摩氏摩根菌快速檢測試劑盒及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種摩氏摩根菌快速檢測試劑盒及應用，所述試劑盒包括凍存管和PCR反應管，所述凍存管包括凍存管A、凍存管B、凍存管C和凍存管D，所述凍存管A內裝有用于PCR反應的Taq?DNA聚合酶、10×buffer、dNTP?mixture和引物的混合制備的凍干粉，凍存管B裝有裂解液，凍存管C裝有陽性對照液，凍存管D裝有稀釋液；本發(fā)明試劑盒僅一步PCR便可準確、快速地鑒定摩氏摩根菌；與傳統(tǒng)分離鑒定方法相比，該方法操作簡便，省時省力，特異性與靈敏性好，靈敏性可達102CFU/mL，結果準確可靠并簡單易讀，適用于大通量的檢測操作。
【專利說明】摩氏摩根菌快速檢測試劑盒及應用
(-)【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及人獸魚共患病原菌的鑒別診斷，基于PCR方法，建立摩氏摩根菌的快速檢測技術，即摩氏摩根菌快速檢測試劑盒及檢測方法。
(二)【背景技術】
[0002]摩氏摩根菌(Morganella morganii)屬于腸桿菌科摩根菌屬，廣泛分布于土壤、污水、人和動物的腸道等。摩氏摩根菌為條件致病菌，主要感染呼吸道、尿道及傷口，引起人的膿毒癥、肺炎、中樞神經癥狀、心包炎、絨毛膜羊膜炎、腹膜炎等，甚至引起人的大范圍溶血而導致急性死亡，是重要的醫(yī)院繼發(fā)性感染致病菌。摩氏摩根菌還可感染多種養(yǎng)殖動物，如海貍鼠、袋鼠、豬、雞以及錦鯉、蛇、鱉、龜、黿等水生動物，引起皮膚潰爛、肌肉出血、肺淤血、肺膿腫、腎出血、炎癥等病變，并具有致死性。隨著摩氏摩根菌感染的不斷上升趨勢，給人類健康、養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展與公共衛(wèi)生均造成了巨大的威脅，摩氏摩根菌已成為一種重要的人獸魚共患病原菌，日益受到各有關方面的關注。因此。亟需建立可準確、快速鑒定該菌的方法。
[0003]目前，國內外對摩氏摩根菌的檢測技術研究較少，仍主要依賴于傳統(tǒng)分離鑒定方法(如生化反應等)，不僅操作繁瑣、費時、費力，而且存在靈敏度不高和試驗結果差異大等弊端。PCR技術因其具有特異與靈敏的特點，在病原檢測領域具有越來越重要的地位?；赑CR反應的摩氏摩根菌鑒定方法雖有少量探索，但離實際應用于大批量樣本的日常檢測仍有較大距離，迄今尚無可用的快速檢測方法。本發(fā)明將通過對引物的選擇、檢測條件的優(yōu)化，設計一種準確、靈敏、簡便、快速的多重PCR檢測試劑盒，以期填補上述的空白。
(三)
【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種準確、靈敏、簡便、快速的摩氏摩根菌檢測試劑盒及方法。
[0005]本發(fā)明采用的技術方案是:
[0006]本發(fā)明提供一種摩氏摩根菌快速檢測試劑盒，所述試劑盒包括凍存管和PCR反應管，所述凍存管包括凍存管A、凍存管B、凍存管C和凍存管D，所述凍存管A內裝有用于PCR反應的Taq DNA聚合酶、10Xbuffer、dNTP mixture和引物的混合液制備的凍干粉,凍存管B裝有裂解液，凍存管C裝有陽性對照液，凍存管D裝有稀釋液，所述稀釋液為高壓滅菌雙蒸水；所述引物序列為:
[0007]Ml-F:CTCGCACCATCAGATGAACCCATA
[0008]Ml-R:CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG。
