一種來源于小眼蟲的δ4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于小眼蟲的Δ4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用。本發(fā)明公開的一種蛋白，為如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）將SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明公開的一種Δ4脂肪酸去飽和酶可以促進(jìn)哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)高水平的DHA等重要的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，同時(shí)也能將哺乳動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物中利用各種方法產(chǎn)生的DPA轉(zhuǎn)化為DHA。
【專利說明】一種來源于小眼蟲的Δ 4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種來源于小眼蟲的λ 4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酸分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸(PUFAs)。其中，PUFAs對(duì)人體具有更為獨(dú)特的作用和意義，是一類被廣泛研究和備受關(guān)注的脂肪酸。PUFAs包括ω-3和ω-ePUFAs兩種類型，每一種類型又包括多個(gè)碳鏈長(zhǎng)度不同、不飽和鍵數(shù)量不等的成員。碳鏈長(zhǎng)度≥20的PUFAs被稱為長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFAs)，最重要的LCPUFAs包括DHA (22:6n-3)、EPA (20:5n_3)和ARA (20:4n_6，即花生四烯酸)，它們是生物體內(nèi)生物活性最強(qiáng)的三種不飽和脂肪酸，已經(jīng)被證實(shí)在促進(jìn)大腦發(fā)育和功能維持以及在預(yù)防和治療心血管疾病、炎癥、癌癥等多種疾病方面有著重要作用。相對(duì)于其他一些生物，人類及其他哺乳動(dòng)物自身合成PUFAs的能力很低，原因如下:首先，哺乳動(dòng)物不能從乙酰輔酶A開始合成PUFAs，僅能夠以來源于食物的LA (18:2n-6，即亞油酸)和ALA (18:3n-3,即α-亞麻酸)為底物，利用自身的脂肪酸去飽和酶及延長(zhǎng)酶活性合成相應(yīng)的PUFAs ;其次，哺乳動(dòng)物中這些脂肪酸去飽和酶及延長(zhǎng)酶活性是很有限的，故只能最終合成有限的一小部分PUFAs ；再次，哺乳動(dòng)物中還缺失一些其他生物擁有的脂肪酸去飽和酶及延長(zhǎng)酶活性而使得一些重要的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸尤其是DHA的合成極為困難。因此，人體對(duì)更多的PUFAs需求主要依靠從食物來源獲取。但是自然界中o-6PUFAs豐富而o-3PUFAs稀缺,從而致使人體中攝入和積累的o-6PUFAs過多而co-3PUFAs過少。而哺乳動(dòng)物中不存在使co-6PUFAs轉(zhuǎn)變?yōu)閛-3PUFAs的酶活性，故人體中co-6PUFAs和ω-3PUFAs的比例嚴(yán)重失衡。co-6PUFAs雖然對(duì)人體也不可或缺，但其過量的攝入反而危害人體健康。
[0003]現(xiàn)代人的生活和飲食模式導(dǎo)致了脂肪酸的攝取嚴(yán)重不平衡。這種不平衡體現(xiàn)在以下幾個(gè)層次。第一個(gè)層次是飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸之間的不平衡，即大多數(shù)情況下人體攝入了過多的飽和脂肪酸(主要來自動(dòng)物油脂)，而不飽和脂肪酸不足；第二個(gè)層次是攝入的不飽和脂肪酸中ω-6系不飽和脂肪酸與ω-3系不飽和脂肪酸之間的不平衡，即ω-6系不飽和脂肪酸過多而ω-3系不飽和脂肪酸過少；第三個(gè)層次是攝入的不飽和脂肪酸中，短鏈不飽和脂肪酸(18C)與長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸(20C~22C)的不平衡，即短鏈不飽和脂肪酸多，長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸少。大多數(shù)常用植物油如大豆油、花生油、葵花籽油等都含有很高水平的短鏈的ω-6不飽和脂肪酸即LA (18:2η-6，即亞油酸)，亞麻籽油、紫蘇籽油等雖然含有高水平的短鏈的ω-3不飽和脂肪酸即ALA (18:3η-3，即α -亞麻酸)，但它們并非日常生活中常用油。深海魚油是長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸EPA和DHA的主要提供者，但價(jià)格昂貴，資源稀少，食用人群有限，所以它并沒有在大范圍內(nèi)改變?nèi)祟愔舅釘z入不平衡的狀態(tài)。由此可見，脂肪酸的不平衡正好體現(xiàn)在DHA (22:6η-3)、ΕΡΑ (20:5η_3)和ARA (20:4η_6)這三種最具生物活性的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的缺乏。也就是說，如果能夠獲得豐富的DHA (22:6η-3)、ΕΡΑ (20:5η_3)和ARA (20:4η_6)資源供人類攝取就能夠改變目前人類脂肪酸攝取不平衡的現(xiàn)狀。[0004]如何獲取豐富的DHA (22:6n_3)、EPA (20:5n_3)和 ARA (20:4n_6)資源是當(dāng)今世界范圍內(nèi)人們所關(guān)心的一個(gè)問題。