專利名稱：一種菌絲霉素基因及其原核融合基因工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種菌絲霉素基因及其大腸桿菌融合基因工程菌。
背景技術(shù)：
Plectasin是2005年Mygind等研究小組通過篩查腐生子囊菌(the saprophytic ascomycetePseudoplectania nigrella)分泌蛋白的cDNA庫，從中找出一些與無脊柱動物防御素序列高度相似的片段，并篩選分離出來的首例真菌防御素(其研究結(jié)果公布在《自然》雜志上(Nature，2005，437 :975 980))。Plectasin基因開放閱讀框編碼一個95個殘基的肽，由一個信號肽序列(殘基1-2 ，一個前片斷(殘基23-5 和一個40個殘基的 C端區(qū)域成熟肽(殘基56-%)。Plectasin高抗革蘭氏陽性菌、無細(xì)胞毒性、無溶血性及腦脊液滲透性好，在治療革蘭氏陽性菌病方面具有相當(dāng)大的潛力，是具有治療潛能的新的肽抗生素。大腸桿菌是常用的重組表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、基因工程操作方便、 商品化宿主和表達(dá)載體種類齊全、表達(dá)效率高、成本低、可以快速高密度培養(yǎng)等優(yōu)點。目前未見大腸桿菌表達(dá)菌絲霉素的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于大腸桿菌密碼子偏愛性優(yōu)化的菌絲霉素基因及含有該基因的大腸桿菌基因工程菌。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，其特征在于該方法包括以下步驟(一 )菌絲霉素基因的設(shè)計和合成所述的菌絲霉素基因為編碼菌絲霉素成熟肽核苷酸序列，其特征為根據(jù)大腸桿菌(Escherichia coli)密碼子使用的偏愛性(http//www. kazusa. or. jp/codon/)優(yōu)化設(shè)計，所得菌絲霉素基因具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，通過人工方法直接合成獲得。( 二 )重組菌絲霉素表達(dá)載體的構(gòu)建所述的表達(dá)載體衍生于pET系列表達(dá)載體，優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體采用 pET32a(+) ο在菌絲霉素基因的5'-端設(shè)計)(a因子的識別切割位點(IEGR)編碼序列，用于融合蛋白切割獲得重組Plectasin，在其基因兩端設(shè)計Plectasin基因中不具備但載體多克隆位點上具有的限制性內(nèi)切酶BamHI和B10I酶切位點，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司直接合成，菌絲霉素基因片段經(jīng)BamHI和B10I雙酶切后克隆至經(jīng)相同酶切后的表達(dá)載體pET3h(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pETPlectasin，經(jīng)測序驗證后保存在大腸桿菌DH5 α 中。(三)重組菌絲霉素大腸桿菌融合基因工程菌的構(gòu)建
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所述的大腸桿菌優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)。重組表達(dá)載體pETPlectasin轉(zhuǎn)化經(jīng)氯化鈣法制備大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板(Amp，100 μ g/mL)，倒置，于37°C培養(yǎng)至出現(xiàn)重組單菌落，菌落 PCR篩選含有plectasin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小正確的陽性重組大腸桿菌BL21 (DE3) pETPlectasin，該菌株已于2010年1月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址中國.北京.朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)保藏，其保藏號為 CGMCC No. 3563。(四)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、柱上切割和重組菌絲霉素的純化過夜重組菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接TB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD6tltl =1.0時，加入0. 4mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h，融合蛋白含量能達(dá)到53. 