刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用，該刺五加多糖優(yōu)選經脫脂、水提、醇沉、離子交換和透析工藝獲得，制備方法簡單穩(wěn)定高效，適合工業(yè)化生產。本發(fā)明中的刺五加多糖經哺乳動物細胞和秀麗線蟲疾病模型試驗證實，不僅能夠有效抑制神經毒性化合物的細胞毒性，緩解秀麗線蟲疾病模型中多聚谷氨酰胺異常聚集引起的神經毒性，還能顯著降低秀麗線蟲疾病模型體內活性氧自由基水平并延長秀麗線蟲在氧化脅迫下的存活率，表明其具有良好的神經保護作用。
【專利說明】刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于健康食品/保健食品【技術領域】，具體涉及刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用。
技術背景
[0002]衰老是一種不可避免的自然現象，容易引發(fā)心血管疾病、癌癥、神經系統(tǒng)疾病等多種疾病。其中，神經系統(tǒng)疾病發(fā)病原因是神經元進行性變性死亡導致神經系統(tǒng)受損，主要影響患者的認知和運動功能，致殘致死率極高。隨著全球人口老齡化程度的加劇，神經系統(tǒng)疾病已經成為嚴重危害人們生命健康和生活質量的重大腦疾病，給患者家庭和社會帶來極大的心理和經濟負擔。盡管對此類疾病治療藥物的開發(fā)投入日益增加，但目前尚無有效治療藥物，而且對其前期發(fā)生發(fā)展過程缺乏關注和預防，因此積極開發(fā)具有神經保護功效的健康食品/保健食品對防治神經系統(tǒng)疾病將具有重大社會意義。
[0003]大量研究表明，多種神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展都涉及到蛋白質的異常聚集及聚集毒性等脅迫因素，例如，亨廷頓舞蹈病的主要病理特征表現為細胞內由多聚谷氨酰胺(polyglutamine;polyQ)異常延伸引起的亨廷頓蛋白包涵體。這些蛋白質異常聚集形成的產物將誘發(fā)氧化、炎癥等多種脅迫反應，導致神經元損傷并產生神經功能衰退。因此，通過抑制疾病蛋白質異常聚集以及緩解由異聚蛋白引起的氧化等毒性脅迫損傷將是防治神經系統(tǒng)病癥的重要策略。
[0004]我國傳統(tǒng)中醫(yī)在衰老和衰老相關疾病方面積累了豐富的研究和臨床經驗，多種中草藥長期用于延緩衰老和神經保護等用途。例如，刺五加自古即被視為具有添精補髓及抗衰老作用的良藥。明朝李時珍《本草綱目》稱刺五加“以五葉交加者良，故名五加，又名五花。五加治風濕，壯筋骨，其功良深，寧得一把五加，不用金玉滿車”，又以“文章作酒，能成其味，以金買草，不言其貴”之說，對刺五加做了很高的贊譽?，F代研究表明，刺五加多糖是刺五加的主要藥效成分之一，具有抗氧化、抗輻射、免疫調節(jié)和抗腫瘤等多種生物學活性，在保健領域具有巨大的開發(fā)和應用潛力。然而這些研究大多集中在抗腫瘤和抗氧化方面，對刺五加多糖在神經保護和神經系統(tǒng)疾病領域中的研究和應用關注不足。因此，加強刺五加多糖在神經保護功效方面的研究不僅有利于拓寬其本身的應用范圍，還能為神經系統(tǒng)疾病的防治提供新的活性物質，并能推動多糖在醫(yī)藥保健領域的深入應用。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品(保健食品也稱為健康食品或功能食品)中的應用。
[0006]其中所述的神經保護功效是指對以蛋白質異常聚集、氧化脅迫和特定神經細胞衰退死亡為主要病理特征的神經系統(tǒng)疾病的防治作用。
[0007]本發(fā)明中所述的刺五加多糖優(yōu)選通過以下方法制備獲得:以刺五加為原料，經含脫脂、水提、醇沉、離子交換和透析等工序制備獲得刺五加多糖，制備獲得的刺五加多糖具有神經保護作用，能夠制備具有神經保護功效的保健食品。
[0008]本發(fā)明在刺五加多糖的制備過程中，各工序的具體參數如下:
[0009]脫脂時，采用乙醇為脫脂溶劑，刺五加和乙醇的質量體積比為l:2g/mL?l:20g/mL,脫脂溫度為50?90°C，時間為I?IOh ;水提時，刺五加和水的質量體積比為1: 2g/mL?l:20g/mL，提取溫度為50?100°C，水提取時間為I?10h，水提取后，獲得提取液；醇沉時，采用乙醇沉淀提取液，乙醇和提取液的體積比為3:1?5:1。
[0010]離子交換為陰離子交換，將醇沉物溶解后過陰離子交換柱，依次采用水和洗脫液進行洗脫，洗脫液過透析袋透析，透析液經濃縮和干燥處理，獲得刺五加多糖。