在深海魚油面臨資源枯竭以及污染日益嚴(yán)重的現(xiàn)狀下，利用一些海洋藻類和真菌類等EPA (20:5n-3)、DHA (22:6n_3)的初始生產(chǎn)者獲取這些長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸成為很好的選擇，目前開發(fā)也獲得很大的成功。然而，這些產(chǎn)品通常作為食品添加劑使用有一定的局限性，其保存需要嚴(yán)格的措施、其口味不佳難以長(zhǎng)期使用?？梢栽O(shè)想，如果陸地動(dòng)物如豬牛羊等家畜能夠像深海魚一樣可以提供DHA (22:6n-3)、EPA (20:5n-3)和ARA (20:4n_6)等不飽和脂肪酸的話，那么其資源的豐富性將產(chǎn)生革命性的變化，而且在不影響和改變?nèi)藗兩盍?xí)慣的情況下就能獲取這些重要的脂肪酸，這對(duì)人類健康將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。但是，正如前面所提及的，哺乳動(dòng)物合成DHA (22:6n-3)、EPA (20:5n_3)和ARA (20:4n-6)是極為有限的，要提高其含量，就必須從相應(yīng)的多不飽和脂肪酸合成酶著手。相關(guān)的研究基礎(chǔ)已經(jīng)顯示，通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在哺乳動(dòng)物中來生產(chǎn)這些長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是有可能的。1997年,James P等從線蟲C.elegans中篩選克隆了第一個(gè)動(dòng)物Δ 15去飽和酶基因，命名為fat-Ι，在后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)fat-Ι基因可以將16~20碳ω -6PUFAs去飽和變成o-3PUFAs。Zhao B.Kang等將fat_l基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，ω -6/ ω -3PUFAs比從15:1下降到1:1，使哺乳動(dòng)物的o-3PUFAs含量顯著地提高。之后又于2004年將fat_l基因轉(zhuǎn)入小鼠，使得ALA、EPA、DPA等co-3PUFAs均顯著提高。2006年，Lai等制備的fat_l的轉(zhuǎn)基因豬，也表現(xiàn)出了與轉(zhuǎn)基因小鼠類似的情況。然而，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)所合成的co-3PUFAs中以18C、20C的co-3PUFAs為主，而更為重要的22C的DHA (22:6n_3)總量仍然很少。事實(shí)上，后續(xù)的一些研究表明fat-Ι的Δ 15去飽和酶活性并不能增加這些動(dòng)物體內(nèi)的DHA (22:6n-3)含量。因此，fat_l基因用于提高哺乳動(dòng)物長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量的實(shí)踐中，關(guān)鍵性的缺憾就是不能增加DHA (22:6n-3)的含量。
[0005]事實(shí)上，DHA (22: 6n_3)在哺乳動(dòng)物中的合成很復(fù)雜，要經(jīng)過一個(gè)所謂的“Sprecher通路”，EPAC 20: 5n-3)延長(zhǎng)生成一個(gè)中間產(chǎn)物DPA( 22: 5n_3)后，再進(jìn)一步延伸為24: 5n_3，然后迅速被Λ 6去飽 和酶作用生成24: 6η-3，之后進(jìn)一步經(jīng)β -氧化作用產(chǎn)生DHA( 22: 6n_3 )，這種復(fù)雜的機(jī)制可能是哺乳動(dòng)物難以合成高水平DHA (22:6n-3)的原因。有關(guān)多不飽和脂肪酸生物合成途徑如圖1所示。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種來源于小眼蟲的Λ 4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的一種蛋白，為如下(I)或(2)所示:
[0008](I) SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0009](2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
[0010]上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011]上述編碼基因中，所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N:
[0012]I) SEQ ID N0.1中自5’末端起第10位至第1635位核苷酸所示的DNA分子；
[0013]2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0014]3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。[0015]含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]一種蛋白組合物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，由SEQ ID N0.2所示的蛋白和SEQ IDN0.4所示的蛋白組成。
[0017]一種蛋白組合物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，由SEQ ID N0.2所示的蛋白、SEQ IDN0.5所示的蛋白和SEQ ID N0.6所示的蛋白組成。
[0018]一種提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DHA (22:6n-3)合成能力的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括如下步驟:將所述蛋白的編碼基因?qū)氲匠霭l(fā)細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；與出發(fā)細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的DHA (22:6n-3)合成能力提高。
