肉，這嚴(yán)重?fù)p害了消費者的財務(wù)和健康狀況。
[0003]另外，由于瘋牛病、豬牛口蹄疫、禽流感等疾病的發(fā)病與流行，導(dǎo)致在特定時期內(nèi)豬牛羊肉以及雞鴨肉滯銷。在該特定時期內(nèi)，如果食品監(jiān)管不力，容易發(fā)生不法商販將滯銷肉充當(dāng)其它肉制品的事件。因此，需要嚴(yán)格限制食品中的動物源性成分。
[0004]此外，我國是一個多民族組成的國家，宗教習(xí)慣使人們的飲食有一定差異，對肉制品的選擇具有一定的傾向性。例如:回族不吃豬肉。如果清真食品中摻有豬肉，會影響回族消費者的宗教信仰。同時，一些患病人群如高血壓、脂肪肝等患者對肉類的選擇具有一定特殊性。因此，食品中動物源性成分的鑒別已成為人們特別關(guān)注的問題。對肉制品中生物種屬的鑒定在打擊食品摻假偽造、審核食品標(biāo)簽、保障消費者知情權(quán)等方面有重要作用。
[0005]為了保護消費者的利益和進出口貿(mào)易的公平，對肉制品進行檢測也具有一定的社會和經(jīng)濟意義。傳統(tǒng)的肉制品檢測采用形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)方法，僅對生鮮肉具有一定的鑒別作用。但對經(jīng)過加工處理的熟肉制品，由于其感官性狀、蛋白質(zhì)成分和其它免疫源性物質(zhì)被破壞，使得傳統(tǒng)的方法很難進行`準(zhǔn)確的肉類品種鑒定，給肉制品的交易和進口帶來了極大的不便。
[0006]中國專利申請200710175520.6、“雞肉、牛肉、豬肉和馬肉多重PCR快速檢測試劑
盒及其應(yīng)用”，該方法能夠快速鑒別動物源性成分，但難以對肉制品中微量成分進行準(zhǔn)確鑒定，且需要進行電泳凝膠判斷結(jié)果，導(dǎo)致不夠經(jīng)濟實用。
[0007]中國專利申請2012101870313、“特定肉制品的LAMP法檢測試劑盒及檢測方法”公開了一種特定肉制品的LAMP法檢測試劑盒，其包括五組相互獨立的A1-A5型反應(yīng)液，該五組反應(yīng)液可分別檢測牦牛肉、雞肉、豬肉、兔肉和羊肉。然而，該方法需要對每組反應(yīng)液設(shè)置2個梯度的擴增引物體系，同時每組涉及一組外引物和內(nèi)引物以及一組環(huán)引物對，共計6種引物，且沒有各組體系之間沒有通用引物，因此導(dǎo)致整個過程設(shè)計繁瑣、且引物之間相互干擾，從而從一定程度上影響了檢測準(zhǔn)確性。另外，該申請的實施例中只能同時檢測兩種肉制品，并不能同時檢測兩種以上的肉源。
[0008]中國專利申請200810243974.7、“一種利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)鑒別肉制品中源性成分的方法”，涉及PCR法，通過設(shè)計特異性引物，進行PCR，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小及有無鑒定肉制品中動物源性成分。該方法過程需要進行大量的凝膠電泳，分析其凝膠圖譜，整個過程較為繁瑣，仍然停留在傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明原理在于:提供了一種聯(lián)合PCR技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜檢測技術(shù)，鑒定肉制品中動物源性成分的檢測方案。其中:使用一對通用引物進行PCR擴增；在單堿基延伸過程中，對PCR的純化產(chǎn)物進行多重單堿基延伸，延伸引物延伸一個核苷酸；單堿基延伸產(chǎn)生由延伸引物和延伸產(chǎn)物組成的待檢混合物，以質(zhì)譜對待檢混合物進行檢測,通過質(zhì)譜峰確定待檢混合物中各物質(zhì)分子量，并與預(yù)先計算的各延伸引物和延伸產(chǎn)物的理論分子量進行比對，從而確定待檢混合物是否包含特定的物質(zhì)。
[0010]因此，本發(fā)明第一個目的是提供一種鑒定肉制品中動物源性成分的引物系統(tǒng)或引物組，其序列如表1所示。
