一種防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑及用途
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑及用途。所述多糖復(fù)合劑是由50-90質(zhì)量%的低聚巖藻聚糖和10-50質(zhì)量%的PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成，所述PZ-1細(xì)菌胞外多糖為彭氏變形菌PZ-1發(fā)酵后，經(jīng)提取純化得到的細(xì)菌胞外多糖。低聚巖藻聚糖是從海帶粉中提取，水解，超濾膜分離后所得；將低聚巖藻聚糖和PZ-1細(xì)菌胞外多糖按照比例逐級(jí)混合法粗混，最后混合均勻得到本發(fā)明的多糖復(fù)合劑。本發(fā)明的多糖復(fù)合劑可減少抗生素藥物在豬飼養(yǎng)過程中的使用，為消費(fèi)者提供安全、綠色的豬肉產(chǎn)品，有效防治豬腹瀉。同時(shí)可作為治療豬腹瀉抗生素藥物的替代品。效果比單獨(dú)使用低聚巖藻聚糖或PZ-1細(xì)菌胞外多糖好，更優(yōu)于兩者的簡(jiǎn)單相加。
【專利說明】一種防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，涉及利用低聚巖藻聚糖和PZ-1細(xì)菌胞外多糖制備防治豬腹瀉藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腹瀉是豬的一種常見病和多發(fā)病。近年來豬腹瀉病的發(fā)病率不斷上升，特別是仔豬由于抵抗力差，發(fā)病率更高。據(jù)報(bào)道，2012年初豬腹瀉病大面積暴發(fā)，存欄200頭以下基礎(chǔ)母豬的中小豬場(chǎng)發(fā)病率達(dá)到20% -40% ;產(chǎn)后I周的母豬和仔豬腹瀉尤為嚴(yán)重，部分豬場(chǎng)仔豬死亡率高達(dá)100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了不可估量的損失。
[0003]導(dǎo)致豬腹瀉的主要原因是致病性細(xì)菌及病毒感染。例如，致病性大腸桿菌是導(dǎo)致仔豬黃痢和白痢的主要原因。另外，豬感染魏氏梭菌、豬痢疾桿菌、彎曲桿菌、副傷寒、內(nèi)勞森氏菌和密螺旋體等病菌后，在一定條件下都會(huì)引起腹瀉的發(fā)生。病毒性感染是導(dǎo)致豬腹瀉的另一主要原因，常見病毒傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒、輪狀病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、腺病毒和皰疹病毒等，這些病毒都導(dǎo)致豬腹瀉的發(fā)生。
·[0004]目前用于防治豬腹瀉的藥物主要是抗生素類藥物，飼養(yǎng)戶為了減少豬在飼養(yǎng)過程中的患病，常在飼料中添加過量的抗生素，使豬肉產(chǎn)品中抗生素殘留嚴(yán)重超標(biāo)，直接危害消費(fèi)者的健康安全。研究表明，某些特定結(jié)構(gòu)的多糖具有良好的抗病毒、抗菌等生理活性，而部分多糖的生物活性則主要以免疫調(diào)節(jié)功能為主，因此將某些具有良好抗病毒、抗菌活性的多糖與具有調(diào)節(jié)免疫功能的多糖組合來代替抗生素或作為抗生素增效劑，能有效減少抗生素藥物在防治豬腹瀉過程的使用，從而生產(chǎn)出安全、綠色的豬肉產(chǎn)品。
[0005]巖藻聚糖(Fucoidan)是存在于褐藻(例如海帶、馬尾藻等)細(xì)胞壁基質(zhì)中的一種水溶性硫酸多糖，含量高達(dá)2-3%，是海帶中的主要生物活性成分之一(Holdt & Kraan,2011)。研究發(fā)現(xiàn)，只有低分子量的硫酸多糖才具有良好的抗菌和抗病毒活性。郭凌等(2002)通過對(duì)麒麟菜硫酸多糖及其酸解產(chǎn)物的抑菌活性的研究發(fā)現(xiàn)，未水解的硫酸多糖無抑菌活性。在抗病毒活性方面，低分子巖藻聚糖的活性也明顯好于大分子巖藻聚糖(Schaeffer & Kryolv, 2000; Koyanagi et al., 2003; Pielesz et al., 2011),且5000-20000 Da分子量的低聚巖藻聚糖的抗病毒活性最高，估計(jì)這一分子量的多糖能夠折疊成為與病毒具有高度親和力的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使病毒失去感染活力。