[0019]上述方法中，所述編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的，所述重組表達(dá)載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PCDNA3.1(_)的多克隆位點(diǎn)得到的。
[0020]上述蛋白在制備促進(jìn)DHA (22: 6n_3 )合成的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0021]或，
[0022]上述任一所述的蛋白組合物在制備促進(jìn)DHA (22:6n_3)合成的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023]上述蛋白在制備促進(jìn)0?么(22:511-3)轉(zhuǎn)化成0撤(22:611-3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0024]或，
[0025]上述任一所述的蛋白組合物在制備促進(jìn)DPA (22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0026]或，
[0027]上述蛋白在制備促進(jìn)Λ 15脂肪酸去飽和酶將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0028]或，
[0029]上述蛋白在制備促進(jìn)Λ 15脂肪酸去飽和酶將LA(18:2n-6)和/或ARA (20: 4n_6)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n-3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0030]所述Λ 15脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示；
[0031]或，
[0032]上述蛋白在制備促進(jìn)Λ6-脂肪酸去飽和酶和Λ5-脂肪酸去飽和酶將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0033]上述蛋白在制備促進(jìn)Λ6-脂肪酸去飽和酶和Λ5-脂肪酸去飽和酶將LA(18:2n-6)和/或ALA(18:3n_3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0034]所述Λ 6-脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示；
[0035]所述Λ 5-脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
[0036]本發(fā)明提供的一種Λ4脂肪酸去飽和酶，通過配合或協(xié)同其他脂肪酸去飽和酶(Λ 15或Λ6/Λ5)的作用，可以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將添加的初始脂肪酸底物如LA(18:2n-6)或ALA(18:3n_3)轉(zhuǎn)化成為高水平的DHA (22:6n_3)等重要的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，同時(shí)也能將哺乳動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物中利用各種方法產(chǎn)生的DPA轉(zhuǎn)化為 DHA。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為多不飽和脂肪酸生物合成途徑。
[0038]圖2 為 pcDNA3.l_sEgD4 載體示意圖。
[0039]圖3為轉(zhuǎn)sEgD4基因細(xì)胞中目的基因的表達(dá)鑒定。
[0040]圖4為GC-MS檢測(cè)結(jié)果。
[0041]圖5為實(shí)施例2中轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定。
[0042]圖6為Λ 4脂肪酸去飽和酶與Λ 15脂肪酸去飽和酶的協(xié)同作用分析。
[0043]圖7為實(shí)施例3中轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定。
[0044]圖8為Λ 4脂肪酸去飽和酶與Λ 6/ Λ 5脂肪酸去飽和酶的協(xié)同作用分析。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0046]下述實(shí)施例中所用 的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047]中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。
[0048]pEGFP-Nl 購(gòu)自 Clontech 公司。
[0049]pcDNA3.1(-)購(gòu)自 Invitrogen 公司。
[0050]pcDNA3.1-EGFP的構(gòu)建方法如下:
[0051]一、以 pEGFP-Nl 為模板，用引物 fG-s:5' -TCTAGATCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3'和fG-a:5' -CTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3'進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物為EGFP基因編碼區(qū)(725bp)；
[0052]二、Xba I和Xho I雙酶切步驟一得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到基因片段；Xba I和Xho I雙酶切pcDNA3.1 (_)，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pcDNA3.1-EGFP。