[0009]進一步，所述凍存管A內凍干粉是將混合液先在_80°C超低溫冰箱預凍10h，再放入凍干機(干燥箱壓力0.03MPa)，溫度設為-40°C (升華干燥階段)持續(xù)凍干30h，除去90%以上水分；之后溫度升至25°C進行解析干燥2h (升溫速率為1.5°C /min)，使水分含量達到5% (質量濃度)以下，獲得凍干粉；所述每4.4 μ L混合液組成為:Taq DNA聚合酶0.3 μ L，10 Xbuffer2.5 μ L, dNTP mixture0.6 μ L,濃度均為 50 μ M 的引物 M1_F、M1_R 各 0.5 μ L，所述 dNTP mixture 由終濃度均為 IOmM 的 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 構成。[0010]進一步，所述裂解液終濃度組成為:體積濃度4%Triton-X100，5mg/mL NaN3, ImoI/L Tris, pH 值 8.0,溶劑為蒸懼水,配制方法:Triton-X1004mL, NaN3 (終濃度 5mg/mL)500mg,Tris (終濃度lmol/L) 12.114g,用IOM氫氧化鈉水溶液調pH至8.0,蒸懼水定容至lOOmL。
[0011]進一步，所述陽性對照液為摩氏摩根菌陽性對照液(溶劑是雙蒸水，pH是7)，所述陽性對照緩沖液為摩氏摩根菌參考株ATCC25830接種在BHI培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后，取菌液100°C煮沸滅活后離心棄去上清液，取沉淀用雙蒸水重懸，制成陽性對照液。
[0012]進一步，所述PCR反應管根據(jù)待檢樣品量定，通常試劑盒內所述PCR反應管為100 ~300 個。
[0013]進一步，優(yōu)選所述試劑盒有100個PCR反應管(滿足100次PCR反應的用量)，所述凍存管A內凍干粉的用量以凍干前混合液體積計為440 μ L，所述凍存管B內裝有ImL裂解液，所述凍存管C內裝有0.5mL陽性對照液，所述凍存管D內裝有ImL稀釋液(通常凍存管D內的稀釋液是一次性加入凍存管A，供100次PCR反應用)各個凍存管內裝樣量根據(jù)PCR反應管個數(shù)定，每次PCR反應需要25 μ L反應液,即凍存管D內稀釋液與凍存管A內凍干粉混懸制備的混懸液10 μ L、裂解液10 μ L、對照液或待檢樣品5 μ L，稀釋液與凍干粉凍干前的混合液體積比為25:11。
[0014]本發(fā)明還提供一種利用所述摩氏摩根菌快速檢測試劑盒檢測摩式摩根菌的方法，所述方法按如下步驟進行:
[0015](I)將凍存管D中稀釋液加至凍存管A中，重懸、混勻，獲得混懸液，存放于_20°C備用(PCR反應前先在室溫解凍);所述凍存管A內凍干粉用量以凍干前混合液體積計，所述凍存管D中稀釋液與混合液體積比25:11 ;
[0016](2)將凍存管B中的裂解液分別加入PCR反應管，分為對照PCR反應管和待檢PCR反應管，再將凍存管C中的陽性對照液加入對照PCR反應管，將待檢樣品加入待檢PCR反應管，混合均勻，然后將步驟(1)凍存管A中的混懸液加入各個PCR反應管，立即進行PCR擴增；所述待檢樣品為待檢菌株接種于BHI培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，取菌液100°C煮沸滅活后離心棄去上清液，取沉淀用高壓滅菌雙蒸水重懸，制成待檢樣品；所述凍存管B中裂解液與凍存管A中混懸液體積比為1:1，所述凍存管B中裂解液與凍存管C中陽性對照液體積比為2:1，所述凍存管B中裂解液與待檢樣品體積比為2:1 ;所述BHI培養(yǎng)基按BHI培養(yǎng)基標準配法，即3.7gBHI粉溶于IOOmL蒸餾水，高壓滅菌)；
[0017](3)將PCR反應管按以下反應條件在PCR儀上進行擴增:95°C預熱3min ;94°C變性lmin，62°C退火 45s，72。。延伸 50s, 30 個循環(huán);72°C保持 5min ；
[0018](4)將擴增后的產物在質量濃度1%瓊脂糖凝膠與0.5XTBE緩沖液中電泳，經Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)讀取數(shù)據(jù)并記錄；
