一種牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應(yīng)用。本發(fā)明所述引物組合物由引物組A和引物組B組成，所述引物組A由引物1和引物2組成，所述引物組B由引物3和引物4組成；引物1～引物4的核苷酸序列分別如SEQIDNO.1～4所示。本發(fā)明還提供了包含所述引物組合的試劑盒，本發(fā)明試劑盒應(yīng)用于牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的方法如下：提取牛血液中的全組DNA作為模板，進(jìn)行巢式PCR（NestedPCR）擴增，所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果可直接了解突變位點的堿基變化，確保了結(jié)果的準(zhǔn)確性，滿足快速、精準(zhǔn)、高通量等特點的檢測技術(shù)的需求。
【專利說明】一種牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一種牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人工授精和胚胎移植技術(shù)的推廣和應(yīng)用，奶牛優(yōu)秀種質(zhì)(胚胎、精液、種牛)在全球范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用，在顯著提高遺傳性能的同時，加速了牛隱性遺傳疾病對牛群的危害。特別是一頭優(yōu)秀的種公牛一生可以生產(chǎn)幾十萬劑甚至上百萬劑冷凍精液，如果攜帶隱性遺傳缺陷基因，有可能在全世界范圍內(nèi)快速蔓延，給畜牧業(yè)的生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。我國主要從美國、加拿大、德國、澳大利亞、新西蘭和烏拉圭等國進(jìn)口大量奶牛優(yōu)秀種質(zhì)，進(jìn)口時檢疫重點在于防止動物傳染病和寄生蟲病的傳入，卻沒有包括防止牛遺傳缺陷的檢疫要求，所以存在的牛遺傳性缺陷攜帶者進(jìn)入我國的風(fēng)險。
[0003]遺傳缺陷病是生殖細(xì)胞或受精卵內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生基因突變和染色體畸變導(dǎo)致的，從而使發(fā)育個體出現(xiàn)解剖結(jié)構(gòu)上的異常或生理機能上的損害，常常導(dǎo)致某些器官的損害，形成畸形，影響生產(chǎn)性能，甚至導(dǎo)致死亡。具有先天性和家族性的特征。遺傳缺陷性病分為常染色體遺傳缺陷病和性染色體遺傳缺陷病，其中常染色體遺傳缺陷病根據(jù)致病原因又分為單基因遺傳缺陷病、多基因遺傳缺陷病和染色體畸變遺傳缺陷病三種，性染色體遺傳缺陷較少見。常染色體單基因遺傳缺陷病是由一對等位基因控制的，隱性有害基因攜帶者表型正常，兩個親本都為攜帶者時，后代有1/4可能出現(xiàn)隱性純合子，即表型為患病，1/2可能為隱性雜合子，即為有害基因攜帶者。
[0004]尿苷酸合酶缺乏癥(Deficiencyof Uridine MonophosPhate Synthase, DUMPS)又稱單譜癥，是荷斯坦牛的一種導(dǎo)致胚胎早期死亡的遺傳缺陷，屬于常染色體單基因隱性突變。臨床癥狀為血液中瓜氨酸含量升高，尿素循環(huán)受阻引起高氨血癥，從而導(dǎo)致犢牛在出生一周內(nèi)死亡，或者母牛懷孕約40d左右時流產(chǎn)。
[0005]尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是奶牛I號染色體(BTAl)上的尿苷酸合酶(UMPS)基因C-末端密碼子405處存在著一個C — T點突變，可導(dǎo)致原來編碼精氨酸的密碼子CGA轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子TGA，導(dǎo)致基因編碼產(chǎn)物催化亞基C 一末端缺失76個氨基酸。由于這種蛋白質(zhì)的酶催化功能喪失，因而造成其作用底物乳清酸的大量積累。根據(jù)這一突變位點，由于點突變造成了酶切位點的喪失，國外學(xué)者已建立PCR-RFLP、PCR-SSCP等檢測方法，檢測牛群尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS )雜合子。
