發(fā)酵黑曲霉抑制煙草青枯病菌的用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及利用發(fā)酵拮抗菌對(duì)煙草青枯病進(jìn)行防治，所述拮抗菌為黑曲霉(Aspergillus?niger?xj)：由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，(地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué))，保藏號(hào)：CCTCCNO：M206021。利用本發(fā)明所述的發(fā)酵黑曲霉(Aspergillus?niger?xj)可有效地防治煙草青枯病。
【專(zhuān)利說(shuō)明】發(fā)酵黑曲霉抑制煙草青枯病菌的用途【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體來(lái)說(shuō)涉及黑曲霉(Aspergillus niger xj)在抑制煙草青枯病菌方面的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草青枯病是一類(lèi)重要的煙草土傳病害，它通常浸染煙草根部，引起作物根部乃至全株的病害，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。煙草青枯病使用一種由布可氏桿菌(Ralstoniasolanacearum)引起的系統(tǒng)性浸染病，煙株一旦染病往往造成整株死亡，其危害往往是毀滅性的，因此常常給煙草生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。煙草青枯病原菌主要隨植物殘?bào)w遺落于土壤中越冬，也能在種子內(nèi)貨田間其它寄主體內(nèi)越冬，帶菌的土壤、病殘組織和含有病菌的有機(jī)肥料等是該病的主要初染源，病害的傳播主要靠灌溉水、雨水、帶病苗、農(nóng)具、病土以及人畜的活動(dòng)等。
[0003]目前生產(chǎn)上主要采用抗病品種和作物輪作等農(nóng)業(yè)措施來(lái)防治煙草土傳病害病，但是由于抗病品種需要抗病基因多樣化，并且受環(huán)境的影響比較大，防治效果不理想。作物輪作也是防治煙草青枯病的有效方法之一，但是由于我國(guó)人多地少，生產(chǎn)中正常的輪作措施無(wú)法實(shí)現(xiàn)。植物病理學(xué)家認(rèn)為植物發(fā)病與寄主、病原菌和環(huán)境這三個(gè)因素有密切關(guān)系，當(dāng)病原菌與易感寄主相遇在適宜的環(huán)境中，植物就開(kāi)始發(fā)病，如果修改貨根除這三者中的任何一個(gè)，就可以減輕或控制植物病害。
[0004]大量研究表明，煙田土壤中不僅存在引起煙草病害的微生物而且也存在多種多樣的非致病性的、提高煙草生命力的有益微生物，因而
[0005]煙草的生物防治以及生態(tài)防治日益受到重視。生物防治措施是利用有益微生物降低植物病原菌對(duì)植物的危害，生態(tài)防治這是通過(guò)想土壤中引入拮抗微生物、培肥土壤和提高土壤中生物多樣性等措施，進(jìn)而使土壤微生態(tài)達(dá)到平衡，最終通過(guò)土壤中不同生物之間的拮抗與競(jìng)爭(zhēng)實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤病害的防治。
[0006]黑曲霉是一種常見(jiàn)的真菌，屬于半知類(lèi)曲霉屬。黑曲霉可以廣泛用于加工蛋白制品，飼料加工和廢物處理。本申請(qǐng)是利用黑曲霉在生長(zhǎng)過(guò)程中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物來(lái)對(duì)煙早青枯病囷進(jìn)彳丁抑制?，F(xiàn)有技術(shù)中有通過(guò)黑曲霉防治煙早情況病的實(shí)例，如中國(guó)專(zhuān)利CN103146600A公開(kāi)了利用黑曲霉(Aspergillus niger)Ty_3防治煙草青枯病。但該申請(qǐng)?jiān)诓≡蛛x以及真菌培 養(yǎng)條件方面描述并不清楚，如煙草青枯病菌為細(xì)菌，為單菌落，不可能長(zhǎng)出菌絲，而且細(xì)菌的種子培養(yǎng)基一般為NA或NB，培養(yǎng)條件偏堿性，而真菌的種子培養(yǎng)基一般為PDA，培養(yǎng)條件偏酸性。因此，上述文獻(xiàn)中培養(yǎng)細(xì)菌的成分和條件來(lái)培養(yǎng)真菌并不合適。黑曲霉雖然是FDA公認(rèn)的制酶安全菌種，但黑曲霉活體應(yīng)用于田間的安全性是值得考慮和推敲的。黑曲霉也是一些植物病害的病原菌，如黑曲霉引起的劍麻莖腐病是一種毀滅性病害，對(duì)我國(guó)的劍麻產(chǎn)業(yè)造成極大的威脅。