6%。重組菌誘導(dǎo)后收集菌體，超聲裂解，離心，取上清至親和柱后，使融合蛋白和Ni-NTAHis-Bind樹脂于4°C充分結(jié)合lh，流出穿過峰后，采用低濃度咪唑QOmM咪唑)漂洗緩沖液去除雜蛋白，用4倍柱體積的因子酶切緩沖液進(jìn)行平衡， 加入1倍柱體積的)(a因子酶切緩沖液，按每mL柱材IOU加入所需的酶量，在21°C反應(yīng)，切割一定時間(約48h)，用4倍柱體積的fe因子酶切緩沖液沖洗獲得重組菌絲霉素，經(jīng)無菌水透析除鹽凍干保存。(五)重組菌絲霉素的應(yīng)用重組菌絲霉素?zé)o溶血性，可以有效的抑制革蘭氏陽性菌肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌的生長，具有潛在的抗菌藥物開發(fā)價值。通過附圖和實施例對本發(fā)明具體實施方式
進(jìn)行說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。


圖1.融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE圖1 :E. coli BL21 ；2 到 3 :E. coli BL21-pET32a 分別誘導(dǎo) Oh 和 4h ；4-9 不同誘導(dǎo)時間的誘導(dǎo)結(jié)果(0，l，2，4，6，16h)；10 蛋白質(zhì) marker (由上至下:94. 0，66. 2，45. 0，28. 5，14. 4kDa)圖2. Xa因子柱上切割融合蛋白洗出的重組菌絲霉素的Tricine-SDS-PAGE1 蛋白質(zhì) marker (由上至下:94. 0，66. 2，45. 0，28. 5，14. 4kDa)2-7 依次為酶切 0，6，12，24，48和9611樣品。圖3. Xa因子柱上切割融合蛋白洗出的重組菌絲霉素的MS圖4399. 12Da相應(yīng)于重組肽。圖4.菌絲霉素對兔血紅細(xì)胞的溶血測驗結(jié)果
具體實施例方式下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如“分子克隆實驗室手冊”(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)及“精編分子生物學(xué)實驗指南”(美/F.奧斯伯等著，顏子穎等譯，北京，科學(xué)出版社，1998)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
本發(fā)明的實施例中使用的大腸桿菌BL21(DE3)及pET系列表達(dá)載體pET3h(+) 均購自Novagen公司，使用的質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司 (TIANGEN)，使用的限制性內(nèi)切酶購自NEB公司(New England Biolabs)。實施例1菌絲霉素原核融合基因工程菌的構(gòu)建1. 1基于大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計Plectasin的基因根據(jù)大腸桿菌(Escherichia coli)密碼子使用的偏愛性(http//www. kazusa. or. jp/codon/)優(yōu)化設(shè)計，所得菌絲霉素基因具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。1. 2菌絲霉素原核融合表達(dá)載體的構(gòu)建在菌絲霉素基因的5'-端設(shè)計fe因子的識別切割位點(IEGR)編碼序列，用于融合蛋白切割獲得重組Plectasin，在其基因兩端設(shè)計Plectasin基因中不具備但載體多克隆位點上具有的限制性內(nèi)切酶BamHI和BioI酶切位點，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司直接合成，菌絲霉素基因片段經(jīng)BamHI和BioI雙酶切后克隆至經(jīng)相同酶切后的表達(dá)載體pET3h(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pETPlectasin，經(jīng)測序驗證后保存在大腸桿菌DH5 α 中。1. 3 重組表達(dá)菌株 Ε. coli BL21 (DE3)pETPlectasin 的構(gòu)建用氯化鈣法制備大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，每100 μ L感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，加入重組質(zhì)粒DNA 1 1(^1^(用量不超過1(^1^，0嫩<50叫)輕輕旋轉(zhuǎn)搖勻，冰浴 30min。將離心管42°C水浴90s?？焖賹㈦x心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，Imin 30s。