[0006]根據(jù)這一突變位點，目前主要有PCR-RFLP和AS-PCR兩種方法檢測尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)。PCR-RFLP方法是在突變點處設(shè)計酶切位點，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切結(jié)果判斷是否具有酶切位點用以判斷是否含有突變點，但是由于牛的基因組較大，只通過一次PCR，因DNA模板的濃度和純度的關(guān)系，擴增效率不高，而且容易發(fā)生錯誤片段，存在假陽性的可能，且該方法引入錯配堿基后，PCR的擴增效率會受到影響。AS-PCR方法根據(jù)突變位點設(shè)計特異的引物，其中一條鏈與突變位點的一種堿基狀態(tài)互補，另一條鏈按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計，特異引物在一種基因型中有擴增產(chǎn)物，在另一種基因型中沒有擴增產(chǎn)物，根據(jù)擴增產(chǎn)的有無確定是否有堿基的突變，但該方法有時會引起在引物的3’末端的堿基與模板的堿基不互補的情況下，延伸仍然可以進(jìn)行，容易造成結(jié)果的誤判。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測檢測技術(shù)的不足，提供一種牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物。
[0008]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供一種牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的試劑盒。
[0009]本發(fā)明還有一要解決的技術(shù)問題是提供所述引物組合物和試劑盒的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
提供一種牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物，由引物組A和引物組B組成；所述引物組A由引物I和引物2組成；所述引物組B由引物3和引物4組成；引物I~4的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1~4所示。
[0011]所述尿苷酸合酶缺乏癥有害基因是尿苷酸合酶基因編碼精氨酸的405處密碼子發(fā)生無義突變的基因。
[0012]優(yōu)選地，引物I和引物2的摩爾比為1: 1，引物3和引物4的摩爾比為1:1。
[0013]本發(fā)明提供所述牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物在巢式PCR法檢測牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基·因方面的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明同時提供含有權(quán)利要求1~3任一所述牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物的試劑盒。
[0015]所述試劑盒，包含有如下組分:本發(fā)明所述牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物、DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP和滅菌水。
[0016]在所述試劑盒中，優(yōu)選地，所述引物組A或引物組B為完整獨立包裝。
[0017]本發(fā)明提供所述試劑盒在檢測牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因方面的應(yīng)用。
[0018]優(yōu)選地，檢測方法是利用巢式PCR方法進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，第一次PCR反應(yīng)的模板為牛血液中的全組DNA，引物為引物組A ;第二次PCR反應(yīng)的模板為第一次PCR反應(yīng)產(chǎn)物的稀釋液，引物為引物組B ;對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果判定是否為牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因。
[0019]優(yōu)選地，第一次PCR反應(yīng)擴增得到一個419bp的片段，如SEQ ID N0.5所示；第二次PCR反應(yīng)擴增得到一個180bp的片段，如SEQ ID N0.6所示；所述判定的方法為根據(jù)測序圖查看所述尿苷酸合酶缺乏癥有害基因是尿苷酸合酶基因編碼精氨酸的405處密碼子是否發(fā)生無義突變來判斷，如果測序圖中該位點為單峰C，則為非尿苷酸合酶缺乏癥有害基因；該位點為雙峰，同時含有C和T，則為尿苷酸合酶缺乏癥有害基因。
[0020]優(yōu)選地，所述第一次PCR反應(yīng)的擴增體系中各組分的比例為模板:引物1:引物
2: PCR反應(yīng)緩沖液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10:1: 73 ;
所述第二次PCR反應(yīng)的擴增體系中各組分的比例為模板:引物3:引物4: PCR反應(yīng)緩沖液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10:1: 73。[0021]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明科學(xué)設(shè)計一組新的引物組合物，具有優(yōu)良的擴增特異性，擴增效率高，有效避免假陰性的結(jié)果，應(yīng)用于檢測牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因準(zhǔn)確性高。
