專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水蛭素突變體及重組基因工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一種生物工程新型水蛭素及其生產(chǎn)方法，特別涉及一種水蛭素突變體及其生產(chǎn)方法，即大腸桿菌分泌表達(dá)水蛭素突變體。
背景技術(shù)：
水蛭是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，中醫(yī)認(rèn)為它有破血、逐淤、通絡(luò)的療效，主要用于治療血瘀、閉經(jīng)和跌打損傷等。天然水蛭素是從醫(yī)用水蛭的唾液中提取的活性成分。1955年,Markward從水蛭頭部唾液腺中提取水蛭素純品，針對(duì)凝血酶抑制劑的研究迅速開(kāi)展起來(lái)。水蛭素有多種異構(gòu)體，其中研究和應(yīng)用最多的是有65或66個(gè)氨基酸組成的三種水蛭素變異體，即HV-1、HV-2和HV-3，分子質(zhì)量約為7000kD，等電點(diǎn)在4. 2左右。其N(xiāo)末端富含疏水性氨基酸殘基，其中有3對(duì)二硫鍵(Cys6-Cysl4，Cysl6_ Cys28, Cys32-Cys39)，使N末端肽鏈繞迭成密集形核心環(huán)肽結(jié)構(gòu)，對(duì)穩(wěn)定水蛭素空間結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵作用。C末端富含酸性氨基酸殘基，最后9個(gè)氨基酸中有6個(gè)為酸性氨基酸。它們的N端球狀結(jié)構(gòu)與凝血酶的活性位點(diǎn)相互作用，同時(shí)C端的帶負(fù)電氨基酸殘基與凝血酶外表面位點(diǎn)非活性底物識(shí)別位點(diǎn)相結(jié)合。水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑，它能與凝血酶以摩爾比為
11的方式結(jié)合形成復(fù)合物，使凝血酶失去裂解纖維蛋白原的能力，阻止了纖維蛋白的形成。同時(shí)，水蛭素也能阻斷凝血酶催化的止血反應(yīng)及凝血酶誘導(dǎo)的血小板反應(yīng)。因此，水蛭素在臨床上有廣泛的應(yīng)用，如治療腦血栓和腦出血、減輕腦出血水腫、用于血液透析過(guò)程中抗凝治療、對(duì)心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛的治療等。此外，水蛭還可以口服，這給用藥帶來(lái)了很大的方便。水蛭素比較穩(wěn)定，胰蛋白酶并不破壞其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用。水蛭素的醫(yī)療價(jià)值得到了人們的普通重視，然而由于從醫(yī)用水蛭中提取天然水蛭素產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴、工藝復(fù)雜，使研究和應(yīng)用受到了限制，故國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界均著重研究通過(guò)基因工程取得重組水蛭素。1986年后，重組水蛭素已在大腸桿菌中表達(dá)成功。隨著基因工程在醫(yī)藥領(lǐng)域的深入應(yīng)用，水蛭素的研究與開(kāi)發(fā)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，重組水蛭素在細(xì)菌和酵母中得到了大量的表達(dá)，為抗凝血、抗血栓藥物研究開(kāi)辟了新的途徑。當(dāng)前，水蛭素突變體有多種，研究表明，將天然水蛭素II的第47位天冬酰胺(Asn)改變成賴(lài)氨酸(Lys)的水蛭素突變體HV2_Lys47，帶肽鏈結(jié)構(gòu)中有一個(gè)由Pro-Lys-Pro組成的特殊序列，一般不被蛋白酶降解，具有維持水蛭素分子穩(wěn)定和引導(dǎo)水蛭素分子正確的方式與凝血酶分子結(jié)合的作用，參見(jiàn)發(fā)明專(zhuān)利水蛭素突變體的一種編碼基因與高效表達(dá)菌株。目前，該種水蛭素突變體在酵母表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種新型水蛭素突變體及其基因工程生產(chǎn)方法，即提供一種N端第一個(gè)氨基酸突變?yōu)锳la的HV2-Lys47新型水蛭素突變體Alal_HV2-Lys47，在其編碼基因的上游插入DsbA信號(hào)肽的編碼序列構(gòu)建重組載體，以方便分泌型表達(dá)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是本發(fā)明提供一種水蛭素突變體，所述水蛭素突變體是將水蛭素HV2_Lys47的N端第一個(gè)氨基酸突變?yōu)锳la獲得的水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47。本發(fā)明還提供一種含所述水蛭素突變體的重組基因工程菌，所述重組基因工程菌按如下方法獲得將水蛭素突變體Alal-HV2-LyS47編碼基因與DsbA信號(hào)肽的編碼基因拼接后獲得拼接產(chǎn)物，再將拼接產(chǎn)物重組于載體中制備重組載體，最后將重組載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞制備含有水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因的重組基因工程菌。進(jìn)一步，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。本發(fā)明優(yōu)選所述水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47的氨基酸序列為SEQ ID NO 1所示，相應(yīng)優(yōu)選水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47的編碼基因?yàn)镾EQ ID NO :2所示的核苷酸序列。