一種高毒性、高增值能力的人d-cik細胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細胞免疫學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，包括如下步驟：1)采集外周靜脈血，獲得單個核細胞；2)進一步分離獲得單核細胞和懸浮細胞；3)單核細胞誘導分化為成熟的DC；4)CD3+CD8+CIK細胞的誘導培養(yǎng)；5)D-CIK細胞的誘導培養(yǎng)，得到一種新的異質(zhì)性細胞群，即D-CIK細胞。通過本發(fā)明所制備的D-CIK細胞與CIK細胞比較，增值活性和細胞毒活性更強，同時具有制備工藝簡單、成本低廉、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢。通過本發(fā)明所制備的D-CIK細胞，其應(yīng)用主要為癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預防。
【專利說明】—種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞免疫學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokineinduced killer cell, CIK)是 Schmidt 等于1986年報道的從外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中誘導出的一群異質(zhì)性細胞。其主要效應(yīng)細胞因同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，因此又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞(NKT細胞)。體內(nèi)外的實驗研究表明，CIK細胞具有殺瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及殺瘤效應(yīng)不受癌細胞多重耐藥的影響等優(yōu)勢。
[0003]樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是目前所知功能最強的抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell, APC),表面具有豐富的有助于抗原呈遞的分子,如主要組織相容性復合體 1、II (major histocompatibility complex I/I I, MHC I/II)、CD80/86、CD40、ICAM-1等共刺激分子，能有效的激活初始型T細胞(naiVe T cell)使其活化和增值，啟動特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)揮有效的抗腫瘤效應(yīng)。
[0004]樹突狀細胞調(diào)節(jié)的細胞因子誘導的殺傷細胞(dendritic cell activated andcytokine induced killer cell, D-CIK)是指將成熟的DC與同源的CIK細胞同培養(yǎng)而形成的一群異質(zhì)性細胞群。共培養(yǎng)既可以促進DC分泌IL-12，又可以促進CIK細胞的增值，并加強其抗腫瘤活性。Marten A等研究發(fā)現(xiàn)，IL-12攝取阻斷會減弱CIK細胞的細胞毒活性。因此,D-CIK細胞應(yīng)用于惡性腫瘤患者的治療，有助于解除腫瘤患者體內(nèi)T細胞的免疫無能，從而提高抗腫瘤活性。
[0005]現(xiàn)有CIK細胞制備技術(shù)中存在:(1)CIK細胞中絕大部分群體為⑶3+⑶8+T淋巴細胞，大約占CIK細胞的60%左右，然而其殺瘤活性卻受到極大的限制；這與目前的CD3+0)8+T淋巴細胞,也即細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)是抗腫瘤的主要免疫效應(yīng)細胞的認識存在差異。(2)雖然主要效應(yīng)細胞一NKT細胞，擴增1000倍左右，但整體細胞群體擴增能力較為有限，大約80~100倍左右。DC制備技術(shù)中存在，成熟DC分泌IL-12因子的水平偏低。二者共培養(yǎng)后，增值能力和細胞毒活性提高不顯著等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過選擇優(yōu)化的CIK細胞和DC培養(yǎng)方案的基礎(chǔ)上，對CIK細胞和DC共培養(yǎng)方案進一步改進，提供了一種新的人D-CIK細胞的制備方法及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)CIK細胞與DC共培養(yǎng)后，異質(zhì)性細胞群體增值能力和細胞毒活性提高不顯著等問題。
[0007]本發(fā)明所提供的人D-CIK細胞，是指以CD3+CD8+T淋巴細胞為主效應(yīng)細胞，在人D-CIK細胞異質(zhì)性群體中約95%，與K562細胞共培養(yǎng)8小時對腫瘤細胞殺傷活性可達93%左右。CD3+CD8+T淋巴細胞其表面標記為:人白細胞分化抗原CD3、人白細胞分化抗原CD8和人a PTCR受體。
[0008]本文中的“⑶3+⑶8+CIK細胞”表示CD3和⑶8均為陽性的CIK細胞。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，設(shè)計一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，包括如下步驟:
[0010]I)采集外周靜脈血，獲得單個核細胞；
[0011]2)進一步分離獲得單核細胞和懸浮細胞；
[0012]3)單核細胞誘導分化為成熟的DC;
