L2多表位融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及L2多表位融合蛋白及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及包含乳頭瘤病毒的L2表位和通用性輔助性T淋巴細(xì)胞的串聯(lián)體和IgG亞型重鏈基因的改造突變體的融合蛋白、其編碼核苷酸、包含所述編碼核苷酸的pFastBac1重組質(zhì)粒、包含所述pFastBac1重組質(zhì)粒構(gòu)建的重組Bacmid、包含所述的重組Bacmid的DH10Bac大腸桿菌、由上述組分制備的HPV預(yù)防性疫苗及其用途。本發(fā)明可以用于HPV感染及HPV感染相關(guān)疾病的免疫預(yù)防，具有重要的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)意義。
【專利說(shuō)明】L2多表位融合蛋白及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及L2多表位融合蛋白及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及包含人乳頭瘤病 毒L2抗原蛋白序列和改造抗體的重鏈蛋白序列的融合蛋白及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 目前已分離鑒定了 100多型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV)，其中 1/3的為嗜黏膜病毒，其中包括誘發(fā)惡性增生的高危型HPV，其感染與宮頸、肛周、陰道、陰 唇、陰莖及口咽癌的發(fā)生密切相關(guān)，計(jì)15種型別，在宮頸癌組織中檢出的陽(yáng)性率由高至底 依次為：HPV16、18、45、31、33、52、58、35、59、56、39、51、73、68、66 ;還包括 12 種誘發(fā)尖銳濕 疣等良性病變的低危型（即￥6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、89)、中間型或可疑高危 型（HPV34、57、83)，及尚未確定型（HPV34、57、83)。其余的為嗜皮膚病毒，如HPV5型，主要誘 發(fā)皮膚疣狀增生。宮頸癌是世界范圍第三高發(fā)的婦女惡性腫瘤，年發(fā)病率約50萬(wàn)，其中亞 洲地區(qū)23. 5萬(wàn)；中國(guó)的年發(fā)病數(shù)10萬(wàn)，誘發(fā)中國(guó)婦女宮頸癌的主要高危型依次為HPV16、 18、58、52、33等?，F(xiàn)有上市的HPV病毒樣顆粒疫苗僅靶向HPV16及18兩種高危型，誘發(fā)的 保護(hù)反應(yīng)主要是疫苗涵蓋型別特異的，且成本高。因此研發(fā)廣譜的HPV疫苗意義重大。
[0003] L2蛋白是病毒次要外殼蛋白，含有保守的中和抗體表位，誘發(fā)產(chǎn)生的抗體常具 有交叉中和活性及免疫保護(hù)作用。目前鑒定的HPV16L2保守中和抗體表位有aa. 17-36、 &&.108-120、&3.64-81及33.56-75等，其中33.17-36為免疫優(yōu)勢(shì)表位（六1卩]18冊(cè)，631]113]1；^& R，Karanam B，et al.Proc Natl Acad Sci USA2008; 105:5850 - 5855.)。但L2合成肽或重組 蛋白免疫誘發(fā)產(chǎn)生的中和抗體的滴度很低。目前報(bào)道的提高L2表位免疫活性的方法有：1、 構(gòu)建含改造 TLR2配體及Th表位的呈分支狀結(jié)構(gòu)的HPV16L2a. a. 17-36脂肽疫苗，可顯著提 高表位的免疫原性；2、將不同乳頭瘤病毒來(lái)源的22拷貝的aal7-36串聯(lián)表位直接串聯(lián)，免 疫效果則很差（Jagu S，Karanam B，Gambhira R，et al.J Natl Cancer Inst. 2009; June2;l 01 (11) :782 - 792.)。提示僅通過(guò)增加表位的數(shù)目而缺乏有效的呈遞方式對(duì)疫苗活性的加強(qiáng) 效果并不理想；3、選擇具有免疫刺激活性的蛋白為載體，如HPV L1病毒樣顆粒（Christina S，Roden R and Kirnbauer R.J. Virol. 2009; 83 (19) :10085.)或細(xì)菌硫氧還蛋白（Rubio I，Bolchi A, Moretto N，et al. Vaccine. 2009; 27 (13) :1949-56.)，構(gòu)建表面展示嵌合L2 表 位的蛋白疫苗，可顯著提高L2表位誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的能力。通用型Th表位能與大多數(shù) 人HLA-DR及小鼠 MHC II分子高親和力結(jié)合，可有效活化Th細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞更好的完全活 化（Alexander J, del Guercio MF，Maewal A，et al.J Immunol. 2000;164(3):1625_33·)， 常被用在合成肽疫苗中，以提高表位的免疫原性。上述數(shù)據(jù)提示與具有免疫刺激活性的分 子融合并表面展不融合表位可以強(qiáng)化L2表位的免疫原性。
