利用原生質體轉化構建黑根霉cpr基因工程菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用原生質體轉化技術對黑根霉（Rhizopus?nigericans）進行外源基因的遺傳轉化方法：利用真菌細胞壁降解酶對黑根霉（Rhizopus?nigericans）的細胞壁進行處理，得到原生質體并進行純化，以潮霉素B作為選擇標記，首次將來自米根霉NADPH-細胞色素P450還原酶CYPOR（縮寫：CPR基因）基因采用原生質體轉化方法導入黑根霉中，獲得工程菌。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：可以用于黑根霉的分子生物學研究，如研究該菌P450酶系基因對甾體化合物羥化作用的分子機制等；可以用來對黑根霉實施基因工程從而進行遺傳改良育種，提高黑根霉對甾體底物羥化轉化率。
【專利說明】利用原生質體轉化構建黑根霉CPR基因工程菌的方法
(-)【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用原生質體轉化構建黑根霉CPR基因工程菌的方法。
(二)【背景技術】
[0002]黑根霉(Rhizopus nigricans)對留體具有Cll α -羥基化反應能力。羥基化生物轉化反應通常是Ρ450酶系介導的，細胞色素Ρ450氧化還原酶(NADPH-cytochromeP450reductase, CPR，E.C.1.6.2.4)能將電子從NADPH傳遞到細胞色素P450、細胞色素C、細胞色素b5以及血紅素氧化酶等血紅素蛋白。
[0003]目前，改進生物轉化體系的方法大體可歸納為三類:增加底物溶解性，解除底物(產物)抑制，改變細胞膜(細胞壁)通透性，已遇到一程度上的瓶頸。隨著分子技術水平的發(fā)展，將P450單加氧酶(CYP)和P450還原酶(CPR)基因在酵母或大腸桿菌等模式菌株中進行克隆表達，在轉錄水平調控、酶活分析、藥物代謝等方面不斷邁向新的領域。但關于構建黑根霉CPR基因工程菌并應用于留體羥化轉化上的應用未見報道。
[0004]自 1973年首先在粗糙脈胞菌建立DNA轉化系統(tǒng)，1983年建立構巢曲霉DNA轉化系統(tǒng)以來，迄今已在30多種絲狀真菌中建立了 DNA轉化系統(tǒng)。絲狀真菌遺傳轉化方法包括電擊轉化法、基因槍轉化法、農桿菌介導轉化法、原生質體轉化法、醋酸鋰轉化法等。并已成功應用于赤霉菌、毛霉、綠色木霉等絲狀真菌中。但尚未有采用原生質體轉化法應用于黑根霉的報道。
(三)
【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一種利用PEG-CaCl2介導原生質體轉化技術構建黑根霉CPR基因工程菌的遺傳轉化方法，并找到轉化效率高的轉化參數(shù)組合，可用于黑根霉工程菌育種以及分子生物學研究等領域，并為其他絲狀真菌遺傳轉化提供借鑒。
[0006]本發(fā)明采用的技術方案是:
[0007]—種利用原生質體轉化構建黑根霉CPR基因工程菌的方法，所述方法包括:
[0008](I)從米根霉克隆得到其CPR基因，克隆至質粒pCB1004_pgpd，得
[0009]到表達質粒pCB1004-pgpd_CPR ；
[0010]具體步驟如下:根據NCBI數(shù)據庫上所報道的米根霉CPR基因序列設計引物，并根據pCB1004-pgpd質粒上的MCS序列選出適合的酶切位點，然后提取米根霉總RNA，利用RT-PCR擴增得到CPR目的基因片段；經過T-A克隆，得到重組子經測序正確后，用限制性內切酶酶切得到目的片段并將其克隆至pCB1004-pgpd上MCS上相應的酶切位點，轉化至大腸桿菌得到重組子并測序；測序正確后，從大腸桿菌中提取pCB1004-pgpd-CPR質粒，備用。
[0011]目前真菌絕大多數(shù)用潮霉素篩選，所述的pCB1004-pgpd質粒上的潮霉素(hygromycin)抗性基因(hph)由 Aspergillus nidulans 的 ptrpC 啟動子調控,MCS 序列上游由強啟動子pgpd A調控；
[0012](2)將黑根霉孢子原生質體用lmol/L的山梨醇溶液懸浮，調節(jié)原生[0013]質體濃度為IO7~IO8個/mL，得到原生質體溶液；所述山梨醇溶液組成如下:lmol/L山梨醇，10mmol/L Tris-Cl，CaCl250mmol/L，溶劑為水，pH7.0 ;所述米根霉和黑根霉采用常規(guī)市購菌株即可；
[0014](3)將構建的表達質粒pCB1004-pgpd_CPR經限制性內切酶酶切，酶切產物純化后溶于無菌去離子水至濃度為10~15 μ g/mL，得到線性化質粒溶液；
