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一種高毒性、高增值能力的人d-cik細胞的專用試劑盒的制作方法

文檔序號:459807閱讀:591來源:國知局
一種高毒性、高增值能力的人d-cik細胞的專用試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒。該人D-CIK細胞專用試劑盒由單核細胞分離獲取培養(yǎng)基、促DC誘導分化培養(yǎng)基、促DC成熟劑、腫瘤抗原、強化細胞毒活性培養(yǎng)基、細胞激活增值培養(yǎng)基、CD3+CD8+T淋巴細胞誘導分化培養(yǎng)基、細胞擴增培養(yǎng)基組成。通過試劑盒所制備的D-CIK細胞與CIK細胞比較,增值活性和細胞毒活性更強,同時具有制備工藝簡單、成本低廉、易于規(guī)?;a(chǎn)等優(yōu)勢。通過本發(fā)明所制備的D-CIK細胞,其應(yīng)用主要為癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預防。
【專利說明】一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的專用試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞免疫學【技術(shù)領(lǐng)域】,具體地說是一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokineinduced killer cell, CIK)是 Schmidt 等于1986年報道的從外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中誘導出的一群異質(zhì)性細胞。其主要效應(yīng)細胞因同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子,因此又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞(NKT細胞)。體內(nèi)外的實驗研究表明,CIK細胞具有殺瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及殺瘤效應(yīng)不受癌細胞多重耐藥的影響等優(yōu)勢。
[0003]樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是目前所知功能最強的抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell, APC),表面具有豐富的有助于抗原呈遞的分子,如主要組織相容性復合體 1、II (major histocompatibility complex I/I I, MHC I/II)、CD80/86、CD40、ICAM-1等共刺激分子,能有效的激活初始型T細胞(naiVe T cell)使其活化和增值,啟動特異性免疫應(yīng)答反應(yīng),發(fā)揮有效的抗腫瘤效應(yīng)。
[0004]樹突狀細胞調(diào)節(jié)的細胞因子誘導的殺傷細胞(dendritic cell activated andcytokine induced killer cell, D-CIK)是指將成熟的DC與同源的CIK細胞同培養(yǎng)而形成的一群異質(zhì)性細胞群。共培養(yǎng)既可以促進DC分泌IL-12,又可以促進CIK細胞的增值,并加強其抗腫瘤活性。Nterten A等研究發(fā)現(xiàn),IL-12攝取阻斷會減弱CIK細胞的細胞毒活性。因此,D-CIK細胞應(yīng)用于惡性腫瘤患者的治療,有助于解除腫瘤患者體內(nèi)T細胞的免疫無能,從而提高抗腫瘤活性 。
[0005]現(xiàn)有CIK細胞制備技術(shù)中存在:(I)CIK細胞中絕大部分群體為⑶3+⑶8+T淋巴細胞,大約占CIK細胞的60%左右,然而其殺瘤活性卻受到極大的限制;這與目前的0)3+0)8+Τ淋巴細胞,也即細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)是抗腫瘤的主要免疫效應(yīng)細胞的認識存在差異。(2)雖然主要效應(yīng)細胞——NKT細胞,擴增1000倍左右,但整體細胞群體擴增能力較為有限,大約80~100倍左右。DC制備技術(shù)中存在,成熟DC分泌IL-12因子的水平偏低。二者共培養(yǎng)后,增值能力和細胞毒活性提高不顯著等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種能夠培養(yǎng)出以⑶3+⑶8+T淋巴細胞為主效應(yīng)細胞的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒。
[0007]本發(fā)明所提供的一種能夠培養(yǎng)出以⑶3+⑶8+T淋巴細胞為主要效應(yīng)細胞的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,該試劑盒由單核細胞分離獲取培養(yǎng)基、促DC誘導分化培養(yǎng)基、促DC成熟劑、腫瘤抗原、強化細胞毒活性培養(yǎng)基、細胞激活增值培養(yǎng)基、CD3+CD8+T淋巴細胞誘導分化培養(yǎng)基、細胞擴增培養(yǎng)基組成。[0008]作為優(yōu)選,所述單核細胞分離獲取培養(yǎng)基為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種。