[0022]本發(fā)明所述牛尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)有害基因的檢測方法克服了 PCR-RFLP和AS-PCR兩種檢測方法的缺點，通過兩次PCR，較好地避免了 PCR產(chǎn)物濃度低、擴增效率不高且容易發(fā)生錯誤片段等問題，而且第二次PCR反應(yīng)出現(xiàn)引物配對在錯誤片段上并擴增的概率極低。
[0023]本發(fā)明最終結(jié)果的判定是通過測序來進(jìn)行的，可直接測出突變位點的堿基變化，確保了結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，避免了其他檢測方法需要的凝膠電泳等操作，方法簡單，具有快速、精準(zhǔn)、高通量的優(yōu)點，為檢測牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因提供了有力的技術(shù)基礎(chǔ)，并特別適用于進(jìn)出口貿(mào)易中對牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因的檢測技術(shù)需求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為非尿苷酸合酶缺乏癥有害基因攜帶者(正常型)奶牛牛尿苷酸合酶(UMPS)基因測序圖，箭頭處為突變位點。
[0025]圖2為尿苷酸合酶缺乏癥有害基因攜帶者奶牛UMPS基因測序圖，箭頭處為突變位點。
[0026]圖3為尿苷酸合酶缺乏癥患者奶牛UMPS基因測序圖，箭頭處為突變位點。
[0027]圖4為DUMP基因均一化的HRM溫度變化圖。
[0028]圖5為DUMP基因的HRM差異視圖。
【具體實施方式】
[0029]以下結(jié)合附圖和具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、設(shè)備和方法。
[0030]本發(fā)明實施例所用Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul)和 IOXPfu Buffer、dNTPMixture (2.5 mmol/L),均購自天根生物科技有限公司。
[0031]實施例1制備篩查牛尿苷酸合酶缺乏癥的巢式PCR反應(yīng)試劑盒 1、引物設(shè)計
根據(jù)NCBI上UMPS基因序列(GenBank: AC_000158)結(jié)合本發(fā)明整體思路不斷分析、總結(jié)和調(diào)整引物的設(shè)計，最終根據(jù)牛I號染色體(BTAl)上的尿苷酸合酶(UMPS)基因C-末端密碼子405處存在著一個C — T點突變，設(shè)計了一種檢測牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因的巢式PCR方法，獲得引物1、引物2、引物3和引物4。序列分別如SEQ ID N0.1~4所示:根據(jù)NCBI上牛的基因序列設(shè)計引物1、引物2、引物3和引物4。序列如SEQ ID N0.1-4所示:
引物 I:SEQ ID N0.1:gttattttag ggtcttagtg gage ；
引物 2:SEQ ID N0.2:atatttcaat aaaaagtaac c ；
引物 3:SEQ ID N0.3:ggtgtggtta actgctgtct tg ；
引物 4:SEQ ID N0.4:ccaatcaata ggcttacctc ctg。[0032]其中，引物I和引物2為引物組A(外引物)，引物3和引物4為引物組B(內(nèi)引物)。
[0033]所有引物可以采用合成等常規(guī)方法獲得。本實施例引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
[0034]本發(fā)明所述篩查牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因攜帶者的試劑盒，除了包含有上述引物組，還包含有PCR反應(yīng)相關(guān)試劑。所述引物組是引物組A和引物組B ;所述PCR反應(yīng)相關(guān)試劑為DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP和滅菌水。
[0035]本實施例以引物組A和引物組B同時使用(巢式PCR反應(yīng)試劑盒)為例，說明檢測牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因的試劑盒的制備。
[0036]2、本實施例制備的巢式PCR反應(yīng)試劑盒包括兩個部分:第一次PCR (外引物)試劑盒和第二次PCR (內(nèi)引物)試劑盒。