因此，將黑曲霉活體應(yīng)用到田間是有風(fēng)險(xiǎn)的，但它所蘊(yùn)含的代謝產(chǎn)物又是值得我們?nèi)ラ_(kāi)發(fā)應(yīng)用的?？紤]到田間的安全因素，我們采用的主要是黑曲霉產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，即將發(fā)酵后的發(fā)酵液高溫滅菌，而不是活體應(yīng)用。對(duì)比文件，雖然也是使用發(fā)酵產(chǎn)物，但沒(méi)有殺滅黑曲霉活體，這樣施加于田間，大大增加了田間風(fēng)險(xiǎn)。此外，煙農(nóng)烤制烤煙后時(shí)極易將黑曲霉帶入貯藏間，而黑曲霉污染是導(dǎo)致烤煙變質(zhì)發(fā)霉的主要因素。因此，施用活體菌液對(duì)烤煙的后期制作是極其危險(xiǎn)的！
[0007]綜上所述，考慮到田間安全及烤煙烤制后安全貯藏等諸多因素，我們采用滅過(guò)菌的黑曲霉發(fā)酵液，在抑制青枯菌的同時(shí)，降低田間與烤煙貯藏風(fēng)險(xiǎn)。
[0008]本發(fā)明人目的在于提供一種易于生產(chǎn)、劑型加工，又利于存活、的拮抗菌，將其發(fā)酵代謝產(chǎn)物滅菌后用于煙草青枯病的防治，對(duì)環(huán)境安全、友好。所述拮抗菌為黑曲霉(Aspergillus niger xj)由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，已經(jīng)于2006年3月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，(地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué))，保藏號(hào):CCTCCN0:M206021。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明目的是防治利用發(fā)酵的黑曲霉防治煙草青枯病。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種拮抗菌，所述拮抗菌為黑曲霉(Aspergillus niger xj)由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，已經(jīng)于2006年3月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，(地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué))，保藏號(hào):CCTCCN0:M206021。
[0011]本發(fā)明防治煙草青枯病拮抗菌的篩選方法，包括以下步驟:
[0012]I)病原菌的分離:
[0013]稀釋劃線(xiàn)分離:將病株基部的莖桿表面用清水洗凈風(fēng)干，再用75%的酒精擦拭，迅速過(guò)火燒盡酒精，用消過(guò)毒的解剖刀剝?nèi)ケ砻嫫?，反?fù)刮取褐色部位組織，將刮下的碎末置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，滴入兩滴無(wú)菌水，用無(wú)菌玻棒搗碎碎末，靜置5min后取菌液在NA上劃線(xiàn)，30°C培養(yǎng)48h。
[0014]溢菌分離:將病株基部的莖桿兩端`用清水洗凈晾干，再用75%的酒精擦拭，迅速過(guò)火燒盡酒精，用消過(guò)毒的解剖刀削平莖桿兩端，將下端插入盛有滅菌水的三角瓶中，罩上無(wú)菌燒杯，室溫條件下放置，待有菌膿從端部溢出后，用接種環(huán)蘸取少量菌膿在NA平板上劃線(xiàn)，30°C培養(yǎng)48h。
[0015]2)病原菌致病性鑒定
[0016]使用葉腋針刺接種法接種:用無(wú)菌的注射針頭從煙草植株頂端向下數(shù)第三張完全展開(kāi)的葉片葉腋處刺入莖內(nèi)維管束部位注入0.2mL細(xì)菌懸液，然后抽出注射針，用消毒脫脂棉花沾菌液覆蓋注射部位，再用一片消毒脫脂棉包住保濕48h，設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株，用無(wú)菌水做對(duì)照，保持30°C溫室，IOd后觀察發(fā)病情況。
[0017]3)抗菌作用測(cè)定
[0018]制備煙草青枯病病原菌懸液，并將菌懸液與LB培養(yǎng)基混和，采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)發(fā)酵液抗菌活性進(jìn)行測(cè)定。
[0019]4)抑菌條件優(yōu)化