[0009]作為優(yōu)選,所述促DC誘導分化培養(yǎng)基的溶劑為X-VIVO-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基中任意一種,溶質(zhì)為GM-CSF和IL-4,其中GM-CSF的濃度是800_1000IU/ml,IL-4的濃度是 800-1000IU/ml。
[0010]進一步地,所述促DC誘導分化培養(yǎng)基的GM-CSF的濃度是800IU/ml,IL-4的濃度是 1000IU/ml。
[0011]作為優(yōu)選,所述促DC成熟劑的溶劑為X-VIVO-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基中任意一種,溶質(zhì)為 IL-1 β、IL-6、TNF-a,或者 IL-1 β、IL_6、TNF_a 與 IFN- y , Mtb-Hag 中的一種或者兩種,該促DC成熟劑加入到培養(yǎng)體系后,IL-1 β終濃度為8-15ng/mL,IL-6終濃度為 50-150ng/mL,TNF- α 終濃度為 8_15ng/mL,Mtb-Hag 終濃度為 5 ~10 μ g/ml, IFN- y終濃度為100~1000IU/ml。
[0012]進一步地,所述促DC成熟劑加入到培養(yǎng)體系后,IL-1 β的濃度是10ng/mL,IL-6的濃度是 100ng/mL,TNF- α 的濃度是 10ng/mL,IFN- Y 的濃度是 1000IU/ml,Mtb-HAg 的濃度是 8 μ g/ml ο
[0013]作為優(yōu)選,所述腫瘤抗原為下述抗原中的一種或多種:⑶19、⑶20、WT-1、MUCULMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2/neu、Idiotype, MAGE A3、p53、NY-ESO-U PSMA,⑶2、CEA> MelanA/MARTl、Ras mutant、gplOO、p53mutant、Proteinase3、bcr-abl、Tyrosinase、Survivin, PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP, AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK,Androgen receptor、CyclinBl、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、Fucosyl GMl>Mesothelin、PSCA、MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn,該抗原加入培養(yǎng)體系后濃度是I~20 μ g/ml。`
[0014]進一步地,所述腫瘤抗原包加入培養(yǎng)體系后濃度是10 μ g/ml ο
[0015]作為優(yōu)選,所述強化細胞毒活性培養(yǎng)基的溶劑為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種,溶質(zhì)為IFN- Y,其中IFN- Y的濃度為800-1000IU/ml。
[0016]進一步地,所述強化細胞毒活性培養(yǎng)基中IFN-Y的濃度為1000IU/ml。
[0017]作為優(yōu)選,所述細胞激活增值培養(yǎng)基的溶劑為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種,溶質(zhì)包括抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL-1 α與IL-2中的一種或者幾種,其中抗⑶3單抗?jié)舛葹?0~500ng/ml,抗⑶28單抗的濃度為50~500ng/ml, IL-1 α的濃度為0.5~5ng/ml, IL-2的濃度為50~1000IU/ml。
[0018]進一步地,所述細胞激活增值培養(yǎng)基中抗⑶3單抗?jié)舛葹?00ng/ml、抗⑶28單抗的濃度為200ng/ml、IL-1 α的濃度為lng/ml、IL-2的濃度為1000IU/ml ;
[0019]作為優(yōu)選,所述⑶3+⑶8+T淋巴細胞誘導分化培養(yǎng)基的溶劑為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種,溶質(zhì)為BCG,其中BCG 的濃度為 5-20 μ g/ml。
[0020]進一步地,所述⑶3+⑶8+T淋巴細胞誘導分化培養(yǎng)基中BCG的濃度為10 μ g/ml ;[0021 ] 作為優(yōu)選,所述細胞擴增培養(yǎng)基的溶劑為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種,溶質(zhì)為IL-2,其中IL-2的濃度為800-1000IU/ml。
[0022]進一步地,所述細胞擴增培養(yǎng)基中IL-2的濃度為1000IU/ml。
[0023]作為優(yōu)選,所述強單核細胞分離獲取培養(yǎng)基、促DC誘導分化培養(yǎng)基、促DC成熟劑、強化細胞毒活性培養(yǎng)基、細胞激活增值培養(yǎng)基、CD3+CD8+T淋巴細胞誘導分化培養(yǎng)基、細胞擴增培養(yǎng)基組成的PH是7.2~7.4。
[0024]所述腫瘤包含并不限于B淋巴細胞腫瘤細胞、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結(jié)直腸癌細胞、肝癌細胞、食管癌細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞、膀胱癌細胞和宮頸癌細胞
坐寸ο
[0025]本文中的“⑶3+⑶8+CIK細胞”表示CD3和⑶8均為陽性的CIK細胞。