本發(fā)明將水蛭素HV2_Lys47的N端第一個(gè)氨基酸Ile突變?yōu)锳la獲得新型水蛭素突變體，命名為水蛭素Alal-HV2-Lys47，即本發(fā)明所述新型水蛭素突變體。以大腸桿菌偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)該突變體的編碼基因，委托生物技術(shù)公司化學(xué)合成該基因。通過(guò)設(shè)計(jì)引物，采用重疊延伸拼接(SOE)技術(shù)將DsbA信號(hào)肽的編碼基因與水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47的編碼基因進(jìn)行拼接，將拼接產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和BamHI酶切后重組于pET39載體中，獲得重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，構(gòu)建周質(zhì)分泌表達(dá)型基因工程菌。DsbA信號(hào)肽可以使目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間分泌表達(dá)，大腸桿菌周質(zhì)空間具有氧化性環(huán)境，易于得到具有正確空間結(jié)構(gòu)的目標(biāo)蛋白，周質(zhì)空間雜蛋白少、目標(biāo)蛋白含量高。在信號(hào)肽酶的作用下，信號(hào)肽被切除，目標(biāo)多 肽分泌于周質(zhì)空間。無(wú)需破菌，直接進(jìn)行周質(zhì)蛋白提取即可得到較高純度的水蛭素蛋白。構(gòu)建的重組表達(dá)載體PET39-SHV，其物理圖譜如圖2所示。本發(fā)明提供一種水蛭素突變體Alal-HV2_Lys47的生產(chǎn)方法，將含水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因與DsbA信號(hào)肽的編碼基因拼接產(chǎn)物的重組基因工程菌的細(xì)胞接種至含有50 Pg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)16小時(shí)，按體積比I %的接種量接種到發(fā)酵養(yǎng)基中，200 r/ min震蕩培養(yǎng)到0D_約O. 3 O. 7時(shí)，添加終濃度為O.1、. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)28h。離心收集菌體，用“冷休克-滲透法”提取周質(zhì)蛋白，方法參見(jiàn)(李振國(guó)等，大腸桿菌周質(zhì)蛋白提取工藝的研究，生物學(xué)雜志，28 (6)，2011，12.)采用凝血酶滴定法測(cè)得水蛭素突變體的活性可達(dá)900ATU/mL。本發(fā)明的要點(diǎn)在于提供了水蛭素突變體Alal-HV2_Lys47(優(yōu)選SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列)，在已知該氨基酸序列和核苷酸序列的情況下，該氨基酸序列和核苷酸序列的獲得，以及相關(guān)載體、宿主細(xì)胞的獲得，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)均是顯而易見(jiàn)的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供一種水蛭素突變體及重組基因工程菌，所述水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47和未突變的水蛭素HV2_Lys47相t匕，比活性相同，但是在周質(zhì)空間的表達(dá)量提高了近一倍，水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47活性為113ATU/mL發(fā)酵液，未突變的水蛭素HV2_Lys47活性為60ATU/mL發(fā)酵液。


圖1 DsbA信號(hào)肽編碼基因與水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因的拼接路線(xiàn).圖2重組載體pET39-SHV的物理圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此LB固體培養(yǎng)基質(zhì)量終濃度組成為0. 5%酵母膏、1%胰蛋白胨、1%氯化鈉，溶劑為水。實(shí)施例1水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因的獲得通過(guò)查閱文獻(xiàn)得到天然水蛭素II型HV2_Lys47的氨基酸序列，將將N末端第一個(gè)異亮氨酸(He)突變?yōu)楸彼?Ala)，獲得水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47，氨基酸序列為SEQ ID N0:1所示，根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47的全基因序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司化學(xué)全合成得到目的基因。水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47的核苷酸全序列為SEQ ID NO 2所示。