[0037](I)第一次PCR (外引物)試劑盒
試劑盒除了包括外引物(引物I和引物2)，還包括PCR反應(yīng)試劑:Pfu DNA Polymerase酶(2.5U/ul)、10XPfu Buffer,dNTP Mixture (2.5 mmol/L)、ddH20。PCR 反應(yīng)的引物 I 為正向引物，引物2為反向引物，正反向引物濃度均為10pmol/L。
[0038]PCR反應(yīng)體系以25 uL體系為例:引物I和引物2各0.5mL，IOXPfu Buffer2.5mL、dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2.5mL> Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul) 0.25mL、ddH20 18.25mL,剩下的0.5mL體積為模板DNA。即用于第一次PCR反應(yīng)的試劑混合液中各成分比例為，引物 1:引 物 2:1OXPfu Buffer: dNTP Mixture: Pfu DNA Polymerase酶:ddH20=2: 2: 10: 10:1: 73。
[0039]實驗時根據(jù)體系的總量按比例加入相關(guān)成分并混勻，加入模板DNA進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)。
[0040](2)第二次PCR (內(nèi)引物)試劑盒:
試劑盒包括外引物(引物3和引物4)，PCR反應(yīng)的引物3為正向引物，引物4為反向引物，正反向引物濃度均為lOpmol/L。除引物外，其他相關(guān)成分和各成分的比例同第一次PCR試劑盒相同。即引物3:引物4:1OXPfu Buffer: dNTP Mixture: Pfu DNA Polymerase酶:ddH20=2: 2: 10: 10:1: 73。
[0041]實驗時根據(jù)體系的總量按比例加入相關(guān)成分并混勻，以便加入模板DNA進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)。
[0042]實施例2利用實施例1制備的巢式PCR反應(yīng)試劑盒檢測奶牛尿苷酸合酶缺乏癥 1、牛血液中全組DNA的提取
頸靜脈采血法隨機采集江蘇某隔離場243頭荷斯坦奶牛的血液樣本5mL/頭，并置于真空肝素鈉抗凝管中搖勻后用離心管分裝每管2mL，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0043]采用Promega Maxwell 16核酸自動提取儀進(jìn)行血液基因組DNA的提取，使用配套試劑盒(Promega 公司的 AS1010)。Promega 的 AS1010 試劑盒包含 Maxwell 16 Blood DNACartridges、Purification Plungers、Elution Tubes、Elution buffer。操作按試劑盒說明書進(jìn)行，該儀器啟動后大約每28min可以完成16個樣品DNA的提取。DNA提取完畢后，將其從洗脫管中轉(zhuǎn)移至離心管(Ep管)中，置于_20°C保存待用。
[0044]經(jīng)過測定，提取的牛血液全組DNA樣品的濃度為83ng/ μ L。
[0045]2、第一次PCR (外引物)反應(yīng)以上述抽提得到的DNA為模板，用實施例1中的第一次PCR試劑盒進(jìn)行擴增。體系為25μ L:模板DNA 0.5mL (41.5 ng)、第一次PCR試劑混合物24.5mL (其中包括引物I和引物2各 0.5mL, IOXPfu Buffer 2.5mL、dNTP MixtureC2.5 mmol/L)2.5mL、Pfu DNA Polymerase酶(2.5U/ul) 0.25mL、ddH20 18.25mL)。擴增條件為:94°C 3min,94°C 30s,51.4°C 30s、70.4°C 15s,30cycles,70.4°C lmin。
[0046]以無菌水為模板作為陰性對照.3、第二次PCR (內(nèi)引物)反應(yīng)
取5mL第一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第二次PCR反應(yīng)的模板，用實施例1中的第二次PCR試劑盒進(jìn)行擴增。體系為50 μ L:模板DNA lmL、第二次PCR試劑混合物49mL。擴增條件為:94°C 3min,94°C 30s,65°C 30s,68°C 15s,30 cycles,68°C lmin。
[0047]4、分別對第一次PCR和第二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序(測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成)，擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果用DNAMAN軟件分析，附圖中箭頭所標(biāo)位點為導(dǎo)致DUMPS的SNP位點。根據(jù)測序圖查看牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因攜帶者突變位點是否有變化，如果測序圖中該位點為單峰C (如圖1所示，箭頭處為突變位點)，則為非尿苷酸合酶缺乏癥有害基因攜帶者(正常型);如果該位點為雙峰，同時含有C和T (如圖2所示，箭頭處為突變位點)，則為尿苷酸合酶缺乏癥有害基因攜帶者(雜合子);如果該位點為單峰T (如圖3所示，箭頭處為突變位點)，則為尿苷酸合酶缺乏癥患者(突變型)。
