一種降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法。微孔淀粉具有較大的比表面積，一定條件下分散在水及其它溶劑中，仍能保持結(jié)構(gòu)的完整性，但使用安全性較低。本發(fā)明配制玉米淀粉漿溶液后，用稀酸進(jìn)行出孔預(yù)處理，中和洗滌，加入α-淀粉酶和糖化酶恒溫反應(yīng)，再中和離心，真空冷凍凍干得微孔淀粉，與膠原蛋白混合并加入交聯(lián)劑，恒溫反應(yīng)，洗滌凍干得目的產(chǎn)品。本發(fā)明作為可生物降解組織工程用止血材料，具有適宜的微觀結(jié)構(gòu)和孔隙率，具有優(yōu)良的止血性能和可控的降解速率；當(dāng)出血時(shí)，適于血細(xì)胞附著在材料表面形成一種凝膠狀混合物，從而達(dá)到止血的效果。
【專利說(shuō)明】一種降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微孔淀粉又稱為多孔淀粉，是原淀粉顆粒經(jīng)人工方法處理，即用鹽酸、淀粉酶適當(dāng)水解后得到的多孔狀淀粉，是一種全新的變性淀粉。它具有較大的比表面積，一定條件下分散在水及其它溶劑中，仍能保持結(jié)構(gòu)的完整性，因此具有良好的吸水、吸油性能，可作為香精、香料、風(fēng)味物質(zhì)、色素、藥劑及保健食品中功能成分的吸附載體，并且成本較低，可自然降解。它的優(yōu)勢(shì)在于:⑴對(duì)物體吸附是一種物理方式；⑵具有較大的比孔容、比表面積和良好的吸附性(吸水能力)；⑶堆積密度和顆粒密度小，結(jié)構(gòu)疏松K4)具有分子篩的作用。
[0003]類人膠原蛋白是將人體已知序列膠原蛋白的一段mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，經(jīng)過(guò)特定序列重復(fù)和修飾，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，并經(jīng)過(guò)高密度發(fā)酵、分離提取及純化而得。該蛋白從根本上解決了動(dòng)物提取膠原蛋白的水不溶性和病毒隱患(瘋牛病、豬瘟疫、禽流感)等問(wèn)題，具有良好的促新細(xì)胞形成和促上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)功能，相比動(dòng)物膠原蛋白更具有良好的生物相容性，免疫排異反應(yīng)低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種使用安全性大幅度提高的降解速率可控的微孔淀粉及其制備方法。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種降解速率可控的微孔淀粉的制·備方法，其特征在于:
由以下步驟實(shí)現(xiàn):
步驟一:配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38~40%的玉米淀粉溶液；
步驟二:用稀酸對(duì)玉米淀粉漿溶液進(jìn)行出孔預(yù)處理，置于50°C恒溫水浴鍋中；反應(yīng)4h后加入緩沖液中和，離心洗滌，離心條件為3000r/min，4°C，lOmin，反復(fù)操作3次，移去上清；
步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國(guó)際單位α-淀粉酶的比例稱取α-淀粉酶，再按國(guó)際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:(1~5)的比例稱取糖化酶，將α-淀粉酶和糖化酶混合，加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中，加入緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0，在恒溫?cái)嚢杵魃戏磻?yīng)，反應(yīng)時(shí)間為18~22h，反應(yīng)溫度為45~55°C ；
步驟四:加堿中和，離心3~5次，轉(zhuǎn)速為3000r/min，反應(yīng)溫度為4°C，每次離心lOmin,棄上清,真空冷凍干燥機(jī)凍干，得微孔淀粉；
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照(10~20):1的質(zhì)量比，在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)24~72h后取出洗滌，凍干，得降解速率可控的微孔淀粉。[0006]步驟一中，所用玉米淀粉的分子量為7000~lOOOODa ；
步驟一中，配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0007]步驟二中，稀酸選取摩爾濃度為1.5~3.0mol/L的稀鹽酸；
步驟二中，緩沖液選取摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液。
[0008]步驟三中，α -淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g ；
步驟三中，緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成。
[0009]步驟四中，堿指摩爾濃度為1.5~2.0mol/L的NaOH溶液。
[0010]步驟五中，交聯(lián)劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05~0.2%的戍二醒溶液；
步驟五中，交聯(lián)反應(yīng)體系的溶劑為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇；
步驟五中，膠原蛋白選取基因工程技術(shù)高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0011]所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法制備的降解速率可控的微孔淀粉。