實(shí)施例2水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因與DsbA信號(hào)肽編碼基因的拼接按照DsbA信號(hào)肽編碼基因序列以及水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47的編碼基因序列，用引物設(shè)計(jì)軟件DNDSIS設(shè)計(jì)了 以下5個(gè)片斷(即引物)A:5’ GTTCATATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGC 3’B: 5，ACCCGACTCGGTGCAATCGGTGTAGGTCGCCGCCGATGCGCTAAACGCTAAAACT 3，S-1: 5’ GTTCATATGAAAAAGATTTGGCTG 3’H-1: 5， ATTACCTACACCGATTGCACC 3，H-2: 5’ TTTGGATCCTCATTGCAGGTACTCT 3’其中，A片段的3’端與B片段的3’端有18個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)；S_1為A片段5’端的前24個(gè)堿基；B片段的5’端與水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因鏈5’端的30個(gè)堿基反向互補(bǔ)，H-1和H-2片段用于擴(kuò)增水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因序列。首先在pfu DNA聚合酶(購(gòu)自Sangon)的作用下，以A片段和B片段互為引物，一步退火、延伸合成DsbA信號(hào)肽序列AB鏈。然后以化學(xué)合成的水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47全基因序列為模板，以H-1片段和H-2片段為上下游引物，PCR擴(kuò)增水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47全基因序列片段。PCR參數(shù)94 °C預(yù)變性3 min，進(jìn)入循環(huán)94 °C變性30s，41°C退火30 s，72°C延伸60 S，2個(gè)循環(huán)；再94 °C變性30 S，57 °C退火30 S，72 °C延伸60 s，26個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸10 min。再通過(guò)重疊延伸拼接(SOE)技術(shù)分別將AB鏈和擴(kuò)增后的水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47全基因序列拼接。以S-1和H-2為上下游引物，在pfu DNA聚合酶(購(gòu)自Sangon)作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件參數(shù)94 °C預(yù)變性3 min,進(jìn)入循環(huán)94 °C變性30 s，41 °C退火30 s，72 °C延伸60 s，2個(gè)循環(huán)；再94 °C變性30 s，57°C退火30 s，72 °C延伸60 s，26個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸10 min。得到DsbA信號(hào)肽編碼基因與水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因拼接產(chǎn)物，即DsbA信號(hào)肽-Alal-HV2-Lys47的基因全序列(核苷酸序列為SEQ ID NO :3所示，氨基酸序列為SEQ ID N0:4所示)，DsbA信號(hào)肽-Alal-HV2-Lys47拼接過(guò)程如圖1所示。實(shí)施例3構(gòu)建DsbA信號(hào)肽-Alal-HV2_Lys47基因工程菌(I)將實(shí)施例2所得到的拼接產(chǎn)物DsbA信號(hào)肽-Alal-HV2_LyS47基因序列和pET-39b (+)質(zhì)粒分別用BamH I和Nde I在37 °C雙酶切2 h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和3S DNAGel Purification Kit純化回收,得到線(xiàn)形DNA和質(zhì)粒DNA,再用T4 DNA Iigase在20°C連接4小時(shí)，從而將目的片段克隆入pET-39b (+)質(zhì)粒的BamH I和Nde I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)成pET39-SHV重組載體，見(jiàn)圖2。(2)將上述重組載體用CaCl2法轉(zhuǎn)化克隆宿主E. coli DH5 α，方法參見(jiàn)J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)。在含100 Pg/mL卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上挑選分離良好的單克隆，分別以T7正向和H-2為上下游引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，結(jié)果證實(shí)拼接產(chǎn)物DsbA信號(hào)肽-Alal-HV2-Lys47基因序列(SEQ ID NO 3)已經(jīng)重組至pET39_SHV重組載體中，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQ ID NO :5所示。將經(jīng)測(cè)序證實(shí)為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒用CaClJi轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coliBL21 (DE3)，方法同上。在含lOOPg/mL Kan抗性的LB固體培養(yǎng)基上挑選分離良好的單菌落分別接種于3mL含50 Pg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中(O. 5%酵母膏、1%胰蛋白胨、1%氯化鈉，溶劑為水，自然pH值)。37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日按體積比1%接種量分別轉(zhuǎn)接于3mL含50 Pg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中(成份同上)，37°C培養(yǎng)至OD6tltl為O. 