[0053]pMD18-T購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。
[0054]pcDNA3.1-F2F1的構(gòu)建方法在文獻(xiàn)“汪坤福，朱貴明，張莉等。脂肪酸合成酶系多基因表達(dá)載體的構(gòu)建。中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33 (17)，4178-4180”中公開過，公眾可從佳木斯大學(xué)獲得。
[0055]實(shí)施例1、Λ 4脂肪酸去飽和酶基因(sEgD4基因)的合成及其功能驗(yàn)證
[0056]一、Λ4脂肪酸去飽和酶基因(sEgD4基因)的合成
[0057]對(duì)GenBank中提交的小眼蟲(Euglena gracilis)的Δ4脂肪酸去飽和酶基因(GenBank號(hào):AY278558)的cDNA序列(編碼框全長(zhǎng)為1626bp)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使之符合哺乳動(dòng)物基因密碼子使用偏好。優(yōu)化后使用軟件預(yù)測(cè)其mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證密碼子優(yōu)化是
否合理。
[0058]優(yōu)化后的Λ 4脂肪酸去飽和酶基因(sEgD4基因)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第10位至第1635位核苷酸所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0059]將優(yōu)化后的序列在兩端加上EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)，然后進(jìn)行全長(zhǎng)基因的人工合成，全長(zhǎng)序列如SEQ ID N0.1所示。
[0060]二、將 SEQ ID N0.1 所示的序列與 T 載體(pMD18_T)連接，得到 pMD18T_sEgD4重組質(zhì)粒；用EcoRI和HindIII雙酶切pMD18T_sEgD4，得到基因片段；EcoRI和HindIII雙酶切真核表達(dá)載體PCDNA3.1 (-)，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，將其命名為pcDNA3.l-sEgD4。將pcDNA3.l_sEgD4送測(cè)序，結(jié)果正確。pcDNA3.l-sEgD4載體的示意圖如圖2所示。
[0061]三、Λ4脂肪酸去飽和酶基因(sEgD4基因)的功能驗(yàn)證
[0062](一)CHO細(xì)胞的培養(yǎng)
[0063]培養(yǎng)基組成:DMEM高糖培養(yǎng)基，10 %胎牛血清，I %青鏈霉素(IOOX )，I %非必需氨基酸，lg/100ml丙酮酸鈉，0.22 μ M濾膜過濾除菌，%均代表體積百分含量。
[0064]中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞以5X105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，于37°C、5%C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0065](二)脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞
[0066]1、轉(zhuǎn)染前的準(zhǔn)備:用pcDNA3.l_sEgD4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，以含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP為對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(對(duì)照組)，監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染前一天將培養(yǎng)的CHO細(xì)胞傳代至60mm培養(yǎng)皿，添加lOymol/L的脂肪酸底物即DPA(22:5n-3),當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90%~95%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
`[0067]2、轉(zhuǎn)染:向1.5ml EP管中加500 μ I DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再力卩入8 μ gpcDNA3.l-sEgD4或pcDNA3.1-EGFP后輕輕混勻，標(biāo)為A液；向另一 1.5ml EP管中加500 μ I DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再加入20 μ I轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000后混合均勻，標(biāo)為B液,室溫孵育5min。將A和B加到一個(gè)管中混勻，室溫靜置20min,得混合液。然后將混合液加到CHO細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿輕輕混勻，37°C，5%C02培養(yǎng)4_6h后，吸棄孔中的液體，換新鮮培養(yǎng)基(同樣含Ιθμπιο?/L的DPA)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后次日開始可用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，48h后收集得到的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)。