[0006]多糖的免疫調(diào)節(jié)功能是其重要的生理活性。通過大量對(duì)多糖調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用機(jī)理的研究，發(fā)現(xiàn)多糖可以與淋巴細(xì)胞表面的受體CR3結(jié)合，通過影響胞內(nèi)Ca2+，cAMP，cGMP等信息分子的濃度而參與淋巴細(xì)胞的活化、增殖，促進(jìn)細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生。PZ-1胞外多糖是由彭氏變形桿菌表達(dá)產(chǎn)生的一種細(xì)菌胞外多糖，研究發(fā)現(xiàn)，PZ-1具有良好的免疫活性(Klink et al., 1999; Kondakova et al., 2004),可用于免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)和應(yīng)用。
[0007]因此開發(fā)一種多糖復(fù)合劑就顯得很必要。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的在于為防治豬腹瀉提供一種安全、綠色、高效、成本低廉的多糖復(fù)合齊U，減少抗生素藥物在豬飼養(yǎng)過程中的使用，從而為消費(fèi)者提供安全、綠色的豬肉產(chǎn)品。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑，其特征在于:是由50-90質(zhì)量％的低聚巖藻聚糖和10-50質(zhì)量％的PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成，所述PZ-1細(xì)菌胞外多糖為彭氏變形菌PZ-1發(fā)酵后，經(jīng)提取純化得到的細(xì)菌胞外多糖。將所述低聚巖藻聚糖不斷加入的同時(shí)也不斷加入所述PZ-1細(xì)菌胞外多糖得到多糖粗混料，粗混料再用攪拌機(jī)以800 r/min的攪拌速度混合20 min,使兩種多糖混合均勻即可。
[0010]優(yōu)選是由60-80質(zhì)量％的低聚巖藻聚糖和40-20質(zhì)量％的PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成；更優(yōu)選是由70-80質(zhì)量％的低聚巖藻聚糖和30-20質(zhì)量％的PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成。更優(yōu)選是由70質(zhì)量％的低聚巖藻聚糖和30質(zhì)量％的PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成。
[0011]所述低聚巖藻聚糖分子量為5000-20000 Da。
[0012]所述低聚巖藻聚糖的制備方法為提取:80目海帶粉按重量體積比1:25的比例加入去離子水，80 °C下提取3 h，提取過程中不斷攪拌，優(yōu)選攪拌速度為2000 r/min，離心，優(yōu)選3000 r/min, 10 min，取上清液，加入12 mol/L的HCl使之終濃度為0.1 mol/L ;然后離心，優(yōu)選3000 r/min, 5 min，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入無水乙醇使之終濃度為30體積％，過夜；離心，優(yōu)選5000 r/min, 10 min,取上清液，并加入無水乙醇，使之終濃度為60體積％,過夜；離心,優(yōu)選3000 r/min, 5 min,取沉淀物,真空干燥后得到巖藻聚糖干粉；
水解:將所述巖藻聚糖干粉與酶活力為50萬U/g的果膠酶按重量比1000:0.5的比例混合均勻，加入去離子水配成3%的糖溶液，加入HCl，優(yōu)選4.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至