[0011]所述陰離子交換的材料優(yōu)選為纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠或樹脂；透析袋的截留分子量為1.0?5.0kD。
[0012]陰離子交換時，洗脫液優(yōu)選為醋酸鹽、磷酸鹽、巴比妥酸鹽、檸檬酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽或甘氨酸。
[0013]本發(fā)明中所述的刺五加優(yōu)選是指刺五加的藥用部位根或根皮。
[0014]本發(fā)明提供的刺五加多糖具有神經保護功效是指其能夠在細胞和整體動物水平上顯著抑制神經毒性化合物的細胞毒性，抑制秀麗線蟲疾病模型中多聚谷氨酰胺異常聚集引起的神經毒性，還能顯著降低秀麗線蟲疾病模型體內活性氧自由基水平并延長其在氧化脅迫下的存活率，從而可用于防治包括阿爾茨海默癥和亨廷頓舞蹈病等在內的以蛋白質異常聚集、氧化脅迫和特定神經細胞和組織逐漸衰退死亡為主要病理特征的神經系統(tǒng)疾病。
[0015]本發(fā)明提供的刺五加多糖用途還包括在制備具有神經保護功效的健康食品或保健食品中的應用。將上述刺五加多糖添加其它原料如乳清蛋白、輔料如麥芽糊精，可制備成為具有神經保護功效的健康食品或保健食品。
[0016]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0017](I)本發(fā)明制備的刺五加多糖制備工藝簡單完善，穩(wěn)定高效，適合工業(yè)化生產；
[0018](2)本發(fā)明制備的刺五加多糖經證明其在哺乳動物神經細胞和秀麗線蟲整體動物水平上對神經系統(tǒng)疾病相關的蛋白質異常聚集及其神經毒性、氧化脅迫損傷均有抑制作用，表明其可應用于具有神經保護功效的固液制劑健康食品或保健食品中，為神經系統(tǒng)疾病的防治和健康老齡化提供了新型方案，并能促進多糖產品的深入應用和中藥現代化發(fā)展。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]下面通過【具體實施方式】及藥效學研究結果對本發(fā)明作進一步說明。
[0020]圖1為實施例4中刺五加多糖分別抑制AP 42、3_硝基丙酸、L-谷氨酸和百草枯細胞毒性的數據表征圖，其中圖1A表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖緩解A0 42對人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y的細胞毒性，圖1B表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖緩解3-硝基丙酸對SH-SY5Y的細胞毒性，圖1C表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖緩解L-谷氨酸對SH-SY5Y的細胞毒性，圖1D表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖緩解百草枯對SH-SY5Y的細胞毒性，其中*表示p〈0.05 ；
[0021]圖2為實施例5中刺五加多糖抑制多聚谷氨酰胺在秀麗線蟲體內異常聚集毒性的數據表征和顯微示意圖，其中圖2A表征未經處理和經2mg/mL刺五加多糖處理的HA759秀麗線蟲ASH神經元的存活狀態(tài)，圖2B表征2mg/mL和4mg/mL刺五加多糖抑制多聚谷氨酰胺聚集對HA759秀麗線蟲ASH神經元的神經毒性，圖2C表征2mg/mL刺五加多糖改善多聚谷氨酰胺聚集毒性損傷的ASH神經元行為學功能，其中*表示p〈0.05 ；
[0022]圖3為實施例6中刺五加多糖降低秀麗線蟲多聚谷氨酰胺模型體內活性氧水平和提高該模型氧化脅迫存活率的數據表征圖，其中圖3A表征2mg/ml刺五加多糖降低HA759秀麗線蟲體內活性氧自由基水平，圖3B表征2mg/ml刺五加多糖提高HA759秀麗線蟲在百草枯氧化脅迫下的存活率。
【具體實施方式】
[0023]下面列舉一部分具體實施例對本發(fā)明進行說明，有必要在此指出的是以下具體實施例只用于對本發(fā)明作進一步說明，不代表對本發(fā)明保護范圍的限制。其他人根據本發(fā)明做出的一些非本質的修改和調整仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0024]實施例1