每管加入800 μ L LB培養(yǎng)基，水浴增溫至37°C，然后轉(zhuǎn)移至恒溫?fù)u床，37 0C V，轉(zhuǎn)速小于150rpm，保溫復(fù)蘇 45min。將適當(dāng)體積的已轉(zhuǎn)化細(xì)胞(75 μ L)菌懸液，涂布于LB平板(Amp，100 μ g/mL)。倒置，于37°C培養(yǎng)，12 16h出現(xiàn)重組單菌落。菌落PCR篩選含有plectasin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小正確的陽性重組E. coli BL21(DE3)pETPlectasin。實施例2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和重組菌絲霉素的純化2.1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將轉(zhuǎn)化菌落接種于IOmL含有100 μ g/mLAmp的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床中震蕩培養(yǎng)過夜，以接種量轉(zhuǎn)接到 οομ g/mL Amp的TB培養(yǎng)基中，待菌體生長至對數(shù)生長期，0D600 約1. 0時，加入lOOmmol/LIPTG使其終濃度為0. 4mmol/L，30°C誘導(dǎo)不同時間后，5000rpm離心5min，PBS緩沖液(pH 7. 4)洗滌一次，離心收集菌體，SDS-PAGE電泳表明(圖1)，菌體蛋白中所表達(dá)的蛋白分子量接近預(yù)期融合蛋白分子量02.4 kDa)大小，誘導(dǎo)4 h時融合蛋白 Trx-plectasin的表達(dá)量達(dá)到最高，為細(xì)胞總蛋白的53. 6%。2. 2融合蛋白的柱上切割和重組菌絲霉素的純化重組菌誘導(dǎo)后4h收集菌體，超聲裂解，離心，取上清至親和柱后，使融合蛋白和 Ni-NTAHis-Bind樹脂于4°C充分結(jié)合lh，流出穿過峰后，采用低濃度咪唑(20mM咪唑)漂洗緩沖液去除雜蛋白，用4倍柱體積的因子酶切緩沖液進(jìn)行平衡，加入1倍柱體積的fe 因子酶切緩沖液，按每mL柱材10U加入所需的酶量，在21°C反應(yīng)，切割不同時間，用4倍柱體積的)(a因子酶切緩沖液沖洗獲得重組菌絲霉素，圖2結(jié)果表明在切割他時檢測到 plectasin,隨著切割時間增長，plectasin量逐漸增大，取融合蛋白柱上切割1 樣品的目的蛋白部分進(jìn)行質(zhì)譜分析，在目的蛋白部分，其主峰為4399. 12Da，與plectasin的理論分子量4407. 9Da(完全形成二硫鍵后為4401. 9Da)吻合(圖3)。fci因子柱上酶切24h收集的重組菌絲霉素經(jīng)無菌水透析(透析袋的分子截留量為IkDa)除鹽凍干保存。實施例3重組菌絲霉素的活性3. 1重組菌絲霉素的溶血性使用IOmL真空采血管(含有肝素鈉作為抗凝劑)在日本長耳白兔的耳邊緣靜脈采血，IOmM磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.3)重復(fù)洗滌細(xì)胞三次，然后于4°C，1500rpm，離心 lOmin，至上清無色透明。取180 μ L紅細(xì)胞IOmM PBS懸浮液(紅細(xì)胞的濃度大約為2% )， 與20 μ L不同倍比稀釋的純化重組菌絲霉素混合，混合體系在37°C保溫30min后，1500rpm 離心5min。取上清轉(zhuǎn)移至96孔板，使用酶標(biāo)儀在540nm下測定吸光值。溶血百分比0%和 100%的值分別使用IOmM PBS和0. 1% (v/v)Triton X-100在相同條件下同步測定。每個測試做三個平行，取測定值的平均值。結(jié)果表明plectasin在1 μ g/mL濃度下不具有抗兔紅細(xì)胞的溶血性(圖4)。3. 2重組菌絲霉素對革蘭氏陽性菌的抑菌實驗采用最小抑菌濃度(MIC)實驗鑒定重組菌絲霉素的抑菌活性，測試菌金黃色葡萄球菌ATCC 25923采用MHB培養(yǎng)基培養(yǎng)；肺炎鏈球菌CVCC 2350 (C55962)采用含5%脫脂綿羊血的腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)，將純化的重組菌絲霉素樣品用含有0. 01%乙酸溶液中進(jìn)行倍比稀釋，取10 μ L置于96孔板中，每孔加入稀釋900倍的0. 5麥?zhǔn)媳葷峋鷳乙?0 μ L，密封后置37°C恒溫培養(yǎng)，孵育16 24h判斷結(jié)果。實驗結(jié)果表明但在較低的MIC條件下，重組的Plectasin可以有效的抑制革蘭氏陽性菌肺炎鏈球菌(MIC，2y g/mL)和金黃色葡萄球菌(MIC，0.5yg/mL)的生長，在5%的綿羊血清下與萬古霉素具有相同抗肺炎鏈球菌活性。 本發(fā)明的重組菌絲霉素可應(yīng)用于治療或預(yù)防革蘭氏陽性菌尤其是鏈球菌領(lǐng)域。表1重組Plectasin抗菌的MIC測定.