3.8，水解3 h后繼續(xù)加入HC1，調(diào)節(jié)pH值至2.0，繼續(xù)水解3 h;再加入4 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)PH值至中性，終止水解反應(yīng)，得到不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液；` 分離:不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液經(jīng)過分子截留量為5000 Da和20000 Da的超濾膜分離，并收集5000-20000 Da的組分，噴霧干燥即可；優(yōu)選為將100 L含有不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液采用中型超濾膜分離裝置進(jìn)行不同分子量低聚巖藻聚糖的分離；蠕動(dòng)泵以50 L/h的流量輸送到分子截留量為20000 Da中空改性聚氯乙烯膜進(jìn)行分離，壓力0.06 MPa,當(dāng)多糖溶液體積濃縮至1/5時(shí)濃縮液補(bǔ)充去離子水到50 L，繼續(xù)濃縮，直到多糖溶液體積濃縮至1/5，停止超濾，收集分子截留量< 20000 Da的多糖溶液；將裝置的超濾膜換成分子截留量為5000 Da的中空改性聚氯乙烯超濾膜，將分子截留量< 20000Da的多糖溶液進(jìn)行超濾濃縮；蠕動(dòng)泵的輸送流量為50 L/h，分離壓力為0.08 MPa,當(dāng)多糖溶液體積濃縮至1/5時(shí)，停止?jié)饪s，并收集濃縮液，得到分子截留量為5000-20000 Da的低聚巖藻聚糖組分；該濃縮液經(jīng)噴霧干燥即可。
[0013]所述PZ-1細(xì)菌胞外多糖的制備方法為，將彭氏變形菌PZ-1接種于培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵過程中進(jìn)行攪拌，優(yōu)選攪拌速度為3000 r/min,發(fā)酵72 h后得發(fā)酵培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)基為蛋白胨0.5重量％，KH2PO40.2重量％，MgSO40.02重量％，MnSO40.02重量％，F(xiàn)eSO4.7Η200.005重量％，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0;
將發(fā)酵培養(yǎng)液冷卻后離心，優(yōu)選離心條件為8000 r/min, 10 min，去彭氏變形菌PZ-1菌體，取上清液；
將離心去菌體后的上清液加入無水乙醇，使之終濃度為70體積％，靜置24 h，取沉淀液；
將沉淀液離心，優(yōu)選離心條件為3000 r/min, 10 min，取沉淀物，經(jīng)真空干燥后得粗多糖干粉；
將粗多糖溶解于去離子水中，配成2重量％的糖溶液，然后用分子截留量為50000 Da的超濾膜純化，收集分子截留量大于50000 Da的組分，經(jīng)噴霧干燥即可。
[0014]本發(fā)明還保護(hù)所述防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟，低聚巖藻聚糖制備:
提取:80目海帶粉按重量體積比1:25的比例加入去離子水，80 °C下提取3h，提取過程中不斷攪拌，優(yōu)選攪拌速度為2000 r/min,離心,優(yōu)選3000 r/min, 10 min,取上清液,力口Λ 12 mol/L HCl使之終濃度為0.1 mol/L ;然后離心,優(yōu)選3000 r/min, 5 min,去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入無水乙醇使之終濃度為30體積％，過夜；離心，優(yōu)選5000 r/min,10 min，取上清液，并加入無水乙醇，使之終濃度為60體積％，過夜；離心，優(yōu)選3000 r/min,5 min，取沉淀物，真空干燥后得到巖藻聚糖干粉。
[0015]水解:將巖藻聚糖干粉與酶活力為50萬U/g的果膠酶按重量比為1000:0.5的比例混合均勻，加入去離子水配成3重量％的糖溶液，加入4.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至3.8，水解3 h后繼續(xù)加入HCl，調(diào)節(jié)pH值至2.0，繼續(xù)水解3 h;再加入4 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)PH值至中性，終止水解反應(yīng)，得到不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液。