[0012]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明提供的一種降解速率可控的微孔淀粉，作為可生物降解組織工程用止血材料，具有適宜的微觀結(jié)構(gòu)和孔隙率，具有優(yōu)良的止血性能和可控的降解速率。當(dāng)出血時(shí)，適于血細(xì)胞附著在材料表面形成一種凝膠狀混合物，從而達(dá)到止血的效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該止血材料又具有其自身顯著的優(yōu)點(diǎn):免疫排異反應(yīng)更低，而且徹底杜絕了膠原蛋白止血材料不可避免的病毒隱患，使用安全性大幅度提高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為微孔淀粉掃描電鏡(SEM)。左側(cè)為微孔淀粉酶解后表面成孔情況，右側(cè)為與少量類人膠原蛋白交聯(lián)的微孔淀粉。
[0014]圖2為在兔子肝臟做出創(chuàng)面的照片。
[0015]圖3為微孔淀粉的止血效果對(duì)比照片。左側(cè)為外購(gòu)的阿里斯泰止血粉，右側(cè)為類人膠原蛋白-微孔淀粉組。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
[0017]本發(fā)明說(shuō)涉及的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法，由以下步驟實(shí)現(xiàn):步驟一:配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38~40%的玉米淀粉溶液；所用玉米淀粉的分子量為7000~
lOOOODa,配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0018]步驟二:用摩爾濃度為1.5~3.0mol/L的稀鹽酸對(duì)玉米淀粉漿溶液進(jìn)行出孔預(yù)處理，置于50°C恒溫水浴鍋中；反應(yīng)4h后加入摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04緩沖液中和，離心洗滌，離心條件為3000r/min，4°C，lOmin，反復(fù)操作3次，移去上清。
[0019]步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國(guó)際單位α-淀粉酶的比例稱取α-淀粉酶，再按國(guó)際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:(1~5)的比例稱取糖化酶，α-淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g,將α -淀粉酶和糖化酶混合，加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中，加入緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0，緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成；在恒溫?cái)嚢杵魃戏磻?yīng)，反應(yīng)時(shí)間為18~22h，反應(yīng)溫度為45~55°C。
[0020]步驟四:加摩爾濃度為1.5~2.0mol/L的NaOH溶液中和，離心3~5次，轉(zhuǎn)速為3000r/min，反應(yīng)溫度為4°C，每次離心lOmin，棄上清，將沉淀轉(zhuǎn)移至一次性培養(yǎng)皿中，于-80°C超低溫保藏箱預(yù)凍6h，后移入冷阱預(yù)冷完成的真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥48h，得微孔淀粉；
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照(10~20):1的質(zhì)量比，在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05~0.2%的戊二醛溶液，交聯(lián)反應(yīng)體系的溶劑為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，密封后放入生化培養(yǎng)箱或電熱鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行交聯(lián)，溫度為37°C，持續(xù)交聯(lián)24h。交聯(lián)結(jié)束后，使用無(wú)菌注射用水進(jìn)行離心洗滌，共洗滌6次，移去上清液。洗滌結(jié)束后于真空冷凍干燥機(jī)中凍干48h。凍干結(jié)束后，加以內(nèi)包裝密封，然后以> 25KGY的照射劑量進(jìn)行Co,輻照滅菌，得降解速率可控的微孔淀粉。膠原蛋白選取基因工程技術(shù)高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0021]淀粉經(jīng)酸解酶解反應(yīng)處理后，顆粒表面成孔明顯，孔隙分布密集均勻，淀粉顆粒大小均勻，與對(duì)照品阿里斯泰止血粉相比，吸水性能好，生物相容性更優(yōu)。
[0022]實(shí)施例1:
步驟一:配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38%的玉米淀粉溶液；所用玉米淀粉的分子量為7000Da，配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0023]步驟二:用摩爾濃度為1.5mol/L的稀鹽酸對(duì)玉米淀粉漿溶液進(jìn)行出孔預(yù)處理，置于50°C恒溫水浴鍋中；反應(yīng)4h后加入摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04緩沖液中和，離心洗漆，離心條件為3000r/min, 4°C，lOmin,移去上清。