[0019](5)結果判定:檢測后，待檢樣品與陽性對照液同時擴增出809bp條帶的為摩氏摩根菌陽性；陽性對照液出現(xiàn)條帶而待檢樣品無條帶的為摩氏摩根菌陰性；待檢樣品與陽性對照液均無條帶或待檢樣品出現(xiàn)條帶而陽性對照液無條帶的需重新檢測并判定。
[0020]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:
[0021]本發(fā)明提供一種摩氏摩根菌快速檢測試劑盒，該試劑盒僅一步PCR便可準確、快速地鑒定摩氏摩根菌；與傳統(tǒng)分離鑒定方法相比，該方法操作簡便，省時省力，特異性與靈敏性好，靈敏性可達102CFU /mL，結果準確可靠并簡單易讀，適用于大通量的檢測操作。(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為凝膠電泳圖，其中:
[0023]A中泳道M為2000bp DNA Ladder Marker,泳道I為摩氏摩根菌陽性對照品，泳道2為待檢樣品(陽性)。
[0024]B中泳道M為2000bp DNA Ladder Marker,泳道I為摩氏摩根菌陽性對照品，泳道2為待檢樣品(陰性)。
[0025]C中泳道M為2000bp DNA Ladder Marker,泳道I為摩氏摩根菌陽性對照品(未見條帶)，泳道2為待檢樣品(陰性)。
[0026]D中泳道M為2000bp DNA Ladder Marker,泳道I為摩氏摩根菌陽性對照品(未見條帶)，泳道2為待檢樣品(陽性)。
(五)【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0028]實施例1摩式摩根菌快速檢測試劑盒
[0029]一、試劑盒組成
[0030]A管為凍干粉，凍干 粉含量以凍干前混合液體積計，供100次PCR反應的混合液為440 μ L，將混合液先在-80°C超低溫冰箱預凍10h，再放入凍干機(干燥箱壓力0.03mPa)，溫度設為-40°C (升華干燥階段)持續(xù)凍干30h，除去90%以上水分，之后溫度升至25°C進行解析干燥2h(升溫速率為1.5°C /min),使水分含量達到5%以下，獲得凍干粉；每4.4 μ L混合液含有 Taq DNA polymerase (市購)0.3 μ L, IOXbuffer (市購)2.5 μ L, dNTP mixture(市購)0.6 μ L (由終濃度均為IOmM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP的構成)，濃度均為50 μ M的引物(上海英駿生物技術有限公司合成)Ml-F, Ml-R各0.5 μ L。保存于-20°C。
[0031]B管含有ImL溶液,為裂解液,配制方法:Triton-X1004mL, NaN3 (終濃度5mg/mL)500mg, Tris (終濃度lmol/L) 12.114g,用IOM氫氧化鈉水溶液調pH至8.0,蒸懼水定容至IOOmL,保存于-20 °C。
[0032]C管含有0.5mL溶液，為摩氏摩根菌陽性對照液，溶劑為水，pH為7，保存于_20°C。
[0033]D管含有ImL溶液，為稀釋液(即高壓滅菌雙蒸水)，保存于4°C。
[0034]所述引物序列為:
[0035]Ml-F:CTCGCACCATCAGATGAACCCATA
[0036]Ml-R CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG。
[0037]PCR 反應管 100 個。
[0038]二、加樣及檢測步驟說明
[0039](I)將凍存管D中ImL稀釋液加至凍存管A (凍存管A內混合液凍干前體積為440 μ L),重懸、混勻制成混懸液,存放于-20°c備用；
[0040](2)分別將凍存管B中的裂解液10 μ L加入PCR反應管(每管10 μ L裂解液)，分為對照PCR反應管和待檢PCR反應管，再將凍存管C中的陽性對照溶液5 μ L加入對照PCR反應管，將待檢樣品5 μ L加入待檢PCR反應管，混合均勻，將步驟(1)凍存管A中的混懸液10 μ L加入上述各個PCR反應管，立即進行PCR擴增；所述待檢樣品為待檢菌株接種于BHI培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，取菌液離心棄去上清液，取沉淀用高壓滅菌雙蒸水重懸，制成待檢樣品液；