[0016]分離:不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液經(jīng)過分子截留量為5000 Da和20000Da的超濾膜分離，并收集5000-20000 Da的組分，噴霧干燥即可；優(yōu)選將100 L含有不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液采用中型超濾膜分離裝置進(jìn)行不同分子量低聚巖藻聚糖的分離；蠕動(dòng)泵以50 L/h的流量輸送到分子截留量為20000 Da中空改性聚氯乙烯膜進(jìn)行分離，壓力0.06 MPa,當(dāng)多糖溶液體積濃縮至1/5時(shí)濃縮液補(bǔ)充去離子水到50 L，繼續(xù)濃縮，直到多糖溶液體積濃縮至1/5，停止超濾，收集分子截留量< 20000 Da的多糖溶液；將裝置的超濾膜換成分子截留量為5000 Da的中空改性聚氯乙烯超濾膜，將分子截留量< 20000Da的多糖溶液進(jìn)行超濾濃縮；蠕動(dòng)泵的輸送流量為50 L/h，分離壓力為0.08 MPa,當(dāng)多糖溶液體積濃縮至1/5時(shí)，停止?jié)饪s，并收集濃縮液，得到分子截留量為5000-20000 Da的低聚巖藻聚糖組分；該濃縮液經(jīng)噴霧干燥后得到低聚巖藻聚糖干燥粉狀物。
[0017]PZ-1細(xì)菌胞外多糖制備:
配制培養(yǎng)基:按質(zhì)量百分比，培養(yǎng)基的配方如下:蛋白胨為0.5重量％，KH2PO4為0.2重量％，MgSO4為0.02重量％，MnSO4為0.02重量％，F(xiàn)eSO4.7H20為0.005重量％，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0，得培養(yǎng)基；
將彭氏變形菌PZ-1接種于培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵過程中進(jìn)行攪拌，攪拌速度為3000 r/min,發(fā)酵72 h后得發(fā)酵培養(yǎng)液；
將發(fā)酵培養(yǎng)液冷卻后離心，優(yōu)選8000 r/min, 10 min，去彭氏變形菌PZ-1菌體，取上清液；
將離心去菌體后的上清液加入乙醇，使之終濃度為70體積％，靜置24 h，取沉淀液；將沉淀液離心，優(yōu)選3000 r/min, 10 min,取沉淀物,經(jīng)真空干燥后得粗多糖干粉；將粗多糖干粉溶解于去離子水中，配成2重量％的糖溶液，然后用分子截留量為50000Da的超濾膜純化，收集分子截留量> 50000 Da的組分，經(jīng)噴霧干燥即得PZ-1細(xì)菌胞外多糖干燥粉狀物。
[0018]多糖復(fù)合劑的制備:將所述低聚巖藻聚糖干燥粉狀物和PZ-1細(xì)菌胞外多糖干燥粉狀物按照上述比例進(jìn)行配比，將所述低聚巖藻聚糖不斷加入的同時(shí)也不斷加入所述PZ-1細(xì)菌胞外多糖得到多糖粗混料，粗混料再用攪拌機(jī)以800 r/min的攪拌速度混合20 min,使兩種多糖混合均勻即可。
[0019]本發(fā)明還保護(hù)所述多糖復(fù)合劑用于防治豬腹瀉的用途。
[0020]本發(fā)明還保護(hù)所述多糖復(fù)合劑用于豬飼料添加劑的用途。
[0021]所述彭氏變形菌PZ-1胞外多糖的單糖組成特征為:該多糖以甘露糖、阿拉伯糖和葡萄糖為主，以及少量的肌醇、鼠李糖、木糖和半乳糖，各單糖的組成比例依次為37.2%、26.5%、15.9%、7.4%、5.5%、4.5%和3.0%。所述PZ-1胞外多糖單糖組成采用糖醇乙酸酯衍生-氣相色譜法進(jìn)行定性與定量分析，結(jié)果見附圖1。其中I為鼠李糖，2為阿拉伯糖，3為木糖，4為肌醇，5為甘露糖，6為葡萄糖，7為半乳糖。
[0022]鑒于豬腹瀉與細(xì)菌、病毒性感染密切相關(guān)，并且豬免疫下降是細(xì)菌、病毒易感性的主要原因，因此將具有抗菌、抗病毒活性的低聚巖藻聚糖與具有調(diào)節(jié)免疫活性的PZ-1細(xì)菌胞外多糖制備成復(fù)合劑，能有效防治豬腹瀉，達(dá)到標(biāo)本兼治。
[0023]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，能有效防治豬腹瀉，達(dá)到標(biāo)本兼治。該復(fù)合劑是一種安全、綠色、高效的產(chǎn)品，可作為治療豬腹瀉抗生素藥物的替代品。同時(shí)其效果比單獨(dú)使用低聚巖藻聚糖和PZ-1細(xì)菌胞外多糖均好，也優(yōu)于兩者的簡(jiǎn)單相加。