[0026]所述人D-CIK細胞是以⑶3+⑶8+T細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)性細胞群體,該細胞高表達人白細胞分化抗原CD3、人白細胞分化抗原CD8和人α β TCR受體,約占異質(zhì)性細胞群體的95%。 [0027]本發(fā)明的另一個目的是提供一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞的制備方法。
[0028]該方法為按照專屬試劑盒操作說明書要求并補加1%~10%自體血漿的條件下,其主要效應(yīng)細胞為CD3+CD8+T細胞,含量約占異質(zhì)性細胞群體的95%。
[0029]本發(fā)明的高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒選擇性強,可以從人PBMCs中誘導出以CD3+CD8+T細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)性細胞群體。用該高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒獲得的人D-CIK細胞能夠直接配合傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療等治療方式進行體內(nèi)回輸,直接用于癌癥病人的治療,可達到在常規(guī)療法清除大量腫瘤細胞后,進行清除少量殘留或擴散的腫瘤細胞,以提高、鞏固腫瘤治療效果,減少復發(fā)、提高生活質(zhì)量的目的;或者對癌癥高危人群進行直接回輸進行預防。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1:成熟DC形態(tài)。培養(yǎng)第7天,成熟DC在倒置顯微鏡下的形態(tài),放大倍率為40Χ。
[0031]圖2:培養(yǎng)第7天采用流式細胞儀進行DC成熟度檢測。
[0032]圖3:不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs生長曲線(η = 8);外周血來源的PBMCs通過不同方式培養(yǎng),在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分別用細胞計數(shù)板和細胞計數(shù)儀進行計數(shù),將當前細胞總數(shù)除以開始培養(yǎng)時(第O天)的細胞總數(shù),所得數(shù)值即為細胞增殖倍數(shù)。CIK組:指采用斯坦福大學應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細胞KD3⑶8CIK組:指本發(fā)明中所采用的優(yōu)化的CIK培養(yǎng)方式培養(yǎng)的細胞CD3+CD8+CIK細胞;D_CIK組:指本發(fā)明所米用的培養(yǎng)方式。、
[0033]圖4:采用流式細胞儀進行免疫表型檢測(η = 8)。外周血來源的PBMCs,通過不同方式培養(yǎng),在第14天取細胞進行流式熒光抗體:抗⑶3-FITC、⑶4-PE、⑶8-PECY5.5、CD56-APC進行表面染色并檢測。CIK組:指采用斯坦福大學應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細胞;⑶3⑶8CIK組:指本發(fā)明中所采用的優(yōu)化的CIK培養(yǎng)方式培養(yǎng)的⑶3+⑶8+CIK細胞;D_CIK組:指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。
[0034]圖5:采用CCK-8細胞毒活性檢測試劑盒對不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs進行細胞毒性檢測(η = 8)。通過不同方式培養(yǎng),在第14天取細胞通過CCK-8試劑盒進行細胞毒活性檢測。CIK組:指采用斯坦福大學應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細胞KDXDSCIia1:指本發(fā)明中所采用的優(yōu)化的CIK培養(yǎng)方式培養(yǎng)的CD3+CD8+CIK細胞;D_CIK組:指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。橫坐標:表示效靶細胞比值,E:T = 10:1表示效應(yīng)細胞與靶細胞的比值為10:1,Ε:Τ = 20:1表示效應(yīng)細胞與靶細胞的比值為20:1,Ε:Τ = 40:1表示效應(yīng)細胞與靶細胞的比值為40:1。
【具體實施方式】
[0035]下面用實例來具體說明本發(fā)明,但本發(fā)明并不受其限制。下面實例中凡未注明具體條件的實驗方法,均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。
[0036]實施例1
[0037]本實施例1是分離獲得的PBMCs并進行D-CIK細胞的培養(yǎng)。包括以下步驟:
[0038]1.采集患者外周靜脈血30~50ml,經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細胞。具體步驟為:1500轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,吸取上層血漿層,56°C滅活30分鐘后離心備用,用生理鹽水對倍稀釋沉淀的血細胞,人淋巴細胞分離液與稀釋血液按1:2的比例加入離心管中,2000轉(zhuǎn)/分,離心20分鐘,小心吸取白膜層,用生理鹽水洗滌2次,轉(zhuǎn)速分別為1600轉(zhuǎn)/分,1300轉(zhuǎn)/分,均離心7分鐘,即得到PBMCs。
