一株臨床分離的放線菌樣菌種及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一株臨床分離的放線菌樣菌種，是從一名男性肺炎患者的痰中分離到的，該菌株為IFM10348，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的菌株保藏號(hào)：CCTCC?NO:M?2011245，于2011年7月10日保藏。培養(yǎng)方法是將分純的放線菌樣菌株IFM10348以分區(qū)劃線法接種于培養(yǎng)基平板上，置于溫箱中需氧培養(yǎng)；之后取培養(yǎng)物涂片，分別進(jìn)行革蘭染色和抗酸染色；再將菌株點(diǎn)種于凹玻片的培養(yǎng)基內(nèi)，覆蓋蓋玻片，置濕盒內(nèi)于溫箱中需氧培養(yǎng)；待菌體生長(zhǎng)后，取出蓋玻片，經(jīng)固定、脫水、干燥后在蓋玻片上噴金；又將菌株接種于培養(yǎng)基平板上進(jìn)行需氧培養(yǎng)。本發(fā)明菌株的培養(yǎng)方法從而為加深對(duì)臨床病原放線菌的認(rèn)識(shí)，為將來(lái)更好地預(yù)防和治療相關(guān)疾病提供依據(jù)。
【專利說(shuō)明】一株臨床分離的放線菌樣菌種及其培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物，具體而言，涉及放線菌樣菌種。
【背景技術(shù)】
[0002]放線菌是原核生物的一個(gè)類群。大多數(shù)有發(fā)達(dá)的分枝菌絲。菌絲纖細(xì)，寬度近于桿狀細(xì)菌，約0.5~Iy m。放線菌因菌落呈放線狀而的得名，在自然界中分布很廣，主要以孢子繁殖。經(jīng)檢索，涉及放線菌的中國(guó)專利申請(qǐng)件很多，如93112750.5 號(hào)《制備馬杜拉放線菌屬新菌株的方法》、200410026093.1號(hào)《放線菌素D的類似物》、 200510011057.2號(hào)《一種篩選抗煙草黑脛病放線菌的方法》、200710156833.7號(hào)《一株生防放線菌-淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D》、200810123930.0號(hào)《產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的極地海洋放線菌AFN1007》、201110007054.7號(hào)《一種防治油茶病害的生防放線菌菌株及其應(yīng)用》、 201110261599.0號(hào)《一株海洋放線菌L131及其代謝物、代謝物的制法及應(yīng)用》等，但迄今為止未見涉及從病人痰中臨床分離出的放線菌相關(guān)的專利申請(qǐng)件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一株臨床分離的放線菌樣新型菌種，以便對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)與
基因鑒定。
[0004]本發(fā)明的又一目的是提供該菌株的培養(yǎng)方法。
[0005]發(fā)明人提供的菌株為一臨床分離株，是2002年從日本的一名48歲男性肺炎患者的痰中分離到的。從該患者的痰中分離得到的這株放線菌，編號(hào)為IFM10211，經(jīng)過(guò)一系列的鑒定，已于2006年確定IFM10211為戈登氏菌屬的一個(gè)新種，并在IJSEM上發(fā)表文章，命名為Gordonia araiim。該患者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期使用左氧氟沙星治療之后,發(fā)現(xiàn)患者表現(xiàn)對(duì)左氧氟沙星耐藥，從該患者的痰中重新分離得到一株菌，經(jīng)培養(yǎng)，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的菌株保藏號(hào):CCTCC N0:M2011245，于2011年7月10日保藏，保藏單位的地址為:中國(guó)湖北省武漢市武昌洛珈山武漢大學(xué)保藏中心。保藏的培養(yǎng)物命名為`Gort/oflia iterum IFM10348。