[0068](三)RT-PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定
[0069]1、總RNA的提取:取轉(zhuǎn)染48h后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞用TRizol試劑提取總RNA,并測(cè)定RNA濃度，最后將提取的RNA置于_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0070]2、mRNA的反轉(zhuǎn)錄:將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為420C 30min ；95°C 5min ；5°C 5min ;4°C保存。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，將cDNA置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0071]3、PCR檢測(cè)目的基因sEgD4的表達(dá)，并以β-actin為內(nèi)參基因
[0072]①sEgD4基因的檢測(cè)引物:
[0073]D4d-s:5，-TCATCATCAACCACATCAGCGAG-3，Tm:63.2°C
[0074]D4d-a:5’ -TTTAGCTCTTCTTGTCGCCGTTG-3’ Tm:63.8°C
[0075]目的產(chǎn)物長(zhǎng)度為426bp。
[0076]②β -actin內(nèi)參基因檢測(cè)引物:
[0077]Bact-s:5，-CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3，Tm:65.7°C
[0078]Bact-a:5，-TGCCACAGGATTCCATACCCAAG-3，Tm:65.7°C
[0079]目的產(chǎn)物長(zhǎng)度為2IObp。[0080]以步驟2制備的實(shí)驗(yàn)組的cDNA為模板，分別以D4d_s和D4d-a、Bact_s和Bact-a為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I。
[0081]以步驟2制備的對(duì)照組的cDNA為模板，分別以D4d_s和D4d-a、Bact_s和Bact-a為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2。
[0082]取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I和2進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。
[0083]圖3中，I為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 ;2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I。
[0084]圖3表明，pcDNA3.l_sEgD4轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中檢測(cè)到目的基因sEgD4的轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)染含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP的CHO細(xì)胞中沒有檢測(cè)到目的基因sEgD4，證明實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)sEgD4基因細(xì)胞構(gòu)建成功。
[0085](四)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)(GC-MS)檢測(cè)脂肪酸的組成變化
[0086]1、總脂肪酸的提取:將轉(zhuǎn)染48h后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)皿中的細(xì)胞分別用
0.4ml胰蛋白酶37°C消化3min，用Iml含血清培養(yǎng)基終止胰蛋白的作用，用去離子水漂洗一次，lOOOrpm，離心5min，加入Iml體積百分含量為2.5%H2S04的甲醇溶液，輕輕混勻，80°C水浴90min，待冷卻至室溫，加入1.5ml0.9g/100ml的NaCl溶液和Iml正己烷，震蕩，2000rpm，離心5min，將脂肪酸萃取到有機(jī)相(即正己烷)中，吸取實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的有機(jī)相萃取物經(jīng)氮?dú)獯蹈蓾饪s后用于GC-MS檢測(cè)分析，或于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0087]2、GC-MS檢測(cè):檢測(cè)時(shí)使用儀器為ΗΡ_5890/ΗΡ_5971氣質(zhì)聯(lián)用分析儀，實(shí)驗(yàn)條件按照常規(guī)不飽和脂肪酸的檢測(cè)分析要求進(jìn)行，具體參考文獻(xiàn)“Kang ZB, Ge Y, Chen Z, etal.Adenoviral gene transfer of Caenorhabditis elegans n-3fatty acid desaturaseoptimizes fatty acid composition in mammalian cells.Proc Natl Acad SciUSA, 2002，98 (7): 405 0 - 4054”。
[0088]結(jié)果如圖4所示，圖4中，A為對(duì)照組GC-MS檢測(cè)結(jié)果；B為實(shí)驗(yàn)組GC-MS檢測(cè)結(jié)
果O
[0089]圖4表明，添加DPA (22: 5n_3)底物后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組DHA (22: 6n_3)的合成量顯著增加，差異極顯著，說明sEgD4基因表達(dá)厶4脂肪酸去飽和酶在合成0撤(22:611-3)的過程中發(fā)揮了其作用，將DPA(22:5n-3)直接轉(zhuǎn)化成為DHA(22:6n_3)。