[0039]2.通過貼壁法將上述PBMCs進一步分離獲得單核細胞和懸浮細胞。具體步驟為:將上述分離的PBMCs重懸于PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基的任意一種培養(yǎng)基中,調(diào)整細胞密度為(5~10) X 106/ml,總體積為IOml加入T75ml的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi),于37°C、5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁2h ;輕輕晃動培養(yǎng)瓶,使未貼壁細胞重新懸??;然后收集懸浮的未貼壁細胞,則留下的貼壁細胞即為單核細胞。
[0040]3.單核細胞誘導分化為成熟的DC。具體步驟為:將20ml含有10%自體血漿、800IU/mlGM-CSF、1000IU/ml IL-4 的 X-VIV0-15? 培養(yǎng)基或者 AM-V? 培養(yǎng)基加入上述 T75的培養(yǎng)瓶內(nèi),然后置于37°C、5% C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第三天(72h)吸棄IOml培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基,并補加IOml`新鮮的含有10%自體血漿、800IU/ml GM-CSF、1000IU/mlIL-4、I~20 μ g/ml的腫瘤抗原的X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基,其中腫瘤抗原優(yōu)選的濃度為10yg/ml。在細胞培養(yǎng)的第五天,加入IL-1 β (10ng/mL), IL-6 (100ng/mL),TNF-a (10ng/mL),Mtb-HAg 終濃度為 8yg/ml,IFN-Y 終濃度為 1000IU/ml。細胞培養(yǎng)的第6~7天,分別通過倒置顯微鏡和流式細胞術(shù)進行DC形態(tài)(見圖1)和成熟度(見圖2)檢測。
[0041]4.⑶3+⑶8+CIK細胞的誘導培養(yǎng)。具體步驟為:將實施例1步驟2中收集的懸浮細胞重懸于含10%自體滅活血漿的PAA?或者GT-T551?等商品化無血清培養(yǎng)基中,調(diào)整細胞密度2 X 106/ml左右,并加入IFN-Y至終濃度1000IU/ml,最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL-1 α、IL-2,48小時后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin, BCG)連續(xù)培養(yǎng)6~7天,其中每2~3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基,使補加培養(yǎng)基后的細胞密度控制在I~2X106/ml。其中,抗CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml,抗CD28單抗的濃度為200ng/ml,IL-1 α的濃度為lng/ml,IL-2的濃度為1000IU/ml ;48小時后加入BCG的濃度為10 μ g/ml。
[0042]5.D-CIK細胞的誘導培養(yǎng)。具體步驟為:將實施例1步驟3、4中培養(yǎng)6~7天的DC 和 CD3+CD8+CIK 收集并重懸于含有 10 μ g/ml 的 BCG、1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551? 培養(yǎng)基中在進行培養(yǎng)14~21天(PBMCs分離為第O天計算),以后每2~3天進行補加含有1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551? 培養(yǎng)基。
[0043]實施例2
[0044]本實施例2是對D-CIK細胞進行形態(tài)學和增值能力檢測。包括以下步驟:
[0045]1.DC和⑶3+⑶8+CIK共培養(yǎng)24小時即可見細胞沉于培養(yǎng)瓶的底部,有大量的大小不一的集落和不規(guī)則的單個核細胞。對培養(yǎng)12~14天的細胞進行瑞姬氏染色,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞體積增大,呈橢圓形或不規(guī)則形,細胞核大多為橢圓形或圓形,核染色疏松,核膜不規(guī)則,有突起,每個細胞可見I個小核仁,呈深藍色;胞質(zhì)豐富,染成灰藍色,形態(tài)不規(guī)貝U,有偽足,近核處有淡染現(xiàn)象,也有呈不規(guī)則形。取培養(yǎng)12~14天的細胞100 μ 1,加入100 μ 10.4%臺盼藍染色液,活細胞不染色,死細胞染成藍色,顯微鏡下計數(shù)。本發(fā)明制備的細胞活力大于95%。
[0046]2.在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分別用細胞計數(shù)板和細胞計數(shù)儀進行計數(shù),
將當前細胞總數(shù)除以開始培養(yǎng)時的細胞總數(shù),所得數(shù)值即為細胞增殖倍數(shù),以此進行動態(tài)觀察細胞增殖情況并作為細胞補加新鮮培養(yǎng)基時的參考,細胞增殖倍數(shù)見圖3和表1。
[0047]表1:不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs擴增倍數(shù)(η = 8)