[0020]先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定出兩種最佳碳源和氮源，即可溶性淀粉、果糖，蛋白胨及牛肉膏。其次是根據(jù)單因素篩選的結(jié)果進(jìn)行L34的正交實(shí)驗(yàn)，得出碳氮最佳組合:2wt%的淀粉、3wt%的果糖、4wt%的蛋白胨、2wt%牛肉膏。然后在此基礎(chǔ)上分別對(duì)接種量、溫度和初始PH進(jìn)行篩選，即確定出最佳接種量、溫度和起始pH為分別為10% (v/v)、25°C和6。最后得出2界1:%的淀粉、3界1:%的果糖、4wt%的蛋白胨、2界1:%牛肉膏、pH為6,10% (v/v)的接種量和25°C溫度為黑曲霉抑菌成分發(fā)酵最優(yōu)條件，對(duì)煙草青枯病菌的抑菌圈直徑為29.8_?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是發(fā)酵液對(duì)溫度的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中橫坐標(biāo)為處理溫度(V )，縱坐標(biāo)為抑菌直徑(mm)。
[0022]圖2是發(fā)酵液對(duì)紫外光的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中其中橫坐標(biāo)為光照時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為抑菌直徑(mm)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明根據(jù)下述實(shí)施例做進(jìn)一步的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明了的是，下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明僅僅起到說(shuō)明的作用。在不背離本發(fā)明精神的前提下，對(duì)本發(fā)明所做的任意改進(jìn)和替代均在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。
[0024]實(shí)施例1:病原菌的分離
[0025]將分離得到的菌株分別在NA培養(yǎng)基和TTC培養(yǎng)基上進(jìn)行人工培養(yǎng)，觀察其細(xì)菌形態(tài)，其中有若干分離株在NA培養(yǎng)基上單菌落為小圓形，稍隆起，白色稀湯狀有光澤，與青枯菌在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形態(tài)描述一致；若干分離株在TTC培養(yǎng)基上的菌落中央呈粉紅色，周?chē)咨鲃?dòng)性較強(qiáng)，與青枯菌在TTC培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形態(tài)描述一致。
[0026]實(shí)施例2:致病性鑒定
[0027]菌株從無(wú)菌水中移至NA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48小時(shí)，加無(wú)菌水懸浮，倒入裝有NA培養(yǎng)液的三角瓶里，經(jīng)30°C恒 溫?fù)u床180r/min震蕩培養(yǎng)48h，用無(wú)菌水稀釋成lxl08cfu/mL的細(xì)菌懸浮液。
[0028]使用葉腋針刺接種法接種:用無(wú)菌的注射針頭從煙草植株頂端向下數(shù)第三張完全展開(kāi)的葉片葉腋處刺入莖內(nèi)維管束部位注入0.2mL細(xì)菌懸液，然后抽出注射針，用消毒脫脂棉花沾菌液覆蓋注射部位，再用一片消毒脫脂棉包住保濕48h，設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株，用無(wú)菌水做對(duì)照，30°C溫室誘導(dǎo)發(fā)病。分離菌株用葉腋針刺接種法接種云煙87，若干分離株使煙苗莖部明顯變褐，葉片上出現(xiàn)水潰狀黃化斑，葉片萎蔫，后期整株枯死。
[0029]實(shí)施例3:抗菌作用測(cè)定:
[0030]培養(yǎng)方法:
[0031]實(shí)驗(yàn)用菌株:黑曲霉(Aspergillus niger xj):由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，(地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué))，保藏號(hào):CCTCCN0:M206021。
[0032]煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum):保存于貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物
實(shí)驗(yàn)室。