[0090]實(shí)施例2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中sEgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶與Λ 15脂肪酸去飽和酶的協(xié)同作用
[0091]一、根據(jù)研究報(bào)道，來源于線蟲C.elegans的fat-Ι基因(GenBank號(hào):NM_001028389)的表達(dá)產(chǎn)物具有Λ 15脂肪酸去飽和酶活性，將fat_l基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)、人工合成的序列如SEQ ID N0.3所示。
[0092]該Λ 15脂肪酸去飽和酶的編碼基因序列如SEQ ID N0.3中自5’末端起第13位至第1221位核苷酸所示，Δ 15脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0093]按照實(shí)施例1步驟二的方法得到重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.l_sD15。
[0094]二、按照實(shí)例I中步驟三的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，分別將表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP,pcDNA3.l-sD15、pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染鋪板于 60mm 平皿的 CHO 細(xì)胞，每個(gè)轉(zhuǎn)染組所用質(zhì)粒均為8 μ g (pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4中兩種質(zhì)粒各4 μ g),并與細(xì)胞培養(yǎng)基中添加lOymol/L的底物亞油酸LA(18:2n_6)及10 μ mol/L花生四烯酸ARA(20:4n-6)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，一部分用于提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR鑒定和檢測(cè)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平，方法同實(shí)施例1中步驟三的(三)，結(jié)果如圖5所示；另一部分用于提取細(xì)胞中脂肪酸，進(jìn)行GC-MS分析脂肪酸組成，方法同實(shí)施例1中步驟三的(四)，結(jié)果如圖6所
/Jn ο
[0095]圖5中，I代表pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)；2代表pcDNA3.l_sD15轉(zhuǎn)染組；3代表 pcDNA3.l-sD15+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組。
[0096]圖5表明，目的基因sD15、sD15和sEgD4按照預(yù)期在相應(yīng)的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，不含目的基因表達(dá)質(zhì)粒的pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)則檢測(cè)不到目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0097]圖6 中，EGFP 代表 pcDNA3.1-EGFP 轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)；sD15 代表 pcDNA3.l_sD15 轉(zhuǎn)染組；sD15+sEgD4 代表 pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組。
[0098]Δ 15脂肪酸去飽和酶將添加的一部分LA(18:2n-6)轉(zhuǎn)化為ALA(18:3n_3)(這部分ALA(18:3n-3)按ω-3途徑經(jīng)兩步代謝后成為EPA (20: 5η_3))，另一部分LA (18: 2η_6)被細(xì)胞內(nèi)本身所擁有的去飽和酶和延長(zhǎng)酶活性通過兩步轉(zhuǎn)化而成為ARA(20:4n-6)。這部分ARA(20:4n-6)同添加的ARA(20:4n_6) —起被Λ 15脂肪酸去飽和酶部分轉(zhuǎn)化為ΕΡΑ(20:5η-3)。仍然有一部分ARA(20:4η_6)未被轉(zhuǎn)化成為EPA(20:5η_3)則被細(xì)胞內(nèi)本身所擁有的延長(zhǎng)酶活性轉(zhuǎn)化為ADA(22:4n-6)。Λ 15脂肪酸去飽和酶此時(shí)可將ADA (22: 4η_6)轉(zhuǎn)化為DPA(22:5n-3)，還有一部分DPA (22: 5n_3)由EPA (20: 5n_3)經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)延長(zhǎng)酶作用而產(chǎn)生。經(jīng)過Sprecher通路將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成為DHA(22:6n_3)的量并不顯著，但在sD15+sEgD4轉(zhuǎn)染組中由Λ 4脂肪酸去飽和酶則可以進(jìn)一步將積累的DPA(22:5n_3)直接轉(zhuǎn)化為DHA(22:6n-3)，其數(shù)量的增加是非常顯著的。上述多不飽和脂肪酸的代謝轉(zhuǎn)化過程可參見圖1。