[0006]發(fā)明人提供的放線菌樣菌種的培養(yǎng)方法是:將分離得到純的放線菌樣菌株 IFM10348以分區(qū)劃線法接種于腦心浸液瓊脂平板上，置于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)2~4d，觀察IFM10348菌落的形成及特征；之后取培養(yǎng)物涂片，分別進(jìn)行革蘭染色和抗酸染色；再將 IFM10348點(diǎn)種于凹玻片凹窩的腦心浸液培養(yǎng)基內(nèi)，覆蓋蓋玻片，置濕盒內(nèi)，于37 °C溫箱中需氧培養(yǎng)；待菌體長(zhǎng)在蓋玻片上后，取出蓋玻片，經(jīng)固定、脫水、干燥后在蓋玻片上噴金，用掃描電鏡觀察、拍照；將IFM10348接種于腦心浸液瓊脂平板上，分別置于5°C、15°C、20°C、 25 °C、40°C、45 V需氧培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)現(xiàn)象。
[0007]發(fā)明人通過(guò)碳源利用試驗(yàn)及API細(xì)菌數(shù)值鑒定對(duì)IFM10348進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定。 采用氣相色譜分析法對(duì)IFM10348進(jìn)行脂肪酸分析，以了解其脂肪酸組成及含量；通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)，觀察IFM10348對(duì)不同藥物的敏感性；通過(guò)研究IFM10348的形態(tài)、染色、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)、脂肪酸組成，藥物敏感性，對(duì)IFM10348進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定；通過(guò)對(duì)IFM10348的16S rRNA、和Md I基因序列進(jìn)行測(cè)定及分析，對(duì)其進(jìn)行基因鑒定；將IFM10348的生化反應(yīng)及脂肪酸分析結(jié)果與其親緣關(guān)系最近菌種的模式菌株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，進(jìn)一步探討IFM10348的分類學(xué)地位。
[0008]結(jié)果是:菌株IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)37°C需氧培養(yǎng)2d后，肉眼可見形成直徑1.5~3_的淡黃色、邊緣不整齊的粗糙菌落。革蘭染色陽(yáng)性，抗酸染色陰性。掃描電鏡觀察到菌體為桿狀或短棒狀，未發(fā)現(xiàn)鞭毛。IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)5°C、45°C需氧培養(yǎng)8d均未見生長(zhǎng)。經(jīng)15°C、20°C需氧培養(yǎng)5-7d，25、40°C需氧培養(yǎng)2-3d，形成同37°C培養(yǎng)的菌落特征。IFM10348可利用L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、蛋氨酸、3-甲基戊二酸、D-葡糖酸、α -酮戊二酸、3-甲基-己二酸、亞氨基二乙酰乙酸、4甲基傘形酮基-磷酸鹽、對(duì)硝基苯基-a -D-葡糖苷、對(duì)硝基苯基-磷酸鹽、胸腺嘧啶脫氧核苷、粘菌素、D-果糖作為碳源。可還原硝酸鹽、發(fā)酵葡萄糖，可與吡嗪酰胺、焦谷氨酸-萘胺、2-萘基-磷酸鹽、2-萘基-a D-吡喃型葡萄糖苷發(fā)生反應(yīng)，觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性。IFM10348主要含C16:(l和c18:1兩種脂肪酸，此外還有c16:1、c18:0, c18:2、C1813脂肪酸。藥物敏感性試驗(yàn)顯示IFM10348對(duì)妥布霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明敏感，對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥。16S rRNA基因序列測(cè)定結(jié)果在Genebank上比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離菌株IFM10348屬于放線菌戈登氏菌屬。在系統(tǒng)發(fā)育樹上可見分離菌IFM10348與該菌屬的模式菌株hirsuta DSM 44140τ和Gmalaquae IMMIB WWCC-22T親緣關(guān)系最近。經(jīng)Genetyx軟件分析，分離菌IFM10348與G.hirsuta DSM 44140τ 和 malaquae IMMIB WWCC-22T 的 16S rRNA 基因序列相似度最高，分別為96.982%和97.402%。IFM10348的生化反應(yīng)及脂肪酸分析結(jié)果與G.hirsuta DSM441401和61 malaquae IMMIB WWCC-22T 均有明顯差別。