[0024]通過實(shí)施例可知，單獨(dú)使用低聚巖藻聚糖和PZ-1細(xì)菌胞外多糖對(duì)改善仔豬腹瀉狀況都有一定的作用，有效率分別達(dá)到了 43.8%和25.0%，但效果都并不理想。且單獨(dú)使用上述2種多糖，都出現(xiàn)了仔豬死亡的情況，PZ-1細(xì)菌胞外多糖組仔豬的死亡率高達(dá)18.8%。將低聚巖藻聚糖和PZ-1細(xì)菌胞外多糖制備成復(fù)合劑使用，實(shí)驗(yàn)分別對(duì)比了實(shí)施例1 (50%低聚巖藻聚糖+50%PZ-1細(xì) 菌胞外多糖)、實(shí)施例2 (60%低聚巖藻聚糖+40%PZ-1細(xì)菌胞外多糖)、實(shí)施例3 (70%低聚巖藻聚糖+30%PZ-1細(xì)菌胞外多糖)、實(shí)施例4 (80%低聚巖藻聚糖+20%PZ-1細(xì)菌胞外多糖)和實(shí)施例5 (90%低聚巖藻聚糖+10%PZ-1細(xì)菌胞外多糖)所制備的復(fù)合劑在改善豬仔腹瀉方面的治療效果，所采用的5種組合都能有效避免仔豬的死亡，但在改善仔豬腹瀉的效果方面差異較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在將復(fù)合劑中低聚巖藻聚糖的比例從50%提高到70%時(shí)，治療仔豬腹瀉的有效率從68.8%提高到了 87.5%，接近藥物組的93.8%，且無死亡現(xiàn)象出現(xiàn)；然而，進(jìn)一步將復(fù)合劑中低聚巖藻聚糖的比例分別提高到80%和90%時(shí)，治療仔豬腹瀉的有效率反而分別降到了 68.8%和56.3%。這說明，實(shí)施例3中低聚巖藻聚糖和PZ-1細(xì)菌胞外多糖的比例較為合適，在此比例下，低聚巖藻聚糖的抗菌、抗病毒活性與PZ-1細(xì)菌胞外多糖的調(diào)節(jié)免疫活性產(chǎn)生了協(xié)同增效的功能，從而對(duì)治療仔豬腹瀉產(chǎn)生了較好的效果。因此，由低聚巖藻聚糖與PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成的多糖復(fù)合劑可作為防治豬腹瀉的藥物使用，且實(shí)施例3所制備的低聚巖藻聚糖和PZ-1細(xì)菌胞外多糖復(fù)合劑效果最佳。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明所涉及的PZ-1細(xì)菌胞外多糖的單糖組成氣相色譜圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0026]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0027]表I各實(shí)施例的用量成分
【權(quán)利要求】
1.一種防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑，其特征在于:是由50-90質(zhì)量％的低聚巖藻聚糖和10-50質(zhì)量％的PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成，所述PZ-1細(xì)菌胞外多糖為彭氏變形菌PZ-1發(fā)酵后，經(jīng)提取純化得到的細(xì)菌胞外多糖；優(yōu)選是由60-80質(zhì)量％的低聚巖藻聚糖和40-20質(zhì)量％的PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成；更優(yōu)選是由70-80質(zhì)量％的低聚巖藻聚糖和30-20質(zhì)量％的PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成。
2.權(quán)利要求1所述防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑，其特征在于:是由70質(zhì)量％的低聚巖藻聚糖和30質(zhì)量％的PZ-1細(xì)菌胞外多糖組成。
3.權(quán)利要求1所述防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑，其特征在于:所述低聚巖藻聚糖分子量為 5000-20000 Da。
4.權(quán)利要求1-3任一所述防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑，其特征在于:所述低聚巖藻聚糖的制備方法為提取:80目海帶粉按重量體積比1:25的比例加入去離子水，80 °C下提取3h,提取過程中不斷攪拌,優(yōu)選攪拌速度為2000 r/min,離心,優(yōu)選3000 r/min, 10 min,取上清液，加入12 mo I/L的HCl使之終濃度為0.1 mo I/L ;然后離心，優(yōu)選3000 r/min, 5min，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入無水乙醇使之終濃度為30體積％，過夜；離心，優(yōu)選5000 r/min, 10 min，取上清液，并加入無水乙醇，使之終濃度為60體積％，過夜；離心，優(yōu)選3000 r/min, 5 min,取沉淀物,真空干燥后得到巖藻聚糖干粉； 