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,包括: (1)單核細胞分離獲取培養(yǎng)基; (2)促DC誘導分化培養(yǎng)基; (3)促DC成熟劑; (4)腫瘤抗原; (5)強化細胞毒活性培養(yǎng)基; (6)細胞激活增值培養(yǎng)基; (7)⑶3+⑶8+T淋巴細胞誘導分化培養(yǎng)基; (8)細胞擴增培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,所述單核細胞分離獲取培養(yǎng)基為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,所述促DC誘導分化培養(yǎng)基的溶劑為X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基中任意一種,溶質(zhì)為GM-CSF和IL-4,其中GM-CSF的濃度是800_1000IU/ml,IL-4的濃度是800-1000IU/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,所述促DC成熟劑的溶劑為X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基中任意一種,溶質(zhì)為 IL-1 β、IL-6、TNF-a,或者 IL-1 β、IL_6、TNF_a 與 IFN- y , Mtb-Hag 中的一種或者兩種,該促DC成熟劑加入到培養(yǎng)體系后,IL-1 β終濃度為8-15ng/mL,IL-6終濃度為50-150ng/mL, TNF- α 終濃度為 8_15ng/mL,Mtb-Hag 終濃度為 5 ~10 μ g/ml, IFN- Y 終濃度為 100 ~1000IU/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,所述腫瘤抗原為下述抗原中的一種或多種:⑶19、⑶20、WT-1、MUCULMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2/neu、Idiotype, MAGE A3、p53、NY-ESO-U PSMA,⑶2、CEA> MelanA/MARTl、Ras mutant、gplOO、p53mutant、Proteinase3、bcr-abl、Tyrosinase、Survivin, PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP, AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK,Androgen receptor、Cyclin B1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、Fucosyl GMl>Mesothelin、PSCA, MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn,該抗原加入培養(yǎng)體系后濃度是I~20 μ g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,所述強化細胞毒活性培養(yǎng)基的溶劑為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種,`溶質(zhì)為IFN- Y,其中IFN- Y的濃度為800-1000IU/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,所述細胞激活增值培養(yǎng)基的溶劑為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種,溶質(zhì)包括抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL-1 α與IL-2中的一種或者幾種,其中抗⑶3單抗?jié)舛葹?0~500ng/ml,抗⑶28單抗的濃度為50~500ng/ml, IL-1 α的濃度為0.5~5ng/ml, IL-2的濃度為50~1000IU/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,所述⑶3+⑶8+T淋巴細胞誘導分化培養(yǎng)基的溶劑為pAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種,溶質(zhì)為BCG,其中BCG的濃度為5-20 μ g/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,所述細胞擴增培養(yǎng)基的溶劑為pAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種,溶質(zhì)為IL-2,其中IL-2的濃度為800_1000IU/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細胞制備的專用試劑盒,其特征在于,所述強單核細胞分離獲取培養(yǎng)基、促DC誘導分化培養(yǎng)基、促DC成熟劑、強化細胞毒活性培養(yǎng)基、細胞激活增值培養(yǎng)基、CD3+CD8+T淋巴細胞誘導分化培養(yǎng)基、細胞擴增培養(yǎng)基組成的PH是7.2~7.4 。
【文檔編號】C12N5/0783GK103756960SQ201310651747
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】馬飛, 魏宗科, 朱利軍 申請人:深圳市合一康生物科技有限公司
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