[0015](4)每100 μ L原生質體溶液加入10 μ L線性化質粒溶液，并加入I~2μ L步驟(3)所述限制性內切酶，混勻，冰浴30min后，加入20~50 μ L的PEG4000_CaCl2溶液，冰浴10~20min ;再加入400~800 μ L的PEG4000_CaCl2溶液，室溫靜置10~15min ；所述 PEG4000-CaCl2 溶液終濃度組成如下:PEG400060%，CaCl250mmol/L, lmol/L 山梨醇，Tris-Cl 10mmol/L, ρΗ7.0，溶劑為水；
[0016](5)步驟(4)轉化液轉移至IOmL MYG液體再生培養(yǎng)基，28°C、80rpm，培養(yǎng)12h后，離心，用無菌去離子水洗滌， 獲得菌懸液涂布于含有150 μ g/mL潮霉素B的MYG固體平板，28°C培養(yǎng)；
[0017](6)待固體平板上長出菌絲后，轉接到含有150 μ g/mL潮霉素B的MYG固體平板上；轉化子在潮霉素B濃度200 μ g/mL的MYG固體平板上繼代培養(yǎng)，提取轉化子基因組，進行PCR確定目的基因片段是否整合到黑根霉基因組中，鑒定正確后保存。
[0018]所述MYG液體再生培養(yǎng)基組成如下:麥芽糖5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L溶劑為水；所述MYG固體平板組成如下:麥芽糖5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂15g/L，溶劑為水。
[0019]用于潮霉素B對黑根霉最小抑制濃度測試方法如下:
[0020]將潮霉素B溶液(50mg/mL)加入MYG液體培養(yǎng)基，使終濃度分別為50，100，150，200，250 μ g/mL,并倒平板。取長有黑根霉菌絲的瓊脂塊接種于抗性平板上，于30°C恒溫培養(yǎng)，觀察其生長情況，確定潮霉素B的最低抑制濃度。所述MYG液體培養(yǎng)基終濃度為:麥芽糖5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，溶劑為水；
[0021]所述黑根霉孢子原生質體溶液可按如下方法制得:
[0022](I)收集黑根霉菌絲，用無菌去離子水洗滌2次后，再用酶解液洗滌2次，得濕菌體；所述酶解液組成如下:0.5mol/L MgSO4, 50mmol/L DL-Maleate aicd (CP),溶劑為水；
[0023](2)每Iml細胞壁降解酶液加入0.5~1.0g濕菌體，置30°C水浴鍋，每20min輕輕搖勻，酶解游離原生質體3~4h，得到原生質體酶解液；細胞壁降解酶液按如下組成配制:Iywallzyme (廣東微生物研究所)和Yatalase (Takara)質量比為5:7的混合酶溶解于無菌的 0.5mol/L MgS04、50mmol/L DL-Maleate aicd 溶液中，制成終濃度為 50mg/mL 的細胞壁降解酶液；
[0024](3)將原生質體酶解液用lmol/L山梨醇溶液稀釋，過濾除去菌絲殘片，5000r/min離心lOmin，得原生質體沉淀，用lmol/L山梨醇溶液懸浮，調節(jié)原生質體濃度為IO7~IO8個/mL，得原生質體溶液。
[0025]本發(fā)明中，所述CPR基因序列如下:
[0026]ATGACTCGAAACAACTCTCATCATCTGCTTGACACAGTCGATTTGATACTGCTAGGTACCATTGGCCTTGGTACAGTTGCTTGGTTTGCTA GACATCAAATAGCCAATCGACTTTTCAAATCTGATTCTACCAATAAATCTGAAGTTAAGGATGAGGCAAAGACCCCTAAACAAGAACGTAACTTTGTTAAAGTGATGCAGCAACAGGGTCGTCGAGTCATCTTCTTTTATGGTTCTCAGACAGGTACAGCCGAAGACTTTGCTTCTCGTCTTGCAAAAGAATGTACACAAAAATATGGTGTGAGCGCAATGACTGCTGATATTGAACAATATGATTTGAGCTACCTTGATTCAGTTCCCGAAGACTCTTTGGTGTTCTTTATTATGGCAACCTATGGTGAAGGTGAACCTACTGATAACGCTGTTGATTTTTGGGACTTGTTAGCAGAAGAGGTACCTGAGTTCTCTAATGATGATGGTGAGGGAAAGCCATTGCAAAAACTTCGTTATGTAGCCTTTGGTCTTGGTAACAAAACTTATGAGCATTACAATGAGGTCATTAGAAAAGTAGATAACCGTTTACTTTCTTTGGGTGCAAAGAGAATCGGCGAAAGAGGAGAAGGTGATGATGATGGTACACTTGAAGAAGATTTCTTGGCTTGGCAAGAAGAGATGTGGCCTGCTTTTTGTGAAGCTCTTGGTGTAGATGAAAGCAATGCTCACTCTGGACCACGCCAAGCTATTTTCAAAATCGAAGAACTGACTGCATATGACCAAGCAAAGGTCTACCTTGGTGAAATAGGAGAATGGCTTAAGGAAGGAGCCTCTATTGTTTATGATGCTAAACGTCCTTACAATGCACCTATTACTTCAAAGGACATTTTCAAAGCAGGCGATAGACATTGTCTTCATCTTGAAATTGATATTTCTAATACAAACTTGTCTTATCAAACTGGTGACCATGTTGCTATTTGGCCAACAAACAATGAAGTCGAAGTCAACCGTCTTGCTAAACTTCTTGGATTACAAAATAAGTTGGATACAGTCATTCACGTACAATCACTTGACCCTGCTGCTTCCAAAAAATATCCTTTCCCAGTTCCTACAACCTATCGAGCTGTATTCCGTCATTACCTTGACATTTGTTCTGCAGTTCCCCGTCAAGTC TTGATGTCATTGATTGAATATGCTCCTACTGAAGCCTCCAAAGAAGCTCTTAGAAAACTTGCTACTGATAAAGATGAATATCGTGTTCATGTAGGTGATGTCACTCGTAACTTGGGTGAGGTATTACAAATGTTGGCAGAGAGTGAATCTTTGGAGTTAGATGGTGCATTTTCCTCAGTTCCTTTCGATTTAGTTATTGAAAGCATCTCACGTCTTCAACCTCGCTACTACTCCATTTCTTCATCATCAAAAGAAAATCCCAAAAAGATTGCCGTTACTGCAGTCACTCTTCAATACACTCCAGAGCACGGATCTCCTCGTACAGTCTATGGTGTTAATACCAACTATCTTTGGCGTGTTCATGAAGCAGTCAATAACTTAACTCCTAATAGTGTGATCCCTGAATATAACTTGACAGGACCACGTGATTCATTGTTTAGCCAGCAAGGCAAAGTTGCTCGTATTCCTGTTCATGTCCGTCGTTCTCAATTCAAATTGCCTAGAAATCCTACTGTGCCTGTTATCATGATCGGTCCTGGTACTGGTGTTGCACCATTCCGTGGATTTGTTAGAGAACGCGCACTTCAAAAGAAGGAAAATAAACCAGTGGGGCCTACTATCCTCTTCTTTGGTTGTCGTAATAGAGCAGAAGATTTCCTTTATGAAGAAGAATGGCCAGAGTTATTTGAAGTCTTGGGAGGTGATTCTCGTATCATCACAGCATTTTCACGTGAAACTGAAAAAAAGGTTTATGTACAACACCGCTTAATGGAAAATGGCCAAGAGATGTGGAATTTATTGGAAAAGGGCGCTTACGTTTATGTTTGTGGAGATGCAAAGAACATGGCTCGTGATGTTAATCAAACATTTGTACGCTTTGCACAACAGTTTGGCGGAATGGACGAAAATCGATCTCAGGATTACGTGAAGAATTTGAGAAATACGGGTAGATACCAAGAAGATGTTTGGAGTTAA
[0027]所述黑根霉菌絲獲得方法如下:
[0028]a.在PDA培養(yǎng)基平板上對`黑根霉進行菌種活化，培養(yǎng)溫度28~30°C，所述的PDA培養(yǎng)基終濃度為:馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉15g/L，溶劑為水，pH自然；
[0029]b.在PDA斜面上培養(yǎng)3~5天后，用無菌水洗下黑根霉孢子，玻璃珠打散并用無菌紗布過濾制成孢子懸液后接種至MYG液體培養(yǎng)基，至于28~30°C下靜置培養(yǎng)14~16h，收集得到黑根霉菌絲。