[0004] IgG受體（Fc YR)是專職抗原呈遞細(xì)胞表面到達(dá)的分子，可與免疫復(fù)合物或IgG單 體的Fc段結(jié)合，促進(jìn)B細(xì)胞活化，顯著提高抗原特異性的抗體水平。在四種亞型的Fc γ R 中，以Fc γ RI對(duì)IgG單體的親和力最強(qiáng)，與Fc γ RI的結(jié)合區(qū)位于IgG絞鏈區(qū)及CH2結(jié)構(gòu) 區(qū)（HCH2)。研究發(fā)現(xiàn)用四個(gè)拷貝HCH2替換IgG重鏈的VH-CH1段獲得的改造重鏈，經(jīng)Fc 段介導(dǎo)形成的二聚體與Fc γ R的親和力顯著提高，在其N端融合人血清白蛋白獲得的重鏈 Fc段融合蛋白，免疫后可顯著增強(qiáng)血清白蛋白特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)（Jensen ΜΑ, Arnason BG, White DM. Eur.J. Immunol. 2007, 37:1139-1148)。因此，改造后的 IgG 重鏈 蛋白是極具吸引力的疫苗載體，目前尚未見(jiàn)有將其用于HPV疫苗的報(bào)道。由于抗原表位的 呈遞效率及融合蛋白的空間結(jié)構(gòu)、生物活性等性質(zhì)受到其氨基酸一級(jí)序列的巨大影響，優(yōu) 化改造的L2表位與改造抗體融合后是否能被有效呈遞，基因工程改造抗體是否人具有免 疫刺激活性，只能依靠具體的實(shí)驗(yàn)研究才能確定。因此，改造抗體能否用于HPV L2疫苗以 提高其免疫原性需要具體的探索才能確定。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此，本發(fā)明的目的在于獲得改造抗體和HPV的L2抗原蛋白融合的融合蛋白，并 研究其在預(yù)防HPV感染和HPV感染相關(guān)疾病中的用途。
[0006] 因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種融合蛋白，其包含乳頭瘤病毒的抗原蛋白和改 造的抗體蛋白序列，其中乳頭瘤病毒的抗原蛋白是人乳頭瘤病毒的L2表位和通用性輔助 性T淋巴細(xì)胞的串聯(lián)體且在所述串聯(lián)體的上游融合有g(shù)p67信號(hào)肽序列，改造的抗體蛋白選 自所有IgG亞型重鏈基因的改造突變體，改造抗體是用含四個(gè)重復(fù)拷貝的鉸鏈區(qū)-CH2區(qū)的 序列取代IgG重鏈的VH-CH1區(qū)獲得，優(yōu)選地，所述IgG亞型是人的IgGl，優(yōu)選地，所述串聯(lián) 體與IgG重鏈基因的突變體間以GGP連接子相連。
[0007] 優(yōu)選地，所述乳頭瘤病毒選自高危型HPV和低危型HPV，優(yōu)選地，高危型HPV選 自 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 及 12 ;更優(yōu)選地，高危型 HPV 是 HPV16。
[0008] 優(yōu)選地，所述串聯(lián)體是由3個(gè)HPV16L2aa. 17-36表位及一個(gè)通用型輔助性T淋 巴細(xì)胞表位依次串聯(lián)而獲得，L2表位之間以GGP連接子連接，L2表位串與Th表位之間以 Xhol-Kpnl位點(diǎn)及GGP相連，優(yōu)選地，所述通用型輔助性T淋巴細(xì)胞表位的序列如SEQ ID NO :3所示。
[0009] 最優(yōu)選地，所述融合蛋白的序列如SEQ ID N0 :2所示。
[〇〇1〇] 本發(fā)明的第二方面涉及上述第一方面所述的融合蛋白的編碼核苷酸，優(yōu)選地，所 述編碼核苷酸的序列如SEQ ID N0 :1所示。
[〇〇11] 本發(fā)明的第三方面涉及一種有效連接有上述第二方面所述的編碼核苷酸的 pFastBacl重組質(zhì)粒。
[0012] 本發(fā)明的第四方面涉及一種包含利用上述第三方面所述pFastBacl重組質(zhì)粒構(gòu) 建的重組Bacmid。
[0013] 本發(fā)明的第五方面涉及一種包含上述第四方面所述的重組Bacmid的DHlOBac大 腸桿菌。