[0013]4)CD3+CD8+CIK細胞的誘導培養(yǎng)；[0014]5) D-CIK細胞的誘導培養(yǎng)。
[0015]作為優(yōu)選，所述步驟I)為將外周靜脈血經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細胞；所述步驟2)為通過貼壁法將上述單個核細胞進一步分離獲得單核細胞和懸浮細胞。
[0016]進一步地，所述步驟I)具體為采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離收集，并用生理鹽水洗滌2次，低速離心后獲得PBMCs。
[0017]所述步驟2)具體為將獲取的PBMCs重懸于PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、OPt1-MEM?培養(yǎng)基中的任意一種，然后于37°C，5% C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜止2h，吸取其中懸浮細胞另行CD3+CD8+CIK細胞誘導培養(yǎng)，貼壁細胞則為單核細胞。
[0018]作為優(yōu)選，所述步驟3)具體包括:將含有8-10%白體血漿、800_1000IU/mlGM-CSF、800-1000IU/ml IL-4的X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AM-V?培養(yǎng)基加入獲取的單核細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)2-3天后，更換新鮮培養(yǎng)基，并在新鮮培養(yǎng)基中加入I~20 μ g/ml的腫瘤抗原，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)1-2天后，加入IL-Ιβ、IL-6、TNF-a，或者IL-1 β、IL_6、TNF_ a與Mtb-HAg及IFN- Y中的一種或者兩種的組合；繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，進行DC成熟度和IL-12含量檢測。
[0019]作為優(yōu)選，所述步驟3)中加入的IL-Ιβ終濃度為8-15ng/mL，IL_6終濃度為50-150ng/mL, TNF- a 終濃度為 8_15ng/mL，Mtb-Hag 終濃度為 5 ~10 μ g/ml, IFN- Y 終濃度為 100 ~1000IU/ml ;GM_CSF 濃度為 800IU/ml、IL-4 濃度為 1000IU/ml ;所述的 DC 成熟度的檢測方法為流式細胞術(shù)，IL-12含量檢測方法為ELISA。
[0020]進一步地，所述步驟3)中加入的IL-1 β終濃度為10ng/mL，IL-6終濃度為IOOng/mL, TNF- α 終濃度為 10ng/mL，Mtb-Hag 終濃度為 8 μ g/ml, IFN- Y 終濃度為 1000IU/ml。
[0021]作為優(yōu)選，所述步驟4)具體包括:將步驟2)中收集的懸浮細胞重懸于含8-10%自體滅活血漿的PAA?或者GT-T551?等商品化無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度(1_2) X IO6/ml左右，并加入IFN-Y至終濃度500-1500IU/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進行培養(yǎng)；培養(yǎng)20-28小時后加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL-1 α、IL-2,40-50小時后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin,BCG)連續(xù)培養(yǎng)6~7天,其中每2~3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補加培養(yǎng)基后的細胞密度控制在(1-2) X106/ml。
[0022]作為優(yōu)選，所述步驟4)中所加入的抗⑶3單抗?jié)舛葹?0~500ng/ml，抗⑶28單抗的濃度為50~500ng/ml，IL-1 α的濃度為0.5~5ng/ml，IL-2的濃度為50~1000IU/ml ;加入卡介苗的濃度為5~20 μ g/ml。
[0023]進一步地，所述步驟4)中IFN- Y的濃度為1000IU/ml，培養(yǎng)20_28小時候加入抗CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml，抗CD28單抗的濃度為200ng/ml，IL-1 α的濃度為lng/ml，IL-2的濃度為1000IU/ml，40-50小時后加入BCG的濃度為10 μ g/ml。
[0024]作為優(yōu)選，所述步驟5)具體包括:將步驟3)及步驟4)中培養(yǎng)的DC和CD3+CD8+CIK 收集并重懸于含有 5 ~20 μ g/ml 的 BCG、50 ~1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551?培養(yǎng)基中在進行培養(yǎng)14~21天，每2~3天進行補加含有50~1000IU/ml的IL-2的GT-T551?培養(yǎng)基。
[0025]進一步優(yōu)選地，所述BCG濃度為10 μ g/ml，所述IL-2終濃度為1000IU/ml。
[0026]本發(fā)明所制備的人D-CIK細胞主要應(yīng)用于癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預防。