`[0024]步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國(guó)際單位α-淀粉酶的比例稱取淀粉酶，再按國(guó)際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:1的比例稱取糖化酶，α-淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g,將α -淀粉酶和糖化酶混合，加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中，加入緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0，緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成；在恒溫?cái)嚢杵魃戏磻?yīng)，反應(yīng)時(shí)間為18h，反應(yīng)溫度為45°C。
[0025]步驟四:加摩爾濃度為1.5mol/L的NaOH溶液中和，離心3次，轉(zhuǎn)速為3000r/min，反應(yīng)溫度為4°C，每次離心lOmin，棄上清，真空冷凍干燥機(jī)凍干，得微孔淀粉；
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照10:1的質(zhì)量比，在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的戊二醒溶液,交聯(lián)反應(yīng)體系的溶劑為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)24h后取出洗滌，凍干，得降解速率可控的微孔淀粉。膠原蛋白選取基因工程技術(shù)高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0026]實(shí)施例2:
步驟一:配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39%的玉米淀粉溶液；所用玉米淀粉的分子量為8000Da，配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0027]步驟二:用摩爾濃度為2.0mol/L的稀鹽酸對(duì)玉米淀粉漿溶液進(jìn)行出孔預(yù)處理，置于50°C恒溫水浴鍋中；反應(yīng)4h后加入摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04緩沖液中和，離心洗漆，離心條件為3000r/min, 4°C，lOmin,移去上清。[0028]步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國(guó)際單位α-淀粉酶的比例稱取淀粉酶，再按國(guó)際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:3的比例稱取糖化酶，α-淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g,將α -淀粉酶和糖化酶混合，加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中，加入緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0，緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成；在恒溫?cái)嚢杵魃戏磻?yīng)，反應(yīng)時(shí)間為20h，反應(yīng)溫度為50°C。
[0029]步驟四:加摩爾濃度為1.7mol/L的NaOH溶液中和，離心4次，轉(zhuǎn)速為3000r/min，反應(yīng)溫度為4°C，每次離心lOmin，棄上清，真空冷凍干燥機(jī)凍干，得微孔淀粉；
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照15:1的質(zhì)量比，在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的戊二醒溶液,交聯(lián)反應(yīng)體系的溶劑為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)48h后取出洗滌，凍干，得降解速率可控的微孔淀粉。膠原蛋白選取基因工程技術(shù)高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0030]實(shí)施例3:
步驟一:配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的玉米淀粉溶液；所用玉米淀粉的分子量為lOOOODa，配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
[0031]步驟二:用摩爾濃度為3.0mol/L的稀鹽酸對(duì)玉米淀粉漿溶液進(jìn)行出孔預(yù)處理，置于50°C恒溫水浴鍋中；反應(yīng)4h后加入摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04緩沖液中和，離心洗漆，離心條件為3000r/min, 4°C，lOmin,移去上清。
[0032]步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國(guó)際單位α-淀粉酶的比例稱取淀粉酶，再按國(guó)際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:5的比例稱取糖化酶，α-淀粉酶活度為