[0014] 本發(fā)明的第六方面涉及一種利用上述第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的 編碼核苷酸、第三方面所述的pFastBacl重組質(zhì)粒、第四方面所述的重組Bacmid或第五方 面所述的DHlOBac大腸桿菌制備的HPV預(yù)防性疫苗。
[0015] 本發(fā)明的第七方面涉及一種第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的編碼核苷 酸、第三方面所述的pFastBacl重組質(zhì)粒、第四方面所述的重組Bacmid或第五方面所述的 DHlOBac大腸桿菌在制備用于預(yù)防HPV感染或者HPV感染相關(guān)疾病的藥物中的用途。
[0016] 換言之，本發(fā)明的第一方面涉及一種融合蛋白，其包含乳頭瘤病毒的抗原蛋白和 改造抗體蛋白序列。
[0017] 優(yōu)選地，所述改造抗體選自所有IgG亞型重鏈基因的改造突變體，改造抗體是用 含四個(gè)重復(fù)拷貝的鉸鏈區(qū)-CH2區(qū)的序列取代IgG重鏈的VH-CH1區(qū)獲得。更優(yōu)選的是源自 人的IgGl。
[0018] 優(yōu)選地，所述乳頭瘤病毒抗原蛋白的來(lái)源選自高危型的HPV16,18, 31，33, 35, 39， 45, 51，52, 56, 58, 59,68, 73,82 及 12 種低危型 HPV ;更優(yōu)選高危型的 HPV16。
[0019] 優(yōu)選地，所述人乳頭瘤病毒的L2表位及通用型輔助性T淋巴細(xì)胞表位的串 聯(lián)體，在所述串聯(lián)體的上游融合有g(shù)p67信號(hào)肽序列；優(yōu)選地，所述串聯(lián)體是由來(lái)自 HPV16L2aa. 17-36 表位及 Th 表位（AAFIAAATLKAAA)，3 個(gè) L2aa. 17-36 及 1 個(gè)通用型輔助 性T淋巴細(xì)胞表位依次串聯(lián)，L2表位之間以GGP連接子連接，L2表位串與Th表位之間以 Xhol-Kpnl位點(diǎn)及GGP相連。
[0020] 所述串聯(lián)體與IgG重鏈基因的突變體間以GGP連接子相連，所產(chǎn)生的表位抗原與 改造抗體融合蛋白具有SEQ ID N0 :2所不的氣基酸序列。
[0021] 本發(fā)明的第二方面涉及一種如第一方面所述的融合蛋白的編碼核苷酸，優(yōu)選地， 編碼融合蛋白中乳頭瘤病毒的抗原蛋白的核苷酸序列和編碼改造抗體的核苷酸序列是彼 此獨(dú)立的核苷酸序列并通過(guò)隨后的相應(yīng)的核苷酸編碼序列的DNA重組技術(shù)進(jìn)行拼接而獲 得，優(yōu)選地，對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0022] 本發(fā)明的第三方面涉及一種包含第二方面所述的融合蛋白的編碼核苷酸的 pFastBacl重組質(zhì)粒，包含利用所述pFastBacl重組質(zhì)粒構(gòu)建的重組Bacmid，包含所述的重 組Bacmid的DHlOBac大腸桿菌，以及利用所述重組Bacmid構(gòu)建的重組桿狀病毒。
[0023] 本發(fā)明的第四方面涉及一種HPV預(yù)防性疫苗，本發(fā)明的HPV預(yù)防性疫苗的劑型可 以采取疫苗領(lǐng)域常見(jiàn)的所有劑型，例如肌肉注射劑型、皮下注射劑型、靜脈注射劑型等。
[0024] 本發(fā)明的第五方面涉及如第一方面所述的融合蛋白、如第二方面所述的融合蛋白 的編碼核苷酸、如第三方面所述的重組表達(dá)載體在制備用于預(yù)防HPV感染或者HPV感染相 關(guān)疾病的藥物中的用途。
[0025] 綜上，本發(fā)明以具有免疫佐劑活性的改造后的IgG重鏈為載體，構(gòu)建融合HPV的L2 多表位及通用型Th表位抗原形式為基礎(chǔ)的融合蛋白疫苗。用于HPV感染及HPV感染相關(guān) 疾病的免疫預(yù)防，具有重要經(jīng)濟(jì)及社會(huì)意義。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1、E3TR4融合蛋白的基因結(jié)構(gòu)圖，其中S代表gp67信號(hào)肽，E代表 HPV16L2aa. 17-36表位，T代表通用型Th表位，HCH2代表人IgGl鉸鏈區(qū)及CH2結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)c 代表人IgGl的Fc段，包括鉸鏈區(qū)及CH2、CH3結(jié)構(gòu)域。L2表位之間以GGP連接子連接，L2 表位串與Th表位之間以Xhol-Kpnl位點(diǎn)及GGP相連。
[0027] 圖2、pFastBacl_E3TR4質(zhì)粒圖，顯示其中插入了 E3TR4融合基因的重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu) 簡(jiǎn)圖。