[0030]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明首次利用原生質體轉化法將構建好的含有米根霉CPR基因的pCB1004-pgpd質粒轉化至黑根霉，找到了合適的轉化參數(shù)并優(yōu)化了參數(shù)組合，構建了適用于黑根霉遺傳轉化系統(tǒng)，可以用于黑根霉的分子生物學研究，如研究該菌對甾體化合物代謝的分子機制以及該菌的生長發(fā)育機制等；可以用來對黑根霉實施其他基因工程從而進行遺傳改良育種。
(四)【具體實施方式】[0031]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0032]實施例1:利用原生質體轉化法對黑根霉進行外源基因pCB1004-pgpd_CPR的遺傳轉化
[0033]利用
【發(fā)明內容】
中所述的方法，將含有CPR目的基因的外源質粒pCB1004-pgpd-CPR導入了黑根霉，通過潮霉素篩選得到穩(wěn)定轉化的工程菌并應用于留體化合物的羥化轉化。具體方法如下:
[0034]1、真菌表達質粒構建
[0035]I)根據geneBank上的黑根霉CPR基因序列設計引物:
[0036]CPR-F: 5，-GGATCCATGACTCGAAACAACTCTCATC-3，(下劃線為 BamH I 酶切位點)；
[0037]CPR-R:5，-AAGCTTTTAACTCCAAACATCTTCTTGG-3，(下劃線為 Hind III 酶切位點)
[0038]按照Takara RNAiso Plus試劑盒說明書提取米根霉(CICC40467)總RNA，然后用PrimeScript RT-PCR Kit反轉錄得到cDNA。以反轉錄擴增出的cDNA為模板，CPR-F/CPR-R為引物PCR擴增CPR基因。
[0039]PCR 體系:10XPCR buffer (Takara)5.0 μ L, d NTPs2.0 μ L (IOmM), CPR-F1.0 μ L(IOOmM), CPR-R1.Ομ L (lOOmM)，cDNA 模板 5.0 μ L，TaKaRa Ex Taq HS0.25 μ L (5u/uL),RNase Free dH20 補充至 25yL。
[0040]PCR 程序:94°C預變性 2min ;94°C變性 40s，60°C退火 30s，55°C退火 30s70°C延伸2min (35次循環(huán));72°C延伸5min。經T-A克隆得到重組載體pMD19_T_CPR，轉化E.coliDH5a。
[0041]2)分別用 BamH I 和 Hind III 對 pMD19_T_CPR 和質粒 pCB1004_pgpd (質粒由浙江工業(yè)大學朱廷恒博士惠贈)雙酶切，將獲得純化后的目的基因CPR與質粒pCB1004-pgpd大片段連接，連接產物轉化E.coli至DH5 α，涂布于含50 μ g/mL氯霉素抗性的LB平板，篩選含表達質粒pCB1004-pgpd-CPR的轉化子。以特異性引物CPR-F/CPR-R進行菌落PCR鑒定后提取質粒，在分別以BamH I和Hind III進行酶切鑒定得到正確結果后，測序。
[0042]測序結果如下:
[0043]真菌表達質粒目的條帶CPR測序結果比對:
[0044]自帶引物測序結果:
[0045]CPR 引物:
[0046]上游(5’ -3，):GGATCCATGACTCGAAACAACTCTCATC
[0047]Bam HI
[0048]下游(5，-3，):AAGCTTTTAACTCCAAACATCTTCTTGG
[0049]Hind III
[0050]686bp
[0051]AGGGTCGTCGAGTCATCTTCTTTTATGGTTCTCAGACAGGTACAGCCGAAGACTTTGCTT
[0052]I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
[0053]AGGGTCGTCGAGTCATCTTCTTTTATGGTTCTCAGACAGGTACAGCCGAAGACTTTGCTT
[0054]CTCGTCTTGCAAAAGAATGTACACAAAAATATGGTGTGAGCGCAATGACTGCTGATATTG
[0055]I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
【權利要求】