[0048]統(tǒng)計結(jié)果顯示，243份樣品中，DUMPS正常型236份，DUMPS雜合子5份，DUMPS突變型2份。
[0049]對比例I利用HRM檢測方法檢測奶牛瓜氨酸血癥
1、材料
(I)試驗樣本:同實施例2， 頸靜脈采血法隨機采集江蘇某隔離場243頭荷斯坦奶牛的血液樣本5ml/頭，并置于真空肝素鈉抗凝管中搖勻后用離心管分裝每管2ml，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?br> [0050]DNA提取方法同實施例2。
[0051](2)試劑及試劑盒
普通Taq酶試劑盒，購自水源生物科技(上海)有限公司；
Gel extraction kit,購自上海捷瑞生物科技有限公司；
100 bp DNA Ladder Marker，購自水源生物科技(上海)有限公司；
Hot start Taq酶試劑盒,購自水源生物科技(上海)有限公司；
EverGreen Q-PCR Mix，購自水源生物科技(上海)有限公司；
T-載體，購自寶生物(大連)生物工程有限公司；
SYBR GREEN I，購自北京普博欣生物科技有限公司。
[0052](3)主要試劑的配制
電泳緩沖液(50 X TAE貯存液):稱取Tris 242g，冰乙酸57.lmL，加入IOOmL 0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)，定容至1L，用前以蒸餾水稀釋為IX工作液。
[0053]SYBR Green I染料(電泳級)工作液:取TAE電泳工作緩沖液與SYBR Green I染料以1:3的比例配置。
[0054]2、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建采用全基因合成的方法(由上海捷瑞生物科技有限公司合成)，構(gòu)建DUMP標(biāo)準(zhǔn)品，突變基因型質(zhì)粒(T/T型)、野生基因型質(zhì)粒(G/G型)，再以二者等比例混合做成雜合基因模版(G/T 型)。
[0055]3、HRM引物的設(shè)計與合成
根據(jù)Genbank已發(fā)表的DUMP序列，應(yīng)用DNAstar軟件設(shè)計特異性PCR的引物。引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。具體引物如下:
Fl 5’ -TTCTGAATTTGTGATTGGTTTTAT-3’ ；
Rl 5’ -CCTCCTGCTTCTAACTGAACTC-3’。
[0056]引物的產(chǎn)物大小為96bp,退火溫度為60°C。
[0057]4、HRM檢測方法的初步建立
(1)243頭荷斯坦奶牛的血液樣本DNA的基因型的確定方法為，參照標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的曲線形態(tài)來確定。
[0058](2)取I μ L各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的野生和突變的純合性及混合質(zhì)粒DNA分別做模板，按照如下體系進(jìn)行PCR擴增。PCR體系為30yL，包括15yL的2XMix buffer、5 μ L的dNTP、上下游引物各0.5 μ L、I μ L模板DNA、13 μ L的ddH20。
[0059]反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，40個循環(huán)，反應(yīng)在Roche480熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行HRM分析。HRM分析采用Roche480熒光定量PCR儀，檢·測條件為95°C變性lmin，40°C復(fù)性lmin，50°C保持IOs,從50°C開始，以0.01°C /s升溫速度采集熔解曲線數(shù)據(jù)，每秒采集40次數(shù)據(jù)，至95°C結(jié)束熒光米集。
[0060]5、數(shù)據(jù)分析
采用Roche 480自帶的HRM分析軟件進(jìn)行分析。首先對原始熔解曲線進(jìn)行均一化(normalization)，軟件會自動對曲線類型進(jìn)行分組，具有相同或接近的曲線形態(tài)的樣品將被歸為一組，然后通過軟件的差別顯示功能顯出分組的結(jié)果。與已知標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒同組的樣品即具有該質(zhì)?；蝾愋偷幕蛐?。