[0028] 圖3、顯示了 E3TR4融合蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。A圖代表細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)E3TR4 融合蛋白的SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。B圖代表細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)E3TR4融合蛋白 的Western blot分析結(jié)果。
[0029] 圖4、顯示的是E3TR4免疫血清針對(duì)不同HPV型別假病毒的血清中和抗體滴度。其 中A圖顯示的是抗HPV16型中和抗體滴度，B圖顯示的是抗HPV18型中和抗體滴度，C圖顯 示的是抗HPV58型中和抗體滴度，D圖顯示的是抗HPV52型中和抗體滴度，E圖顯示的是抗 HPV5型中和抗體滴度。 【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不 背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0031] 下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明，均 可容易地從商業(yè)公司獲取。
[0032] 實(shí)施例
[0033] 實(shí)施例1 :E3TR4融合基因的設(shè)計(jì)及優(yōu)化
[0034] E3T基因的上游含有桿狀病毒gp67信號(hào)肽序列，然后依次為經(jīng)GGP連接子串聯(lián)的 3個(gè)拷貝的HPV16L2aa. 17-36表位串、Xhol/Kpnl及GGP連接子序列及1個(gè)通用型Th表位 (SEQ ID NO :3 :AAFIAAATLKAAA)。R4基因的結(jié)構(gòu)為4個(gè)拷貝的人IgGl鉸鏈區(qū)及CH2結(jié)構(gòu) 域（HCH2)串聯(lián)子融合1個(gè)拷貝的IgGIFc段(包含鉸鏈區(qū)及CH2、CH3結(jié)構(gòu)域)。E3T抗原基 因與R4之間經(jīng)GGP連接子連接，構(gòu)成完整的E3TR4基因。經(jīng)昆蟲(chóng)細(xì)胞偏性密碼子優(yōu)化獲得 的E3TR4基因如SEQ ID N0:1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。E3TR4基因結(jié)構(gòu)圖 如圖1所示。
[0035] 優(yōu)化后獲得的E3TR4基因序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司全基因合 成，并利用EcoRI及Hindlll酶切位點(diǎn)裝入pFastBacl質(zhì)粒，獲得的重組質(zhì)粒的圖譜如圖2 所示。
[0036] 實(shí)施例2 :E3TR4融合基因的重組Bacmid及重組桿狀病毒的構(gòu)建
[0037] 使用pFastBacl_E3TR4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得重 組Bacmid，然后用重組Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，在Sf9內(nèi)擴(kuò)增重組桿狀病毒。重組Bacmid 的篩選及重組桿狀病毒的擴(kuò)增方法都是公知的，參見(jiàn)例如專利CN101148661A。
[0038] 實(shí)施例3 :E3TR4融合蛋白基因在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)
[0039] Sf9細(xì)胞接種重組桿狀病毒進(jìn)行E3TR4融合抗體的分泌表達(dá)，88h后收取培養(yǎng)上 清，3000rpm離心15min，收取上清，用于表達(dá)鑒定及純化。感染表達(dá)的方法是公開(kāi)的，參見(jiàn) 例如專利 CN101148661A。
[0040] 實(shí)施例4 :E3TR4融合蛋白基因的表達(dá)鑒定及純化
[0041] 取實(shí)施例3所述的培養(yǎng)上清80 μ 1，加入樣品處理緩沖液，加熱變性后進(jìn)行10%的 SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，具體方法是公開(kāi)的，參見(jiàn)例如專利CN101148661A。