[0041](3)將PCR反應管按以下反應條件在PCR儀(Life Technologies，Veriti)上進行擴增:95°C 3min ；94°C lmin,62°C 45s, 72°C 50s, 30 個循環(huán)；72°C 5min ；
[0042](4)將擴增后的產物在質量濃度1%瓊脂糖凝膠與0.5XTBE緩沖液中電泳，經Goldview染色(市購)后用凝膠成像系統(tǒng)(上海天能4500SF)讀取、分析結果。
[0043]實施例2摩式摩根菌快速檢測試劑盒的應用
[0044]下面通過試驗對本發(fā)明的使用效果進行論證和描述。
[0045]I材料與方法
[0046]1.1菌株及培養(yǎng)
[0047]以摩氏摩根菌ATCC25830 (購自美國典型微生物保藏中心(ATCC))為參考株，分離出的30株摩氏摩根菌(表1，編號是為了便于表述，編號本身沒有含義)經Vitek方法與16SrRNA序列分析進行菌種鑒定，由本實驗室保存。其他67種細菌(參考株購自ATCC菌株庫，分離株編號是為了便于表述，編號本身沒有含義)作為陰性對照菌，亦由本實驗室保存(詳見表 I)。各菌株接種于 5mL BHI (DIFCO)培養(yǎng)基(Oxoid, Hampshire, England), 37°C振蕩培養(yǎng)過夜，備用。
[0048]1.2PCR體系建立
[0049]1.2.1引物篩選`
[0050]采用比較基因組學方法，并參照相關文獻，對細菌16S rRNA基因區(qū)域內保守區(qū)和可變區(qū)進行比對分析，設計I對引物M1-F、M1-R。引物序列詳見表2。
[0051 ] 1.2.2PCR反應體系及條件
[0052]通過PCR體系及條件的優(yōu)化，確定多重PCR反應體系為:10XTaq Buffer(含Mg2+ ) 2.5 μ L, dNTP mixture0.6 μ L(由終濃度均為 IOmM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的構成)，終濃度均為50 μ M的引物Ml-F、Ml-R各0.5 μ L，Taq DNA polymerase0.3 μ L,陽性對照液5 μ L或待檢樣品5 μ L，裂解液10 μ L，加ddH20補足體積至25 μ L ;反應條件為:95°C 3min ；94°C lmin,62°C 45s, 72°C 50s，30 個循環(huán)；72°C 5min。產物在 I %瓊脂糖凝膠 0.5 X TBE 緩沖液中電泳，經Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。
[0053]1.2.3PCR產物測序鑒定
[0054]將PCR產物割膠回收，克隆到pMD18-T載體，轉化入DH5 α，提取質粒后鑒定，陽性克隆子送至上海英駿生物技術有限公司測序。序列經NCBI BLAST對比，以確證片段為目的條帶。
[0055]1.2.4特異性試驗
[0056]以其他67種細菌(表1)作為陰性對照，以雙蒸水作為空白對照，用建立的PCR方法進行擴增。
[0057]表1摩氏摩根菌及陰性對照菌株
【權利要求】
1.一種摩氏摩根菌快速檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括凍存管和PCR反應管，所述凍存管包括凍存管A、凍存管B、凍存管C和凍存管D，所述凍存管A內裝有用于PCR反應的Taq DNA聚合酶、10Xbuffer、dNTP mixture和引物的混合液制備的凍干粉,凍存管B裝有裂解液，凍存管C裝有陽性對照液，凍存管D裝有稀釋液，所述稀釋液為雙蒸水；所述引物序列為:
Ml-F:CTCGCACCATCAGATGAACCCATA