水解:將所述巖藻聚糖干粉與酶活力為50萬U/g的果膠酶按重量比1000:0.5的比例混合均勻，加入去離子水配成3%的糖溶液，加入HCl，優(yōu)選4.0 mo I/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至3.8，水解3 h后繼續(xù)加入HCl，調(diào)節(jié)pH值至2.0，繼續(xù)水解3 h;再加入4 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)PH值至中性，終止水解反應(yīng)，得到不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液； 分離:不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液經(jīng)過分子截留量為5000 Da和20000 Da的超濾膜分離，并收集5000-20000 Da的組分，噴霧干燥即可；優(yōu)選為將100 L含有不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液采用中`型超濾膜分離裝置進(jìn)行不同分子量低聚巖藻聚糖的分離；蠕動(dòng)泵以50 L/h的流量輸送到分子截留量為20000 Da中空改性聚氯乙烯膜進(jìn)行分離，壓力0.06 MPa,當(dāng)多糖溶液體積濃縮至1/5時(shí)濃縮液補(bǔ)充去離子水到50 L，繼續(xù)濃縮，直到多糖溶液體積濃縮至1/5，停止超濾，收集分子截留量< 20000 Da的多糖溶液；將裝置的超濾膜換成分子截留量為5000 Da的中空改性聚氯乙烯超濾膜，將分子截留量< 20000Da的多糖溶液進(jìn)行超濾濃縮；蠕動(dòng)泵的輸送流量為50 L/h，分離壓力為0.08 MPa,當(dāng)多糖溶液體積濃縮至1/5時(shí)，停止?jié)饪s，并收集濃縮液，得到分子截留量為5000-20000 Da的低聚巖藻聚糖組分；該濃縮液經(jīng)噴霧干燥即可。
5.權(quán)利要求1-3任一所述防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑，其特征在于:所述PZ-1細(xì)菌胞外多糖的制備方法為，將彭氏變形菌PZ-1接種于培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵過程中進(jìn)行攪拌，優(yōu)選攪拌速度為3000 r/min,發(fā)酵72 h后得發(fā)酵培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)基為蛋白胨 0.5 重量 ％，KH2PO40.2 重量 ％，MgSO40.02 重量 ％，MnSO40.02 重量 ％，F(xiàn)eSO4.7Η200.005重量％，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0; 將發(fā)酵培養(yǎng)液冷卻后離心，優(yōu)選離心條件為8000 r/min, 10 min，去彭氏變形菌PZ-1菌體，取上清液； 將離心去菌體后的上清液加入無水乙醇，使之終濃度為70體積％，靜置24 h，取沉淀液；將沉淀液離心，優(yōu)選離心條件為3000 r/min, 10 min，取沉淀物，經(jīng)真空干燥后得粗多糖干粉； 將粗多糖溶解于去離子水中，配成2重量％的糖溶液，然后用分子截留量為50000 Da的超濾膜純化，收集分子截留量大于50000 Da的組分，經(jīng)噴霧干燥即可。
6.權(quán)利要求1所述防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑，其特征在于:將所述低聚巖藻聚糖不斷加入的同時(shí)也不斷加入所述PZ-1細(xì)菌胞外多糖得到多糖粗混料，粗混料再用攪拌機(jī)以800r/min的攪拌速度混合20 min,使兩種多糖混合均勻即可。