[0033]PDA斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200g切塊，用水煮沸30min，過(guò)濾取汁，加葡萄糖20g，瓊脂20g，水補(bǔ)足1000mL，pH自然。滅菌條件:121°C，30min (以下滅菌條件與此相同)。
[0034]LB 培養(yǎng)基(Luria-Bertan 培養(yǎng)基):胰蛋白胨 l%，NaC10.5%，酵母膏 1%，ρΗ7.2。滅菌。
[0035]煙草青枯病菌培養(yǎng)方法:無(wú)菌條件下，將煙草青枯病菌接種于LB培養(yǎng)基斜面的試管中，32°C培養(yǎng)18-20h。用接種環(huán)挑取菌苔表面3-5環(huán)移種到裝有4mL的LB液體培養(yǎng)基試管內(nèi)，35°C培養(yǎng)2-6h，用生理鹽水稀釋到0.5麥?zhǔn)媳葷岫?，約含lX108-2X108cfu/mL。
[0036]發(fā)酵黑曲霉培養(yǎng)方法:將xj菌株轉(zhuǎn)接于試管斜面，27°C培養(yǎng)4-5d，用無(wú)菌吐溫生理鹽水將孢子洗下，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，振蕩，充分打散孢子，用4層無(wú)菌孢子紙過(guò)濾除去菌絲，制成106孢子/mL的孢子懸液。取制好的孢子懸液，以2% (v/v)接入到PDA液體培養(yǎng)基中，28°C、150r/min條件下，進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)3d，作為種子液備用。將制備好的種子液，以10% (v/v)的接種量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝液量為50mL/250mL)，調(diào)整起始pH為6，25°C、150r/min條件下，進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)5天。
[0037]抗菌活性測(cè)定:
[0038](I)指示菌平板的制備
[0039]將制備的煙草青枯病菌密度為I X 108-2X 108cfu/mL的菌懸液吸取200 μ L菌懸液注入平皿中，并倒入IOmL冷卻至50°C左右的LB培養(yǎng)基充分混勻。
[0040](2)抗菌活性的測(cè)定
[0041]以煙草青枯病菌為指示菌，采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)發(fā)酵液抗菌活性進(jìn)行測(cè)定，活性大小以抑菌圈直徑(mm)表示。以未接種孢子懸液培養(yǎng)的無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照。將待測(cè)樣品在紫外光下照射30min，吸取20 μ L于無(wú)菌圓濾紙片(直徑6mm)上，在酒精燈前略微干燥，輕輕放在指示菌平板上，35°C培養(yǎng)36h，觀察并測(cè)定抑菌圈大小，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值為試驗(yàn)結(jié)果。以上步驟均按無(wú)菌要求操作，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)平行，2個(gè)重復(fù)，以平均值報(bào)告。
[0042]實(shí)施例4:抑菌備件優(yōu)化
[0043]4.1黑曲霉抑菌成分發(fā)酵條件優(yōu)化
`[0044]4.1.1單因素的篩選
[0045](I)碳源的篩選
[0046]以3wt%的蛋白胨為基礎(chǔ)氮源，分別加入2wt%的葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖,淀粉和甘油配制培養(yǎng)基，PH自然，接種量10% (v/v)，裝液量20% (v/v)，25°C，150r/min，培養(yǎng)5天。
[0047](2)氮源的篩選
[0048]以2wt%的葡萄糖為基礎(chǔ)碳源，分別加入3wt%的牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、氯化銨、硝酸銨和脲素配制培養(yǎng)基，PH自然，接種量10% (v/v)，裝液量20% (v/v),25°C,150r/min,培養(yǎng)5天。
[0049]4.1.2L34 正交試驗(yàn)
[0050]在單因素篩選的基礎(chǔ)上取2個(gè)碳源(淀粉和果糖)，2個(gè)氮源(牛肉膏和蛋白胨)，分別在其原基礎(chǔ)上下浮動(dòng)I個(gè)單位。即碳源的第一水平為lwt%，第二水平為2wt%，第三水平為3wt% ;氮源第一水平為2wt%,第二水平為3wt%,第三水平為4wt%。接種量10%(v/v)，裝液量 20% (v/v), 25°C, 150r/min,培養(yǎng) 5 天。