權(quán)利要求
1.一種菌絲霉素基因，其特征為根據(jù)菌絲霉素成熟肽氨基酸序列，按大腸桿菌 (Escherichiacoli)密碼子使用的偏愛性(http//www. kazusa. or.jp/codon/)優(yōu)化設(shè)計， 具有如序列表SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列。
2.菌絲霉素原核融合表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征在于在如1所述基因的5'-端設(shè)計 )(a因子的識別切割位點(IEGR)編碼序列，用于融合蛋白切割獲得重組Plectasin，在其基因兩端設(shè)計Plectasin基因中不具備但載體多克隆位點上具有的限制性內(nèi)切酶Bam HI和 Xho I酶切位點，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司直接合成，菌絲霉素基因片段經(jīng) Bam HI和Bio I雙酶切后克隆至經(jīng)相同酶切后的表達(dá)載體pET3h(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pETPlectasin，經(jīng)測序驗證后保存在大腸桿菌DH5 α中。
3.融合菌絲霉素基因大腸桿菌的構(gòu)建，其特征在于重組表達(dá)載體pETPlectasin轉(zhuǎn)化經(jīng)氯化鈣法制備大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板(Amp，100 μ g/mL)，倒置， 于37°C培養(yǎng)至出現(xiàn)重組單菌落，菌落PCR篩選含有plectasin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小正確的重組大腸桿菌BL21(DE3)pETPlectasin。
4.如權(quán)利3所述的融合菌絲霉素大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)pETPlectasin，該菌株已于2010年1月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址中國.北京.朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)保藏，其保藏號為CGMCC No. 3563。
5.融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、柱上切割和重組菌絲霉素的純化，其特征在于過夜重組菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接TB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD6tltl= 1.0時，加入0.4mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h，融合蛋白含量達(dá)到53.6%。重組菌誘導(dǎo)后收集菌體，超聲裂解，離心，取上清至親和柱后，使融合蛋白和 Ni-NTAHis-Bind樹脂于4°C充分結(jié)合lh，流出穿過峰后，采用低濃度咪唑QOmM咪唑)漂洗緩沖液去除雜蛋白，用4倍柱體積的fe因子酶切緩沖液進(jìn)行平衡，加入1倍柱體積的fe因子酶切緩沖液，按每mL柱材IOU加入所需的酶量，在21°C反應(yīng)，切割一定時間(約48h)，用 4倍柱體積的fe因子酶切緩沖液沖洗獲得重組菌絲霉素，經(jīng)無菌水透析除鹽凍干保存。
6.重組菌絲霉素?zé)o溶血性，可以有效的抑制革蘭氏陽性菌肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌的生長，是具有治療和防治鏈球菌病潛能的新型抗感染藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開重組菌絲霉素的制備及其應(yīng)用，按大腸桿菌密碼子偏愛性設(shè)計的菌絲霉素基因具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，構(gòu)建重組表達(dá)載體pETPlectasin和重組大腸桿菌BL21(DE3)pETPlectasin(CGMCC No.3563)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)融合蛋白達(dá)53.6％。采用Xa因子柱上切割可獲得重組菌絲霉素，重組菌絲霉素?zé)o溶血性，可以有效的抑制革蘭氏陽性菌肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌的生長，是具有治療和防治鏈球菌病潛能的新型抗感染藥物。
文檔編號C07K14/37GK102191256SQ20101011516
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者張軍, 楊雅麟, 滕達(dá), 王建華, 田子罡 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所