[0027]所屬腫瘤抗原包含并不限于下述抗原:CD19、CD20、WT-1、MUCl、LMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2/neu、Idiotype, MAGE A3、p53、NY-ESO-l、PSMA、⑶2、CEA, MelanA/MARTl、Ras mutant、gp100、p53mutant、Proteinase3、bcr-ab1、Tyrosinase、Survivin、PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP、AFP、EpCAM、ERG、NAl7、PAX3、ALK、Androgen receptor、CycI inB1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP-2、⑶3、Fucosyl GMl、Mesothelin、PSCA、MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn。所述 IL-1 β (lOng/mL)，IL-6 (lOOng/mL)，TNF- a (lOng/mL)，Mtb-HAg 的終濃度為 8 μ g/ml, IFN- y 的終濃度為 1000IU/ml。
[0028]所述腫瘤包含并不限于B淋巴細胞腫瘤細胞、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結(jié)直腸癌細胞、肝癌細胞、食管癌細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞、膀胱癌細胞和宮頸癌細胞等。
[0029]本發(fā)明所用的原料和試劑除有特殊說明外，均市售可得。
[0030]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比:本發(fā)明所制備的D-CIK細胞，細胞擴增效率高，總細胞擴增效率在21天是現(xiàn)有CIK細胞擴增效率的3倍左右；對腫瘤細胞殺傷活性強，其細胞毒活性從現(xiàn)有CIK細胞對K562細胞殺傷活性的50 %提高到90 %左右。同時具有制備工藝簡單、成本低廉、易于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]:圖1:成熟DC形態(tài)。培養(yǎng)第7天，成熟DC在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為40 X ；
[0032]圖2:培養(yǎng)第7天流式細胞術(shù)進行DC成熟度檢測；
[0033]圖3:不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs生長曲線(n=8);外周血來源的PBMCs通過不同方式培養(yǎng)，在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分別用細胞計數(shù)板和細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，將當前細胞總數(shù)除以開始培養(yǎng)時(第O天)的細胞總數(shù)，所得數(shù)值即為細胞增殖倍數(shù)。CIK組:指采用斯坦福大學應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細胞<D3⑶8CIK組:指本發(fā)明中所采用的優(yōu)化的CIK培養(yǎng)方式培養(yǎng)的細胞CD3+CD8+CIK細胞；D_CIK組:指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式；
[0034]圖4:采用流式細胞儀進行免疫表型檢測(n=8)。外周血來源的PBMCs，通過不同方式培養(yǎng)，在第14天取細胞進行流式熒光抗體:抗CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PECY5.5、CD56_APC進行表面染色并檢測。CIK組:指采用斯坦福大學應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細胞；CD3CD8CIK組:指本發(fā)明中所采用的優(yōu)化的CIK培養(yǎng)方式培養(yǎng)的⑶3+⑶8+CIK細胞；D-CIK組:指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式:；[0035]圖5:采用CCK-8細胞毒活性檢測試劑盒對不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs進行細胞毒性檢測(n=8)。通過不同方式培養(yǎng)，在第14天取細胞通過CCK-8試劑盒進行細胞毒活性檢測。CIK組:指采用斯坦福大學應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細胞KD3⑶8CIK組:指本發(fā)明中所采用的優(yōu)化的CIK培養(yǎng)方式培養(yǎng)的CD3+CD8+CIK細胞；D_CIK組:指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。橫坐標:表示效靶細胞比值，E: T=IO: I表示效應(yīng)細胞與靶細胞的比值為10: 1,E: T=20: I表示效應(yīng)細胞與靶細胞的比值為20: Ι,Ε: Τ=40: I表示效應(yīng)細胞與靶細胞的比值為40: I。
【具體實施方式】
[0036]下面用實例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實例中凡未注明具體條件的實驗方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。
[0037]實施例1
[0038]本實施例1是分離獲得的PBMCs并進行D-CIK細胞的培養(yǎng)。包括以下步驟:
[0039]1.采集患者外周靜脈血30~50ml，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細胞。具體步驟為:1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56°C滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對倍稀釋沉淀的血細胞，人淋巴細胞分離液與稀釋血液按1: 2的比例加入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)速分別為1600轉(zhuǎn)/分，1300轉(zhuǎn)/分，均離心7分鐘，即得到PBMCs。
[0040]2.通過貼壁法將上述PBMCs進一步分離獲得單核細胞和懸浮細胞。具體步驟為:將上述分離的PBMCs重懸于PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基的任意一種培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度為(5~10) X 106/ml，總體積為IOml加入T75ml的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37°C、5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁2h ;輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使未貼壁細胞重新懸??；然后收集懸浮的未貼壁細胞，則留下的貼壁細胞即為單核細胞。
[0041]3.單核細胞誘導分化為成熟的DC。具體步驟為:將20ml含有10%自體血漿、800IU/mlGM-CSF、1000IU/ml IL-4 的 X-VIV0-15? 培養(yǎng)基或者 AM-V? 培養(yǎng)基加入上述 T75的培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后置于37°C、5% C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第三天(72h)吸棄IOml培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，并補加IOml新鮮的含有10%自體血漿、800IU/ml GM-CSF、1000IU/mlIL-4、I~20 μ g/ml的腫瘤抗原的X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基，其中腫瘤抗原優(yōu)選的濃度為10yg/ml。在細胞培養(yǎng)的第五天,加入IL-1 β (10ng/mL), IL-6 (100ng/mL),TNF-t a (lOng/mL)，Mtb-HAg 終濃度為 8 μ g/ml, IFN- y 終濃度為 1000IU/ml。細胞培養(yǎng)的第6~7天，分別通過倒置顯微鏡和流式細胞術(shù)進行DC形態(tài)(見圖1)和成熟度(見圖2)檢測。
[0042]4.⑶3+⑶8+CIK細胞的誘導培養(yǎng)。具體步驟為:將實施例1步驟2中收集的懸浮細胞重懸于含10%自體滅活血漿的PAA?或者GT-T551?等商品化無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度2 X 106/ml左右，并加入IFN-Y至終濃度1000IU/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL-1 a、IL-2,48小時后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin, BCG)連續(xù)培養(yǎng)6~7天,其中每2~3天補加含有IL_2的新鮮培養(yǎng)基，使補加培養(yǎng)基后的細胞密度控制在(I~2)X106/ml。其中，抗CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml，抗CD28單抗的濃度為200ng/ml，IL-1 α的濃度為lng/ml，IL-2的濃度為1000IU/ml ；48小時后加入BCG的濃度為10 μ g/ml。
[0043]5.D-CIK細胞的誘導培養(yǎng)。具體步驟為:將實施例1步驟3、4中培養(yǎng)6~7天的DC 和 CD3+CD8+CIK 收集并重懸于含有 10 μ g/ml 的 BCG、1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551? 培養(yǎng)基中在進行培養(yǎng)14~21天(PBMCs分離為第O天計算)，以后每2~3天進行補加含有1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551? 培養(yǎng)基。
[0044]實施例2
[0045]本實施例2是對D-CIK細胞進行形態(tài)學和增值能力檢測。包括以下步驟:
[0046]1.DC和⑶3+⑶8+CIK共培養(yǎng)24小時即可見細胞沉于培養(yǎng)瓶的底部，有大量的大小不一的集落和不規(guī)則的單個核細胞。對培養(yǎng)12~14天的細胞進行瑞姬氏染色，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞體積增大，呈橢圓形或不規(guī)則形，細胞核大多為橢圓形或圓形，核染色疏松，核膜不規(guī)則，有突起，每個細胞可見I個小核仁，呈深藍色；胞質(zhì)豐富，染成灰藍色，形態(tài)不規(guī)貝U，有偽足，近核處有淡染現(xiàn)象，也有呈不規(guī)則形。取培養(yǎng)12~14天的細胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%臺盼藍染色液，活細胞不染色，死細胞染成藍色，顯微鏡下計數(shù)。本發(fā)明制備的細胞活力大于95%。