[0099]圖6 表明，與對(duì)照組相比，pcDNA3.l_sD15、pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4 兩組轉(zhuǎn)染組中0-6系？現(xiàn)么8如1^(18:211-6)、六狀(20:411-6)及ADA(22:4n_6)均顯著降低，而 ω -3 系 PUFAs 中 ALA (18: 3η_3)及 EPA (20: 5η_3)均顯著增加。但是，DPA (22: 5η_3)和DHA(22:6n-3)情況完全不同:與對(duì)照組相比，pcDNA3.l_sD15轉(zhuǎn)染組中DPA(22:5n_3)顯著增加，而sD15+sEgD4轉(zhuǎn)染組中DPA(22:5n-3)含量基本與對(duì)照組持平；sD15轉(zhuǎn)染組中DHA(22:6n-3)含量基本與對(duì)照組持平，而pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4轉(zhuǎn)染組中DHA(22:6n-3)含量則顯著增加(其含量占多不飽和脂肪酸總含量的近10%)。
[0100]結(jié)果表明，sEgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶可與Λ 15脂肪酸去飽和酶協(xié)同作用，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，利用sEgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶可以促進(jìn)Λ 15脂肪酸去飽和酶活性，將添加的亞油酸及花生四烯酸轉(zhuǎn)化為較高水平的DHA(22:6n-3)，與只添加Λ 15脂肪酸去飽和酶相比，含量提高約I倍。
[0101]實(shí)施例3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中sEgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶與Λ 6/ Λ 5脂肪酸去飽和酶的協(xié)同作用
[0102]pcDNA3.1-F2F1為含有來源于小鼠的Λ 6_脂肪酸去飽和酶基因fads2 (GenBank號(hào):BC057189)和Λ 5-脂肪酸去飽和酶基因fadsl (GenBank號(hào):BC063053)的雙基因表達(dá)載體。
[0103]Λ 6-脂肪酸去飽和酶的編碼基因序列如SEQ ID N0.5所示，該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.6 所示。
[0104]Λ 5-脂肪酸去飽和酶的編碼基因序列如SEQ ID N0.7所示，該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.8 所示。
[0105]按照實(shí)例I中步驟三的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，分別將表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP,pcDNA3.1-F2F1、pcDNA3.l_F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染鋪板于 60mm 平皿的 CHO 細(xì)胞，每個(gè)轉(zhuǎn)染組所用質(zhì)粒均為8μ g (pcDNA3.l-F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4中兩種質(zhì)粒各4 μ g)，并與細(xì)胞培養(yǎng)基中添加1(^11101/1的脂肪酸底物亞油酸1^(18:211-6)和10 μ mol/L α -亞麻酸ALA(18:3n-3)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，一部分用于提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR鑒定和檢測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平，方法同實(shí)施例1中步驟三的(三)，結(jié)果如圖7所示；另一部分用于提取細(xì)胞中脂肪酸，進(jìn)行GC-MS分析脂肪酸組成，方法同實(shí)施例1中步驟三的(四)，結(jié)果如圖8所示。
[0106]圖7中，I代表pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)；2代表pcDNA3.1-F2F1轉(zhuǎn)染組；3代表 pcDNA3.l-F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組。
[0107]圖7表明，轉(zhuǎn)染的目的基因f ads2和fads 1、f ads2、fads I和sEgD4按照預(yù)期在相應(yīng)的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了超表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組；不含目的基因表達(dá)質(zhì)粒的pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)則檢測(cè)不到sEgD4基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0108]圖8 中，EGFP 代表 pcDNA3.1-EGFP 轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)；F2F1 代表 pcDNA3.1-F2F1 轉(zhuǎn)染組；F2Fl+sEgD4 代表 pcDNA3.l_F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組。
[0109]圖8中各物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程如實(shí)施例2中所述。