[0011]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測肉制品中動物源性的引物系統(tǒng)，其特征在于該引物系統(tǒng)包括一對擴增引物和6條延伸引物，其中，擴增引物對序列選自SEQ ID No:1-2，延伸引物序列分別選自SEQID No:3-8，并且所述延伸引物分別對應(yīng)于羊、牛、豬、雞、鴨、兔。
2.權(quán)利要求1的引物系統(tǒng)，其中擴增引物序列為核心序列，其在5’端可包括保護5-15個堿基序列，優(yōu)選為IObp的tag:ACGTTGGATG。
3.權(quán)利要求1的引物系統(tǒng)，其中延伸引物5’端可增加作為接頭的堿基序列，其中優(yōu)選為1-15個堿基，更優(yōu)選1-3個堿基。
4.由權(quán)利要求1至3的引物系統(tǒng)所制備的用于鑒定肉制品中動物源性成分的檢測產(chǎn)品，其中所述動物源性成分為羊、牛、豬、雞、鴨、兔。
5.權(quán)利要求4的檢測產(chǎn)品，其中產(chǎn)品為檢測試劑盒，包括: (1)用于PCR的反應(yīng)試劑，包括:上述擴增引物對，耐高溫的DNA聚合酶，dNTPs,PCR反應(yīng)緩沖液； (2)用于PCR產(chǎn)物純化的試劑； (3)用于單堿基延伸反應(yīng)的試劑，包括:延伸引物，耐高溫的單堿基延伸酶，ddNTPs，延伸反應(yīng)緩沖液。
6.權(quán)利要求5的檢測產(chǎn)品，其中試劑盒還可包括:陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，純化用樹月旨，點樣及質(zhì)譜檢測用靶片，外切酶，基因組DNA提取試劑等試劑；和/或 用于PCR產(chǎn)物純化的試劑選自堿性磷酸酶，或堿性磷酸酶和外切酶ExoI，或電泳凝膠回收試劑，或PCR產(chǎn)物純化柱。
7.使用權(quán)利要求1-3的引物系統(tǒng)，或權(quán)利要求4-6的產(chǎn)品來檢測肉制品中動物源性成分的方法，包括: (1)PCR擴增:使用通用PCR引物進行擴增，得到PCR產(chǎn)物； (2)PCR產(chǎn)物純化:對步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進行純化，以減少對后續(xù)反應(yīng)的干擾； (3)單堿基延伸:使用6條特異性的延伸引物，在一個反應(yīng)體系中，對步驟(2)得到的純化后PCR產(chǎn)物進行多重單堿基延伸，延伸引物延伸一個核苷酸； (4)延伸產(chǎn)物純化:對步驟(3)得到的延伸產(chǎn)物進行純化，以獲得高純的延伸產(chǎn)物，避免鹽離子等雜質(zhì)對后續(xù)檢測的影響； (5)質(zhì)譜儀檢測:將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物點在含有基質(zhì)的靶片上，放入質(zhì)譜儀進行檢測。
8.權(quán)利要求7的方法，其中步驟2的純化過程可以選自堿性磷酸酶消化、堿性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切膠純化、PCR純化柱過柱等。
9.權(quán)利要求1-3的引物系統(tǒng)，或權(quán)利要求4-6的產(chǎn)品，在鑒定肉制品中動物源性成分的用途。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述動物源性成分為羊、牛、豬、雞、鴨、兔。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805703SQ201410050178
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月13日
【發(fā)明者】馬慶偉, 張海燕, 鐘逾, 黎大洪, 向華, 林燕, 劉杰 申請人:向華