7.權(quán)利要求1所述防治豬腹瀉的多糖復(fù)合劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟，低聚巖操聚糖制備: 提取:80目海帶粉按重量體積比1:25的比例加入去離子水，80 °C下提取3h，提取過程中不斷攪拌，優(yōu)選攪拌速度為2000 r/min,離心,優(yōu)選3000 r/min, 10 min,取上清液,加Λ 12 mol/L HCl使之終濃度為0.1 mol/L ;然后離心,優(yōu)選3000 r/min, 5 min,去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入無水乙醇使之終濃度為30體積％，過夜；離心，優(yōu)選5000 r/min,`10 min，取上清液，并加入無水乙醇，使之終濃度為60體積％，過夜；離心，優(yōu)選3000 r/min,`5 min，取沉淀物，真空干燥后得到巖藻聚糖干粉； 水解:將巖藻聚糖干粉與酶活力為50萬U/g的果膠酶按重量比為1000:0.5的比例混合均勻，加入去離子水配成3重量％的糖溶液，加入4.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至3.8，水解`3h后繼續(xù)加入HCl，調(diào)節(jié)pH值至2.0,繼續(xù)水解3 h ;再加入4 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)PH值至中性，終止水解反應(yīng)，得到不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液； 分離:不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液經(jīng)過分子截留量為5000 Da和20000 Da的超濾膜分離，并收集5000-20000 Da的組分，噴霧干燥即可；優(yōu)選將100 L含有不同分子片段的低聚巖藻聚糖水溶液采用中型超濾膜分離裝置進(jìn)行不同分子量低聚巖藻聚糖的分離；蠕動(dòng)泵以50 L/h的流量輸送到分子截留量為20000 Da中空改性聚氯乙烯膜進(jìn)行分離，壓力0.06 MPa,當(dāng)多糖溶液體積濃縮至1/5時(shí)濃縮液補(bǔ)充去離子水到50 L，繼續(xù)濃縮，直到多糖溶液體積濃縮至1/5，停止超濾，收集分子截留量< 20000 Da的多糖溶液；將裝置的超濾膜換成分子截留量為5000 Da的中空改性聚氯乙烯超濾膜，將分子截留量< 20000 Da的多糖溶液進(jìn)行超濾濃縮；蠕動(dòng)泵的輸送流量為50 1711，分離壓力為0.08 MPa，當(dāng)多糖溶液體積濃縮至1/5時(shí)，停止?jié)饪s，并收集濃縮液，得到分子截留量為5000-20000 Da的低聚巖藻聚糖組分；該濃縮液經(jīng)噴霧干燥后得到低聚巖藻聚糖干燥粉狀物； PZ-1細(xì)菌胞外多糖制備: 配制培養(yǎng)基:按質(zhì)量百分比，培養(yǎng)基的配方如下:蛋白胨為0.5重量％，KH2PO4為0.2重量％，MgSO4為0.02重量％，MnSO4為0.02重量％，F(xiàn)eSO4.7H20為0.005重量％，配好后用`4.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0，得培養(yǎng)基； 將彭氏變形菌PZ-1接種于培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵過程中進(jìn)行攪拌，攪拌速度為3000 r/min,發(fā)酵72 h后得發(fā)酵培養(yǎng)液； 將發(fā)酵培養(yǎng)液冷卻后離心，優(yōu)選8000 r/min, 10 min，去彭氏變形菌PZ-1菌體，取上清液； 將離心去菌體后的上清液加入乙醇，使之終濃度為70體積％，靜置24 h，取沉淀液； 將沉淀液離心，優(yōu)選3000 r/min, 10 min,取沉淀物,經(jīng)真空干燥后得粗多糖干粉；將粗多糖干粉溶解于去離子水中，配成2重量％的糖溶液，然后用分子截留量為50000Da的超濾膜純化，收集分子截留量> 50000 Da的組分，經(jīng)噴霧干燥即得PZ-1細(xì)菌胞外多糖干燥粉狀物； 多糖復(fù)合劑的制備:將所述低聚巖藻聚糖干燥粉狀物和PZ-1細(xì)菌胞外多糖干燥粉狀物按照上述比例進(jìn)行配比，將所述低聚巖藻聚糖不斷加入的同時(shí)也不斷加入所述PZ-1細(xì)菌胞外多糖得到多糖粗混料，粗混料再用攪拌機(jī)以800 r/min的攪拌速度混合20 min，使兩種多糖混合均勻即可。
8.權(quán)利要求1或權(quán)利要求7制備方法所得的多糖復(fù)合劑用于防治豬腹瀉的用途。
9.權(quán)利要求1或權(quán)利.要求7制備方法所得的多糖復(fù)合劑用于豬飼料添加劑的用途。
【文檔編號(hào)】C12P19/14GK103432158SQ201310376633
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】劉翼翔, 吳永沛, 謝荔朋 申請(qǐng)人:集美大學(xué)