[0061]結(jié)果如附圖4和附圖5所示，DUMP基因的三種質(zhì)粒的HRM曲線，T/T、C/C純和型和c/τ雜合型曲線都各自不同，得到了很好的區(qū)分，經(jīng)過差異化后，三者區(qū)分更明顯，一般很難區(qū)分的純合型T/T、C/C都分得很開。
[0062]統(tǒng)計結(jié)果顯示，243份樣品中，CN正常型236份，CN雜合子5份，CN突變型2份。
[0063]結(jié)果與本發(fā)明巢式PCR方法結(jié)合測序的檢測方法所得的結(jié)果一致。
[0064]本發(fā)明利用巢式PCR方法結(jié)合測序檢測牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因攜帶者的方法簡單、易操作，且準(zhǔn)確性高，適合快速、精準(zhǔn)、高通量的檢測技術(shù)的需要。
【權(quán)利要求】
1.一種牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物，其特征在于，由引物組A和引物組B組成；所述引物組A由引物I和引物2組成；所述引物組B由引物3和引物4組成；引物I~4的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1~4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物，其特征在于，所述牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因是尿苷酸合酶基因編碼精氨酸的405處密碼子發(fā)生無義突變的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物，其特征在于，引物I和引物2的摩爾比為1:1 ;引物3和引物4的摩爾比為1:1。
4.權(quán)利要求1~3所述牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物在巢式PCR法檢測牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因方面的應(yīng)用。
5.一種含有權(quán)利要求1~3任一所述牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物的試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，包含有如下組分:權(quán)利要求1~3任一所述牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因檢測的引物組合物、DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP和滅菌水。
7.權(quán)利要求5所述試劑盒在檢測牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因方面的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，檢測方法是利用巢式PCR方法進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，第一次PCR反應(yīng)的模板為牛血液中的全組DNA，引物為引物組A ;第二次PCR反應(yīng)的模板為第一次PCR反應(yīng)產(chǎn)物的稀釋液，引物為引物組B ;對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果判定是否為牛尿苷酸合酶缺乏癥有害基因。
9.根據(jù)權(quán)利8所述應(yīng)用，其特征在于，第一次PCR反應(yīng)擴增得到一個419bp的片段，如SEQ ID N0.5所示；第二次PCR反應(yīng)擴增得到一個180bp的片段，如SEQ ID N0.6所示；所述判定的方法為根據(jù)測序圖查看所述尿苷酸合酶缺乏癥有害基因是尿苷酸合酶基因編碼精氨酸的405處密碼子是否發(fā)生無義突變來判斷，如果測序圖中該位點為單峰C，則為非尿苷酸合酶缺乏癥有害基因；該位點為雙峰，同時含有C和T，則為尿苷酸合酶缺乏癥有害基因。
10.根據(jù)權(quán)利8或9所述應(yīng)用，其特征在于，所述第一次PCR反應(yīng)的擴增體系中各組分的比例為模板:引物1:引物2: PCR反應(yīng)緩沖液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10: I: 73 ； 所述第二次PCR反應(yīng)的擴增體系中各組分的比例為模板:引物3:引物4: PCR反應(yīng)緩沖液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10:1: 73。
【文檔編號】C12N15/11GK103627804SQ201310617444
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】郭霄峰, 代元元, 吳曉薇 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)