1.一種利用原生質體轉化構建黑根霉CPR基因工程菌的方法，所述方法包括: Cl)從米根霉克隆得到其CPR基因，克隆至質粒pCB1004-pgpd，得到表達質粒pCB1004-pgpd-CPR ； (2)將黑根霉孢子原生質體用lmol/L的山梨醇溶液懸浮，調節(jié)原生質體濃度為IO7~IO8個/mL,得到原生質體溶液；所述山梨醇溶液組成如下:lmol/L山梨醇，10mmol/LTris-Cl, 50mmol/L CaCl2，溶劑為水，ρΗ7.0 ； (3)將構建的表達質粒pCB1004-pgpd-CPR經限制性內切酶酶切，酶切產物純化后溶于無菌去離子水至濃度為10~15 μ g/mL，得到線性化質粒溶液； (4)每100μL原生質體溶液加入10μ L線性化質粒溶液，并加入I~2μ L步驟(3)所述限制性內切酶，混勻，冰浴30min后，加入20~50 μ L的PEG4000_CaCl2溶液，冰浴10~20min ;再加入400~800 μ L的PEG4000_CaCl2溶液，室溫靜置10~15min ;所述 PEG4000_CaCl2 溶液組成如下:PEG400060%，CaCl250mmol/L,山梨醇 lmol/L，Tris-Cl 10mmol/L，溶劑為水，ρΗ7.0 ； (5)步驟(4)轉化液轉移至IOmLMYG液體再生培養(yǎng)基，28°C、80rpm，培養(yǎng)12h后，離心，用無菌去離子水洗滌，獲得菌懸液涂布于含有150 μ g/mL潮霉素B的MYG固體平板，28°C培養(yǎng); (6)待平板上長出菌絲后，轉接到含有150μ g/mL潮霉素B的MYG固體平板上；轉化子在潮霉素B濃度200 μ g/mL的MYG固體平板上繼代培養(yǎng)，提取轉化子基因組，進行PCR確定目的基因片段是否整合到黑根霉基因組中，鑒定正確后保存。
2.如權利要求1所述的方法 ，其特征在于所述黑根霉孢子原生質體溶液按如下方法制得: (1)收集黑根霉菌絲，用無菌去離子水洗滌2次后，再用酶解液洗滌2次，得濕菌體；所述酶解液組成如下:0.5mol/L MgSO4, 50mmol/L DL-Maleate aicd,溶劑為水； (2)每Iml細胞壁降解酶液加入0.5~1.0g濕菌體，置30°C水浴鍋，每20min輕輕搖勻，酶解游離原生質體3~4h，得到原生質體酶解液；細胞壁降解酶液按如下組成配制:Iywallzyme和Yatalase質量比為5:7的混合酶溶解于無菌的0.5mol/L MgS04、50mmol/LDL-Maleate aicd溶液中，制成終濃度為50mg/mL的細胞壁降解酶液； (3)將原生質體酶解液用lmol/L山梨醇溶液稀釋，過濾除去菌絲殘片，5000r/min離心lOmin，得原生質體沉淀，用lmol/L山梨醇溶液懸浮，調節(jié)原生質體濃度為IO7~IO8個/mL，得原生質體溶液。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述CPR基因序列如下:
ATGACTCGAAACAACTCTCATCATCTGCTTGACACAGTCGATTTGATACTGCTAGGTACCATTGGCCTTGGTACAGTTGCTTGGTTTGCTAGACATCAAATAGCCAATCGACTTTTCAAATCTGATTCTACCAATAAATCTGAAGTTAAGGATGAGGCAAAGACCCCTAAACAAGAACGTAACTTTGTTAAAGTGATGCAGCAACAGGGTCGTCGAGTCATCTTCTTTTATGGTTCTCAGACAGGTACAGCCGAAGACTTTGCTTCTCGTCTTGCAAAAGAATGTACACAAAAATATGGTGTGAGCGCAATGACTGCTGATATTGAACAATATGATTTGAGCTACCTTGATTCAGTTCCCGAAGACTCTTTGGTGTTCTTTATTATGGCAACCTATGGTGAAGGTGAACCTACTGATAACGCTGTTGATTTTTGGGACTTGTTAGCAGAAGAGGTACCTGAGTTCTCTAATGATGATGGTGAGGGAAAGCCATTGCAAAAACTTCGTTATGTAGCCTTTGGTCTTGGTAACAAAACTTATGAGCATTACAATGAGGTCATTAGAAAAGTAGATAACCGTTTACTTTCTTTGGGTGCAAAGAGAATCGGCGA
【文檔編號】C12N15/80GK103695455SQ201310316876
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年7月24日 優(yōu)先權日:2013年7月24日
【發(fā)明者】陳小龍, 顧光志, 朱廷恒, 嘉曉勤, 范永仙, 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學, 臺州仙琚藥業(yè)有限公司