[0110]圖8表明，與對(duì)照組相比，pcDNA3.1-F2F1轉(zhuǎn)染組中，Λ 6/Λ 5脂肪酸去飽和酶活性的增加能夠促使添加的脂 肪酸底物L(fēng)A (18: 2η-6)顯著地轉(zhuǎn)變?yōu)锳RA (20: 4η_6)，Λ 6/ Λ 5脂肪酸去飽和酶活性的增加使添加的脂肪酸底物ALA(18:3n-3)轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗟腅PA(20:5n_3)和DPA(22:5n-3)，但Λ 6/Λ 5脂肪酸去飽和酶活性并沒有顯著地提高DHA (22: 6n_3)的含量。與 pcDNA3.1-F2F1 轉(zhuǎn)染組相比，在 pcDNA3.l_F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組中，EgD4 基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶協(xié)同Λ 6/Λ 5脂肪酸去飽和酶的活性，將DPA (22:5η-3)直接轉(zhuǎn)化成為更高水平的DHA(22:6n-3)，DHA(22:6n-3)的含量較pcDNA3.1-F2F1轉(zhuǎn)染組提高了約1.5倍，占多不飽和脂肪酸總含量近30%。
[0111]結(jié)果表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，EgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶可以協(xié)同Λ6/Λ5脂肪酸去飽和酶的作用將ω-3系的α -亞麻酸ALA(18:3η_3)轉(zhuǎn)化為高水平DHA(22:6n-3)。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，為如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.2所示的蛋白； (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N: O SEQ ID N0.1中自5’末端起第10位至第1635位核苷酸所示的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.一種蛋白組合物，由SEQ ID N0.2所示的蛋白和SEQ ID N0.4所示的蛋白組成。
6.一種蛋白組合物，由SEQ ID N0.2所示的蛋白、SEQ ID N0.5所示的蛋白和SEQ IDN0.6所示的蛋白組成。
7.一種提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DHA (22:6n-3)合成能力的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求I所述蛋白的編碼基因?qū)氲匠霭l(fā)細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；與出發(fā)細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的DHA (22:6n-3)合成能力提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的，所述重組表達(dá)載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PCDNA3.1(_)的多克隆位點(diǎn)得到的。
9.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進(jìn)DHA(22:6n-3)合成的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求5或6所述的蛋白組合物在制備促進(jìn)DHA (22:6n_3)合成的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進(jìn)DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求5或6所述的蛋白組合物在制備促進(jìn)DPA (22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進(jìn)Λ 15脂肪酸去飽和酶將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n-3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進(jìn)Λ 15脂肪酸去飽和酶將LA(18:2n-6)和/或ARA(20:4n-6)轉(zhuǎn)化成DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述Λ 15脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示； 或， 權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進(jìn)Λ6-脂肪酸去飽和酶和Λ5-脂肪酸去飽和酶將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或，權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進(jìn)Λ6-脂肪酸去飽和酶和Λ5-脂肪酸去飽和酶將LA(18:2n-6)和 / 或 ALA (18: 3n_3)轉(zhuǎn)化成 DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述Λ 6-脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示； 所述Λ 5-脂肪酸去飽和酶的氨·基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK103820402SQ201410043571
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月29日
【發(fā)明者】朱貴明, 王淑秋, 孫潔, 王迪迪, 葛堂棟, 江旭東, 樸金花 申請(qǐng)人:佳木斯大學(xué)