3^0. 7時(shí)，分別加入終濃度為O. 5 mmol/L的IPTG，28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)28h后通過(guò)跑Tricine-SDS-PAGE分析水蛭素突變體蛋白的表達(dá)，將有表達(dá)的克隆用甘油冷凍法保存，即獲得含水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47基因的重組基因工程菌。實(shí)施例4重組水蛭素的生產(chǎn)方法(I)培養(yǎng)條件 經(jīng)實(shí)施例3方法篩選 后的陽(yáng)性克隆接種于3個(gè)3 mL含50 Pg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)(0. 5%酵母膏、1%胰蛋白胨、1%氯化鈉，溶劑為水，自然pH值)中，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，次日按體積比1%接種量轉(zhuǎn)接于800mL新鮮的含50 Pg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 3^0. 7時(shí)，加入終濃度為0. 5 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)28 h，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)液。(2)重組水蛭蛋白的制備取800mL誘導(dǎo)培養(yǎng)液于4000 r/min離心15 min,去上清；收集菌體,用20mL含20% (w/v)鹿糖的 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)緩沖液,重懸菌體,冰浴 30 min ;加入 80mL蒸餾水,冰浴30 min ；4000 r/min離心10 min，取上清液，即獲得重組水蛭蛋白。( 3 )重組水蛭素蛋白的初步純化將上一步收集的上清液，以2 mL/min的速度上樣于經(jīng)10 mmol/L Tris-HCl(pH8. 0)平衡過(guò)的Q-Sephorase FF柱中，用50 mL含10 mmol/L的NaCl溶液進(jìn)行預(yù)洗脫；接著用50 mL含40mmol/L的NaCl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)溶液進(jìn)行洗脫，收集含目標(biāo)組分的洗脫液，得到目標(biāo)蛋白。( 4 )重組水蛭素的抗凝血活性測(cè)定按Markwardt 凝血酶滴定法(Markwardt F. Hirudin as an inhibitor ofthrombin, 1970, 69:924^932)所述，取I支小試管加入0. 5% (w/v)牛血纖維蛋白原溶液(50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 4)配制)200μ ，再加50 μ 步驟(2)獲得的上清(即重組水蛭蛋白)混勻，滴加100NIH/mL凝血酶(購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)5 μ 搖勻，37°C恒溫水浴下Imin不凝，再滴加相同濃度凝血酶5 μ ，直到纖維蛋白原溶液在Imin內(nèi)凝結(jié)，所用凝血酶總量乘以20即可計(jì)算出樣品每毫升活性。將步驟(2)獲得的上清(即重組水蛭蛋白)進(jìn)行抗凝血活性測(cè)定，突變重組菌的周質(zhì)提取液上清中抗凝血酶活力達(dá)900ATU/mL。未突變的水蛭素HV2-Lys47周質(zhì)提取液的活性為480ATU/mL。由于周質(zhì)提取液的體積為發(fā)酵液體積的1/8，所以 每毫升發(fā)酵液中水蛭素的活性為113ATU，而未突變的水蛭素重組菌每毫升發(fā)酵液中水蛭素的活性為60ATU。
權(quán)利要求
1.一種水蛭素突變體，其特征在于所述水蛭素突變體是將水蛭素HV2-Lys47的N端第一個(gè)氨基酸突變?yōu)锳la獲得的水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47。
2.一種含權(quán)利要求1所述水蛭素突變體的重組基因工程菌，其特征在于所述重組基因工程菌按如下方法獲得將水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因與DsbA信號(hào)肽的編碼基因拼接后獲得拼接產(chǎn)物，再將拼接產(chǎn)物重組于載體中制備重組載體，最后將重組載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞制備含有水蛭素突變體Alal-HV2-Lys47編碼基因的重組基因工程菌。
3.如權(quán)利要求2所述含權(quán)利要求1所述水蛭素突變體的重組基因工程菌，其特征在于所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水蛭素突變體及重組基因工程菌，所述水蛭素突變體是將水蛭素HV2-Lys47的N端第一個(gè)氨基酸突變?yōu)锳la獲得的水蛭素突變體Ala1-HV2-Lys47，所述水蛭素突變體Ala1-HV2-Lys47的氨基酸序列為SEQ ID NO1所示；所述水蛭素突變體Ala1-HV2-Lys47和未突變的水蛭素HV2-Lys47相比，比活性相同，但是在周質(zhì)空間的表達(dá)量提高了近一倍。
文檔編號(hào)C07K14/815GK103059130SQ20121056768
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月22日
發(fā)明者林陳水, 陳微微, 梨小軍, 任慧穎 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)