[0025]本實施例提供的一種刺五加多糖，其通過如下方法制備獲得:將刺五加根及根皮粉碎后按照料液比1:5 (g/mL)加入乙醇，60°C下加熱攪拌回流3h，減壓過濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比1:15 (g/mL)加水，在90°C下加熱攪拌提取8h。減壓濃縮后離心獲得澄清提取液，按照1:4體積比將4倍體積乙醇加入提取液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀并經過真空冷凍干燥。將沉淀物溶于水后過DEAE-sepharose葡聚糖凝膠陰離子交換柱，依次采用水和1.0mol/L氯化鈉溶液洗脫，收集1.0mol/L氯化鈉溶液的洗脫液，采用1.0kD透析袋進行透析，透析截流液經過減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得刺五加多糖。
[0026]實施例2
[0027]本實施例提供的一種刺五加多糖，其通過如下方法制備獲得:將刺五加根及根皮粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加入乙醇，70°C下加熱攪拌回流5h，減壓過濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比l:5(g/mL)加水，在80°C下加熱攪拌提取3h。減壓濃縮后離心獲得澄清提取液，按照1:4體積比將4倍體積乙醇加入提取液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀并經過真空冷凍干燥。將沉淀物溶于水后過DEAE-sephadex A_25纖維素陰離子交換柱，依次采用水和1.0mol/L氯化銨溶液洗脫，收集1.0mol/L氯化銨溶液的洗脫液，采用3.5kD透析袋進行透析，透析截流液經過減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得刺五加多糖。
[0028]實施例3
[0029]本實施例提供的一種刺五加多糖，其通過如下方法制備獲得:將刺五加根莖粉碎后按照料液比1:20 (g/mL)加入乙醇，80°C下加熱攪拌回流7h，減壓過濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在70°C下加熱攪拌提取6h。減壓濃縮后離心獲得澄清提取液，按照1:5體積比將5倍體積乙醇加入提取液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀并經過真空冷凍干燥。將沉淀物溶于水后過D900型陰離子交換樹脂，依次采用水和0.5mol/L醋酸鉀溶液洗脫，收集0.5mol/L醋酸鉀溶液的洗脫液，采用2.0kD透析袋進行透析，透析截流液經過減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得刺五加多糖。
[0030]實施例4
[0031]42 ( 3 -淀粉樣蛋白 42 片段，0-amyloid peptide42,A0 42)蛋白聚集、3-硝基丙酸、L-谷氨酸和百草枯分別是線粒體呼吸毒性、興奮性氨基酸毒性和氧化脅迫毒性的誘導劑，均能夠產生與多種神經系統(tǒng)疾病相關的神經毒性。抑制這些神經毒性化合物的細胞毒性無疑能夠有效改善神經衰退癥狀。將實施例1制得的刺五加多糖，按照l_4mg/mL濃度分別加入到以50 ii M AP42、7.5mM3-硝基丙酸、IOmM L-谷氨酸和0.8mM百草枯造模的人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y中。對照組采用造模處理，但用細胞培養(yǎng)基代替多糖溶液，空白組未用造模試劑和多糖處理。在37°C下孵育24h后，加入MTT溶液繼續(xù)孵育4h。孵育結束后吸棄上清，加入DMSO并振搖，在570nm處測定吸光值，細胞存活率為多糖組吸光值與對照組吸光值的比值。細胞活力值以mean±SD表示，采用T檢驗比較多糖組和對照組的差異性。
[0032]圖1A顯示，A P 42在50 ii M時能夠顯著降低SH-SY5Y細胞活力，刺五加多糖在4mg/ml濃度下能夠改善AP 42處理后的細胞存活率，相比于對照提高了 13.6%。
[0033]圖1B顯示，3-硝基丙酸在7.5mM時能夠顯著降低SH-SY5Y細胞活力，而刺五加多糖在l-4mg/ml濃度范圍內均能夠緩解3-硝基丙酸的神經毒性，當多糖濃度為2mg/ml時，其細胞存活率相比于對照組提高了 7.7%。
[0034]圖1C顯示，L-谷氨酸在IOmM時能夠顯著降低SH-SY5Y細胞活力，而刺五加多糖在l-4mg/ml濃度范圍內表現出抑制L-谷氨酸神經毒性的活性，當多糖濃度為4mg/ml時，其細胞存活率相比于對照組提高了 22.2%。
[0035]圖1D顯示，百草枯在0.8mM時能夠因氧化損傷顯著降低SH-SY5Y細胞活力，而刺五加多糖在l_4mg/ml濃度范圍內能夠抑制百草枯的神經毒性，當多糖濃度為2mg/ml時，其細胞存活率相比于對照組提高了 14.4%。