[0047]2.在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分別用細胞計數(shù)板和細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，
將當前細胞總數(shù)除以開始培養(yǎng)時的細胞總數(shù)，所得數(shù)值即為細胞增殖倍數(shù)，以此進行動態(tài)觀察細胞增殖情況并作為細胞補加新鮮培養(yǎng)基時的參考，細胞增殖倍數(shù)見圖3、表1。
[0048]表1:不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs擴增倍數(shù)(η=8)
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，其特征在于，包括步驟: 1)采集外周靜脈血，獲得單個核細胞； 2)進一步分離獲得單核細胞和懸浮細胞； 3)單核細胞誘導分化為成熟的DC； 4)⑶3+⑶8+CIK細胞的誘導培養(yǎng)； 5)D-CIK細胞的誘導培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟I)為將外周靜脈血經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細胞；所述步驟2)為通過貼壁法將上述單個核細胞進一步分離獲得單核細胞和懸浮細胞。
3.如權(quán)利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟3)具體包括:將含有8-10%自體血漿、800-1000IU/ml GM-CSF、800_1000IU/mlIL-4的X-VIVO-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基加入獲取的單核細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)2_3天后，更換新鮮培養(yǎng)基，并在新鮮培養(yǎng)基中加入I~20 μ g/ml的腫瘤抗原，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)1-2 天后，加入 IL-1 P、IL-6、TNF-α，或者 IL-1 P、IL-6、TNF-α 與 Mtb-HAg 及 IFN-Y 中的一種或者兩種的組合；繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，進行DC成熟度和IL-12含量檢測。
4.如權(quán)利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟4)具體包括:將步驟2)中收集的懸浮細胞重懸于含8-10%自體滅活血漿的ΡΑΑ?或者GT-T551?等商品化無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度(1_2) X 106/ml左右，并加入IFN-Y至終濃度500-1500IU/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進行培養(yǎng)；培養(yǎng)20-28小時后加入抗CD3單抗、抗CD28單抗、IL-1a、IL-2,40-50小時后加入卡介苗(bacillusCallmette-Guerin, BCG)連續(xù)培養(yǎng)6~7天，其中每2~3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補加培養(yǎng)基后的細胞密度控制在(1-2) X106/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟5)具體包括:將步驟3)及步驟4)中培養(yǎng)的DC和CD3+CD8+CIK收集并重懸于含有5~20 μ g/ml的BCG,50~1000IU/ml的IL-2的GT-T551?培養(yǎng)基中在進行培養(yǎng)14~21天，每2~3天進行補加含有50~1000IU/ml的IL-2的GT-T551?培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求3所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，其特征在于，所述 IL-1 β 終濃度為 8-15ng/mL，IL-6 終濃度為 50_150ng/mL，TNF-α 終濃度為 8_15ng/mL, Mtb-Hag終濃度為5~10 μ g/ml, IFN- Y終濃度為100~1000IU/ml ;所述的DC成熟度的檢測方法為流式細胞術(shù)，IL-12含量檢測方法為ELISA。
7.如權(quán)利要求4所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，其特征在于，所述抗CD3單抗?jié)舛葹?0~500ng/ml，抗CD28單抗的濃度為50~500ng/ml，IL-1 α的濃度為0.5~5ng/ml, IL-2的濃度為50~1000IU/ml ;加入卡介苗的濃度為5~20 μ g/ml。
8.如權(quán)利要求7所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法，其特征在于，所述BCG濃度為10 μ g/ml，所述IL-2終濃度為1000IU/ml。
【文檔編號】C12N5/0783GK103642754SQ201310638842
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】馬飛, 李龍云, 李正成 申請人:深圳市合一康生物科技有限公司