5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為·1.0 X 105IU/g,將α -淀粉酶和糖化酶混合，加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中，加入緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0，緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成；在恒溫?cái)嚢杵魃戏磻?yīng)，反應(yīng)時(shí)間為22h，反應(yīng)溫度為55°C。
[0033]步驟四:加摩爾濃度為2.0mol/L的NaOH溶液中和，離心5次，轉(zhuǎn)速為3000r/min，反應(yīng)溫度為4°C，每次離心lOmin，棄上清，真空冷凍干燥機(jī)凍干，得微孔淀粉；
步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照20:1的質(zhì)量比，在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的戊二醒溶液,交聯(lián)反應(yīng)體系的溶劑為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)72h后取出洗滌，凍干，得降解速率可控的微孔淀粉。膠原蛋白選取基因工程技術(shù)高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
[0034]類人膠原蛋白-微孔淀粉止血材料性能測(cè)試:
1、孔隙率的測(cè)定
干燥的類人膠原蛋白一微孔淀粉止血材料成品若干塊:矩形，正圓形和不規(guī)則形狀各3個(gè)樣，本實(shí)驗(yàn)室自制。選一個(gè)容積為50mL的燒杯，倒?jié)M乙醇稱重Mi，把重為Ms的材料浸入乙醇中，超聲脫氣，務(wù)必使乙醇充盈于材料，然后稱重為M2，把浸滿了乙醇的樣品取出后，稱剩余的乙醇的重量為M3，計(jì)算孔隙率Θ，每組測(cè)三個(gè)樣，最后求平均值。
[0035]Θ = (JM2—M3—Ms) / (i/j—#3)
表1類人膠原蛋白-微孔淀粉止血材料孔隙率的測(cè)定
【權(quán)利要求】
1.一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法，其特征在于:由以下步驟實(shí)現(xiàn):步驟一:配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38~40%的玉米淀粉溶液；步驟二:用稀酸對(duì)玉米淀粉漿溶液進(jìn)行出孔預(yù)處理，置于50°C恒溫水浴鍋中；反應(yīng)4h后加入緩沖液中和，離心洗滌，離心條件為3000r/min，4°C，lOmin，反復(fù)操作3次，移去上清；步驟三:以每克干基玉米淀粉加入60國(guó)際單位α-淀粉酶的比例稱取α-淀粉酶，再按國(guó)際單位比α-淀粉酶:糖化酶=1:(1~5)的比例稱取糖化酶，將α-淀粉酶和糖化酶混合，加入步驟二得到的玉米淀粉漿溶液中，加入緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0，在恒溫?cái)嚢杵魃戏磻?yīng)，反應(yīng)時(shí)間為 18~22h，反應(yīng)溫度為45~55°C ；步驟四:加堿中和，離心3~5次，轉(zhuǎn)速為3000r/min，反應(yīng)溫度為4°C，每次離心lOmin,棄上清,真空冷凍干燥機(jī)凍干，得微孔淀粉；步驟五:將膠原蛋白與微孔淀粉按照(10~20):1的質(zhì)量比，在50mL離心管中混合并加入交聯(lián)劑，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)24~72h后取出洗滌，凍干，得降解速率可控的微孔淀粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法，其特征在于:步驟一中，所用玉米淀粉的分子量為7000~lOOOODa ；步驟一中，配制玉米淀粉溶液使用蒸餾水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法，其特征在于:步驟二中，稀酸選取摩爾濃度為1.5~3.0mol/L的稀鹽酸；步驟二中，緩沖液選取摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法，其特征在于:步驟三中，α -淀粉酶活度為5.0 X 104IU/g,糖化酶活度為1.0 X 105IU/g ；步驟三中，緩沖液由摩爾濃度為0.2mol/L的Na2HP04溶液和摩爾濃度為0.lmol/L的檸檬酸溶液按體積比2:1的比例混合而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法，其特征在于:步驟四中，堿指摩爾濃度為1.5~2.0mol/L的NaOH溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法，其特征在于:步驟五中，交聯(lián)劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05~0.2%的戊二醛溶液；步驟五中，交聯(lián)反應(yīng)體系的溶劑為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇；步驟五中，膠原蛋白選取基因工程技術(shù)高密度發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種降解速率可控的微孔淀粉的制備方法制備的降解速率可控的微孔淀粉。
【文檔編號(hào)】C12P19/14GK103710409SQ201310698617
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】范代娣, 馬曉軒, 段志廣, 楊嬋媛, 蒙俊樺, 王琪凱 申請(qǐng)人:西北大學(xué)