[0036]這些結果表明，刺五加多糖能夠在人神經細胞水平上抑制多種神經毒性化合物的神經毒性，表明其具有良好的體外神經保護作用。
[0037]實施例5
[0038]秀麗線蟲轉基因模型HA759是利用滲透壓相關基因osm-10促使polyQ (多聚谷氨酰胺，polyglutamine, polyQ)和GFP在其頭部ASH神經元中表達，polyQ聚集將產生顯著毒性，導致ASH神經元快速進行性衰亡(表現為熒光消失)。因此可以通過觀察ASH神經元的存活率來檢測藥物對PolyQ聚集介導的神經毒性的緩解作用。將實施例2制得的刺五加多糖，以l_4mg/mL濃度分別加入LI期的秀麗線蟲多聚谷氨酰胺模型HA759幼蟲中，對照組加入等體積的S Medium，置于15°C下培養(yǎng)3天。收集HA759秀麗線蟲，加入疊氮化鈉溶液使其麻痹，混勻后滴加在瓊脂糖墊上，在熒光顯微鏡下觀察每條秀麗線蟲ASH神經元的GFP熒光點。隨機統(tǒng)計?100條秀麗線蟲，統(tǒng)計出ASH神經元的存活率。ASH神經元存活百分率=ASH神經元存活的秀麗線蟲數目/ (ASH神經元存活的秀麗線蟲數目+ASH神經元死亡的秀麗線蟲數目)X 100%。存活率以mean土SEM表示，使用one-way ANOVA分析和Tukeypost-hoc test比較多糖組和對照組的差異性。
[0039]結果如圖2A所示，未經多糖處理的HA759秀麗線蟲的ASH神經元因polyQ聚集而衰亡(熒光消失)，加入刺五加多糖后ASH神經元依然存活(熒光存在)。圖2B顯示，對照組HA759秀麗線蟲ASH神經元在3天后的存活率為38.9%，而采用刺五加多糖處理后，ASH神經元的存活率明顯提高，當多糖濃度為2mg/ml和4mg/ml時，ASH神經元的存活率相比于對照組分別提高至58.1%和59.7%。該結果表明刺五加多糖能夠緩解polyQ異常聚集介導的神經毒性。
[0040]秀麗線蟲的ASH神經元控制其高滲回避行為能力，因此在受到引誘和高滲溶液阻攔時，ASH神經元未衰亡的HA759秀麗線蟲具有趨向引誘劑后回避高滲溶液的雙重行為特征；而ASH神經元死亡的HA759秀麗線蟲僅具有趨向弓I誘劑的趨化行為，喪失對高滲溶液的回避能力。將實施例2制得的刺五加多糖，以l_4mg/mL濃度分別加入LI期的HA759幼蟲中，對照組加入等體積的S Medium，置于15°C下培養(yǎng)3天。收集HA759線蟲，用PBS洗去培養(yǎng)液中的食物殘渣。以8M甘油(高滲厭惡回避試劑)、雙乙酰(引誘趨化試劑)、疊氮化鈉(麻醉劑)制備HA759秀麗線蟲的趨化回避平板，將處理后的秀麗線蟲置于平板上，在20°C中培養(yǎng)1.5h后取出統(tǒng)計秀麗線蟲的分布情況，從而計算秀麗線蟲對高滲溶液的回避率?；乇苈?avoidance index)計算公式如下:回避率=(回避區(qū)內秀麗線蟲數目/秀麗線蟲總數)X 100%,回避率以 mean土SD 表不，使用 one-way ANOVA 分析和 Tukey post-hoc test 比較多糖組和對照組的差異性。
[0041]結果如圖2C所示，未經多糖處理的對照組有54.5%的秀麗線蟲在甘油線附近折返回避，采用刺五加多糖處理后，當多糖濃度為2mg/ml時，HA759秀麗線蟲的回避率提高至69.8%，表明刺五加多糖對ASH神經元具有保護作用，與如圖2A和圖2B所示結論一致。
[0042]以上結果顯示，刺五加多糖能夠在神經元細胞和動物行為學水平上抑制polyQ異常聚集導致的神經毒性，表明其具有良好的體內神經保護作用。
[0043]實施例6
[0044]將實施例3制得的刺五加多糖，以2mg/mL濃度加入LI期的HA759秀麗線蟲幼蟲中，對照組加入等體積的S Medium，置于15°C下培養(yǎng)3天。收集HA759秀麗線蟲，加入含1%吐溫20的PBS，然后轉移至玻璃勻漿器中在冰上勻漿，收集勻漿再加入DCFH-DA探針溶液(活性氧自由基含量的指示劑)，在37°C下避光孵育，然后用熒光酶標儀檢測熒光值，激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為530nm。相對熒光強度以mean土 SEM表示，采用T檢驗比較多糖組和對照組的差異性。
[0045]結果如圖3A所示，對照組的DCF相對熒光值為47.8，采用2mg/ml刺五加多糖處理后，DCF相對熒光值下降至29.1，表明刺五加多糖能夠顯著降低HA759秀麗線蟲體內活性氧自由基水平，具有良好的體內抗氧化活性。