[0042] 取實(shí)施例3所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)上清20 μ 1，加入樣品處理緩沖液，加熱變性后進(jìn) 行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后使用1:3000稀釋的HPV16L2aa. 17-36表位特異性單抗 RG-1作為一抗進(jìn)行Western blot分析，具體方法是公開(kāi)的，參見(jiàn)例如專利CN101148661A。 結(jié)果顯示E3TR4基因有特異性蛋白表達(dá)，參見(jiàn)圖3。大量收集培養(yǎng)上清，采用rProtein A S印harose FF親和層析法進(jìn)行純化。首先用平衡液（lXPBS，5mM EDTA，pH6.8)平衡 rProtein A Sepharose FF親和層析柱，然后240ml實(shí)施例3所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)上清 經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后上樣，流速為0. 3ml/min，上樣完畢后用平衡液充分沖洗，然后用1M Arg，pH4. 0的洗脫液進(jìn)行洗脫，分管收集洗脫液，用1M Tris-Cl，pH9. 0中和液調(diào)至中性。用 SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色法鑒定洗脫液各個(gè)組分的純度。取包含E3TR4目的條帶的洗脫液 組分，合并后在PBS中4°C透析過(guò)夜，-80°C凍存。
[0043] 實(shí)施例5 :E3TR4融合蛋白廣譜免疫活性的檢測(cè)
[0044] 取4-6周齡雌性Balb/c小鼠，隨機(jī)分2組，每組5只。取約1. 7nmol的E3TR4及等 摩爾的E3多肽，調(diào)整體積至100 μ 1，然后與100 μ 1弗氏佐劑(第一次免疫使用完全弗氏佐 齊IJ，第2-4次免疫使用不完全弗氏佐劑）混勻乳化，于第0、14、28、42天分別皮下免疫小鼠。
[0045] 第56天尾靜脈取血，分離血清。用假病毒中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定針對(duì)不同型別的中和抗體 滴度，具體方法是公開(kāi)的，參見(jiàn)例如Vaccine28 (2010) 3479 - 3487。
[0046] 結(jié)果如圖4所示，E3TR4融合抗體加弗氏佐劑免疫除了能誘發(fā)針對(duì)HPV16的中和 抗體之外，還能誘發(fā)針對(duì)HPV5、18、58、52的交叉中和抗體，而E3多肽加弗氏佐劑免疫組則 檢測(cè)不到針對(duì)上述5個(gè)型別的中和抗體。
[〇〇47] 上面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，其中實(shí)施例僅僅是說(shuō)明而非限定的 作用，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以在以下披露的具體實(shí)施例的技術(shù)上做出改進(jìn)，但是不超過(guò) 本發(fā)明權(quán)利要求的范圍或者本發(fā)明精神之內(nèi)所做出的改進(jìn)都會(huì)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0001] 序列表 <11〇>屮N醫(yī)學(xué)科學(xué)院甚礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 <120> L2多表位融合蛋白及其應(yīng)爪 <130> 330067CG <160> 3 <170> Falenlln vei'sion 3. 1 <210> 1 <211> 2625 <2i2> DNA <213> 人了序列 <220 > <223> E3TR4融合蛋白的基因序列 <400> 1 algc taclcg 11aaccag?c Icaccaaggl llcaalaagg aacacaciag caagalggil 60 agcgctattg tcctgtatgi： gct.ct.t.ggca gctgcggccc attct-gcctt tgcgctcgag 120 caactctaca aaacatgcaa acaggcagga acatgcccac ctgacattat ccctaaggtc 180 ggoggaooto agttgtacan gficet.gnaa.g mggrtggomT.tgoortcf tgatatcate 240 cccaaggtcg gtggaccaca 8cttt.at.aag acatgtaaac aagcaggtac atgtccacca 300 gacatcattc ctaaagttct cgagggtacc ggc-ggtcccg ctgccttcat tgcagcigcc 360 actttgaaag ctgccgcagg aggccctgag cccaaatct.t ctgacaaaac tcacacaagc 420 ccaccaagcc