Ml-R:CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG。
2.如權利要求1所述摩氏摩根菌快速檢測試劑盒，其特征在于所述凍存管A內凍干粉是將混合液在_80°C預凍10h，再在-40°C凍干30h，然后以1.5°C /min的速率升溫至25°C干燥2h使水分含量達到5%以下，獲得凍干粉；所述每4.4 μ L混合液組成為:Taq DNA聚合酶 0.3 μ L，10 Xbuffer2.5 μ L, dNTP mixture0.6 μ L,濃度均為 50 μ M 的引物 M1_F、M1_R 各0.5 μ L，所述 dNTP mixture 由終濃度均為 IOmM 的 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 的構成。
3.如權利要求1所述摩氏摩根菌快速檢測試劑盒，其特征在于所述裂解液終濃度組成為:體積濃度 4%Triton_X100, 5mg/mL NaN3, lmol/L Tris, pH 值 8.0,溶劑為蒸懼水。
4.如權利要求1所述摩氏摩根菌快速檢測試劑盒，其特征在于所述陽性對照液為摩氏摩根菌陽性對照液。
5.如權利要求1所述摩氏摩根菌快速檢測試劑盒，其特征在于所述PCR反應管為100 ~300 個。
6.如權利要求1所述摩氏摩根菌快速檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒有100個PCR反應管，所述凍存管A內凍干粉的用量以凍干前混合液體積計為440 μ L，所述凍存管B內裝有ImL裂解液，所述凍存管C內裝有0.5mL陽性對照液，所述凍存管D內裝有ImL稀釋液。
7.一種利用權利要求1所述摩氏摩根菌快速檢測試劑盒檢測摩式摩根菌的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進行: (1)將凍存管D中稀釋液加至凍存管A中，重懸、混勻，獲得混懸液，存放于_20°C備用；所述凍存管A內凍干粉用量以凍干前混合液體積計，所述凍存管D中稀釋液與混合液體積比 25:11 ； (2)分別將凍存管B中的裂解液加入PCR反應管，分為對照PCR反應管和待測PCR反應管，再將凍存管C中的陽性對照液加入對照PCR反應管，將待檢樣品加入待測PCR反應管，混合均勻，然后將步驟(1)凍存管A中的混懸液加入各個PCR反應管，立即進行PCR擴增；所述待測樣品為待測菌株接種于BHI培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，取菌液100°C煮沸滅活后離心棄去上清液，取沉淀用雙蒸水重懸，制成待測樣品；所述凍存管B中裂解液與凍存管A中混懸液體積比為1:1，所述凍存管B中裂解液與凍存管C中陽性對照液體積比為2:1，所述凍存管B中裂解液與待測樣品體積比為2:1 ; (3)將PCR反應管按以下反應條件在PCR儀上進行擴增:95°C預熱3min ;94°C變性lmin，62°C退火45s，72°C延伸50s，30個循環(huán)；72°C保持5min ； (4)將擴增后的產物在質量濃度1%瓊脂糖凝膠與0.5 X TBE緩沖液中電泳，經Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)讀取數(shù)據(jù)并記錄； (5)結果判定:檢測后，待檢樣品與陽性對照液同時擴增出809bp條帶的為摩氏摩根菌陽性； 陽性對照液出現(xiàn)條帶而待檢樣品無條帶的為摩氏摩根菌陰性；待檢樣品與陽性對照液均無條帶或待檢樣品出現(xiàn)條帶而陽性對照液無條帶的需重新檢測并判定。
【文檔編號】C12R1/01GK103642903SQ201310571288
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權日:2013年11月13日
【發(fā)明者】陳健舜 申請人:浙江省水產技術推廣總站