[0051]4.1.3接種量的篩選
[0052]按淀粉2wt%,果糖3wt%,蛋白胨4wt%,牛肉膏2wt%配制培養(yǎng)基,接種量分別為5% (v/v), 10% (v/v), 15% (v/v), 20% (v/v)，裝液量 20% (v/v)，放入 25°C 的溫箱中培養(yǎng)5天。
[0053]4.1.4溫度的篩選[0054]按淀粉2wt %，果糖3wt %，蛋白胨4wt %，牛肉膏2wt %配制培養(yǎng)基，接種量為10 %(v/v)，裝液量20% (v/v)，分別放入15°C、20°C、25°C、30°C、35°C的溫箱中培養(yǎng)5天。
[0055]4.1.5初始pH的研究
[0056]根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳方案來(lái)配制培養(yǎng)基，即淀粉2wt%、果糖3wt%、蛋白胨4wt %、牛肉膏2wt %、裝液量20% (v/v)，并把pH調(diào)為4、5、6、7、8、9進(jìn)行pH的篩選，接種量為 10%，25°C，150r/min，培養(yǎng) 5 天。
[0057]表1碳源對(duì)黑曲霉抑菌成分的影響
【權(quán)利要求】
1.一種黑曲霉(Aspergillus niger xj)，其特征在于保藏號(hào)為CCTCCNO:M206021，并通過(guò)下述方法制備得到:將黑曲霉菌株培養(yǎng)，用無(wú)菌吐溫生理鹽水將孢子洗下，過(guò)濾除去菌絲，制成孢子懸液；將孢子懸液接入到培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，作為種子液；將制備好的種子液，添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。
2.權(quán)利要求1所述的黑曲霉(Aspergillusniger xj),其特征在于保藏號(hào)為CCTCCNO:M206021，并通過(guò)下述方法制備得到:將黑曲霉菌株于27°C培養(yǎng)4_5d，用無(wú)菌吐溫生理鹽水將孢子洗下，振蕩，打散孢子，用4層無(wú)菌孢子紙過(guò)濾除去菌絲，制成IO6孢子/mL的孢子懸液；取制好的孢子懸液，以2% (v/v)接入到PDA液體培養(yǎng)基中，28°C、150r/min條件下，進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)3d，作為種子液；將制備好的種子液，添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝液量為50mL/250mL)發(fā)酵培養(yǎng)。
3.權(quán)利要求2所述的黑曲霉(Aspergillusniger xj),其特征在于保藏號(hào)為CCTCCNO:M206021，并通過(guò)下述方法制備得到:將制備好的所述種子液以10% (v/v)的接種量添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝液量為50mL/250mL)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有2wt %的淀粉、3wt %的果糖、4wt %的蛋白胨、2wt %牛肉膏以及水,起始pH6, 25°C、150r/min條件下,進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)5天。
4.權(quán)利要求1-3任一所述黑曲霉在防治煙草青枯病方面的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:當(dāng)在苗期施用時(shí)，將所述黑曲霉發(fā)酵液滅菌后(無(wú)菌發(fā)酵液)與基質(zhì)按1:10攪拌混勻，然后植苗，所述基質(zhì)為煙草基質(zhì)育苗標(biāo)準(zhǔn)YC/T310-2009中所用基質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:當(dāng)在大田施用時(shí)，將無(wú)菌發(fā)酵液按比例1:100與水沖兌后，采用灌根的方式進(jìn)行田間施用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，所述施用的次數(shù)為2次，每株灌根20毫升。
【文檔編號(hào)】C12R1/685GK103865805SQ201410043658
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】李祝, 叢銘, 萬(wàn)科, 葛永怡, 陳雪 申請(qǐng)人:李祝