cagcacclga acicctgggc ggaccalcag t.cltcctct t occcccaaaa 480 cccaaggaca ccctcatgat ct.ccaggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 540 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat 600 gccaagacaa agcctaggga ggagcagtac aacagcactt acagagtggt cagcgtcctc 660 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagt.aca agtgcaaggt ctccaacaaa 720 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggc-ggccc tgaacccaag 780
[0002]
【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白，其包含乳頭瘤病毒的抗原蛋白和改造的抗體蛋白序列，其中乳頭瘤 病毒的抗原蛋白是人乳頭瘤病毒的L2表位和通用性輔助性T淋巴細(xì)胞的串聯(lián)體且在所述 串聯(lián)體的上游融合有g(shù)p67信號(hào)肽序列，改造的抗體蛋白選自所有IgG亞型重鏈基因的改造 突變體，改造抗體是用含四個(gè)重復(fù)拷貝的鉸鏈區(qū)-CH2區(qū)的序列取代IgG重鏈的VH-CH1區(qū) 獲得，優(yōu)選地，所述IgG亞型是人的IgGl，優(yōu)選地，所述串聯(lián)體與IgG重鏈基因的突變體間以 GGP連接子相連。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述乳頭瘤病毒選自高危型HPV和低 危型 HPV，優(yōu)選地，高危型 HPV 選自 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 及12 ;更優(yōu)選地，高危型HPV是HPV16。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于在所述串聯(lián)體是由3個(gè) HPV16L2aa. 17-36表位及一個(gè)通用型輔助性T淋巴細(xì)胞表位依次串聯(lián)而獲得，L2表位之間 以GGP連接子連接，L2表位串與Th表位之間以Xhol-Kpnl位點(diǎn)及GGP相連，優(yōu)選地，所述 通用型輔助性T淋巴細(xì)胞表位的序列如SEQ ID NO :3所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于在所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO :2 所示。
5. -種根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的融合蛋白的編碼核苷酸，優(yōu)選地，所述編碼核 苷酸的序列如SEQ ID NO :1所示。
6. -種有效連接有權(quán)利要求5所述的編碼核苷酸的pFastBacl重組質(zhì)粒。
7. -種包含利用權(quán)利要求6所述pFastBacl重組質(zhì)粒構(gòu)建的重組Bacmid。
8. -種包含權(quán)利要求7所述的重組Bacmid的DHlOBac大腸桿菌。
9. 一種利用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的融合蛋白、權(quán)利要求5所述的編碼核苷酸、權(quán) 利要求6所述的pFastBacl重組質(zhì)粒、權(quán)利要求7所述的重組Bacmid或權(quán)利要求8所述的 DHlOBac大腸桿菌制備的HPV預(yù)防性疫苗。
10. -種權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的融合蛋白、權(quán)利要求5所述的編碼核苷酸、權(quán)利 要求6所述的pFastBacl重組質(zhì)粒、權(quán)利要求7所述的重組Bacmid或權(quán)利要求8所述的 DHlOBac大腸桿菌在制備用于預(yù)防HPV感染或者HPV感染相關(guān)疾病的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104059152SQ201310088091
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月19日
【發(fā)明者】許雪梅, 陳雪, 劉洪洋, 張婷, 謝喜秀 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所