[0046]將實施例3制得的刺五加多糖，以2mg/mL濃度加入經5-FUDR處理的L4期HA759秀麗線蟲幼蟲中，同時以IOOmM百草枯進行氧化脅迫造模，對照組同樣處理，但以等體積的S Medium代替多糖溶液。置于20°C中培養(yǎng)，以加入多糖和百草枯的時間計為第0h，每隔12h統(tǒng)計秀麗線蟲的存活狀況，直至其全部死亡,統(tǒng)計過程中將身體僵直不動并對輕微震動無反應的秀麗線蟲判斷為死亡狀態(tài)。以每個處理組的秀麗線蟲樣本量80-100條為準，秀麗線蟲存活率用Kaplan-Meier法進行分析,并以log-rank test比較多糖組與對照組的差異性。
[0047]結果如圖3B所示，加入百草枯后將產生急性氧化脅迫而導致秀麗線蟲死亡，對照組的平均存活時間為62h，而采用2mg/ml刺五加多糖處理后，秀麗線蟲的平均存活時間顯著延長至71.4h，表明刺五加多糖能夠有效對抗百草枯的氧化脅迫，從而改善與神經系統(tǒng)病癥相關的氧化損傷。
[0048]經上述哺乳動物神經細胞和秀麗線蟲疾病模型試驗結果證實，刺五加多糖不僅能夠有效抑制多種神經毒性化合物的神經毒性(見實施例4)，緩解polyQ異常聚集誘導的神經毒性(見實施例5)，還能顯著降低疾病模型體內活性氧自由基水平并提高疾病模型在氧化脅迫環(huán)境下的存活率(見實施例6)。這些結果充分證明刺五加多糖具有良好的神經保護作用，可用于防治神經系統(tǒng)疾病。
[0049]實施例1
[0050]將實施例1制得的刺五加多糖，根據需要添加適量乳清蛋白、麥芽糊精制備成為具有神經保護功效的粉末狀態(tài)健康食品或保健食品，還可以添加其它常規(guī)輔料制成常規(guī)劑型。
[0051]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用。
2.根據權利要求1所述的刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用，其特征是:所述的神經保護功效是指對以蛋白質異常聚集、氧化脅迫和特定神經細胞衰退死亡為主要病理特征的神經系統(tǒng)疾病的防治作用。
3.根據權利要求1所述的刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用，其特征是所述的刺五加多糖通過以下方法制備獲得:以刺五加為原料，經含脫脂、水提、醇沉、離子交換和透析工序制備獲得，所述刺五加多糖具有良好的神經保護作用。
4.根據權利要求3所述的刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用，其特征是:脫脂時，采用乙醇為脫脂溶劑，刺五加和乙醇的質量體積比為1:2?20g/mL，脫脂溫度為50?90°C，時間為I?IOh ;水提時，刺五加和水的質量體積比為1:2?20g/mL，提取溫度為50?100°C，水提取時間為I?IOh ;醇沉時，采用乙醇沉淀提取液，乙醇和提取液的體積比為3?5:1。
5.根據權利要求3所述的刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用，其特征是:所述離子交換為陰離子交換，將醇沉物溶解后過陰離子交換柱，依次采用水和洗脫液進行洗脫，洗脫液過透析袋透析，透析液經濃縮和干燥處理，獲得刺五加多糖。
6.根據權利要求5所述的刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用，其特征是:所述陰離子交換的材料為纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠或樹脂。
7.根據權利要求5所述的刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用，其特征是:洗脫液為醋酸鹽、磷酸鹽、巴比妥酸鹽、檸檬酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽或甘氨酸。
8.根據權利要求5所述的刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用，其特征是:透析袋的截留分子量為1.0?5.0kD。
9.根據權利要求3所述的刺五加多糖在制備具有神經保護功效的保健食品中的應用，其特征是:所述刺五加是指刺五加的藥用部位根或根皮。
【文檔編號】A23L1/09GK103609937SQ201310574757
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權日:2013年11月18日
【發(fā)明者】胡明華, 李海峰, 梁明, 馬方勵, 馬忠華, 肖凌云, 張菊 申請人:無限極（中國）有限公司