[0009]根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究以及本文的研究結(jié)果，發(fā)明人認(rèn)為:
1.通過(guò)生物學(xué)特性及16S rRNA基因鑒定，臨床分離的放線菌樣菌株IFM10348屬于戈登氏菌屬的放線菌。
[0010]2.通過(guò)對(duì)分離菌株IFM10348的基因鑒定發(fā)現(xiàn)，IFM10348與戈登氏菌屬各有效發(fā)表種的16S rRNA、和Md 2基因序列有一定的差異。其生物學(xué)特性與其親緣關(guān)系最近菌種的模式菌株也不完全相同，根據(jù)其在16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹的位置分析，擬考慮為戈登氏菌屬的一個(gè)新菌種類型。對(duì)于菌種的最終確定還需通過(guò)國(guó)際論文發(fā)表來(lái)落實(shí)。
[0011]3.戈登氏菌屬中的大部分菌種屬于人類的條件致病菌，而且多與肺部感染有關(guān)。該菌株從肺部感染患者分離，提示可能與呼吸道感染有關(guān)。
[0012]發(fā)明人提供的放線菌樣菌種的培養(yǎng)方法培養(yǎng)結(jié)果是:菌株IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)37°C需氧培養(yǎng)2d后，肉眼可見形成直徑1.5~3mm的淡黃色、邊緣不整齊的粗糙菌落；革蘭染色陽(yáng)性，抗酸染色陰性；掃描電鏡觀察到菌體為桿狀或短棒狀，未發(fā)現(xiàn)鞭毛；IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)5°C、45°C需氧培養(yǎng)8d均未見生長(zhǎng)。經(jīng)15°C、20°C需氧培養(yǎng)5~7d，25、40°C需氧培養(yǎng)2~3d，形成同37°C培養(yǎng)的菌落特征。IFM10348可利用L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、蛋氨酸、3-甲基戊二酸、D-葡糖酸、α -酮戊二酸、3_甲基-己二酸、亞氨基二乙酰乙酸、4甲基傘形酮基-磷酸鹽、對(duì)硝基苯基-a -D-葡糖苷、對(duì)硝基苯基-磷酸鹽、胸腺嘧啶脫氧核苷、粘菌素、D-果糖作為碳源，可還原硝酸鹽、發(fā)酵葡萄糖，可與吡嗪酰胺、焦谷氨酸-P -萘胺、2-萘基-磷酸鹽、2-萘基-a D-吡喃型葡萄糖苷發(fā)生反應(yīng)，觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性。IFM10348主要含C16:Q和C18:1兩種脂肪酸，此外還有C16:1、C18:Q、C18:2、 〇18:3脂肪酸。藥物敏感性試驗(yàn)顯示IFM10348對(duì)妥布霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明敏感，對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥。16S rRNA基因序列測(cè)定結(jié)果在Genebank上比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離菌株 IFM10348屬于放線菌戈登氏菌屬。在系統(tǒng)發(fā)育樹上可見分離菌IFM10348與該菌屬的模式菌株hirsuta DSM 441401 和malaquae IMMIB WWCC-221'親緣關(guān)系最近。經(jīng) Genetyx 軟件分析，分離菌 IFM10348 與 hirsuta DSM 441401^6 malaquae IMMIB WWCC-22T 的 16S rRNA基因序列相似度最高，分別為96.982%和97.402%。IFM10348的生化反應(yīng)及脂肪酸分析結(jié)果與 G hirsuta DSM 441401 和 G malaquae IMMIB WWCC-22T 均有明顯差別。
[0013]通過(guò)培養(yǎng)的結(jié)果分析以及生物學(xué)特性及16S rRNA基因鑒定，臨床分離的放線菌樣菌株IFM10348屬于戈登氏菌屬的放線菌；通過(guò)對(duì)分離菌株IFM10348的基因鑒定發(fā)現(xiàn)， IFM10348與戈登氏菌屬各有效發(fā)表種的16S rRNA、^F_r5和Md 2基因序列有一定的差異。 其生物學(xué)特性與其親緣關(guān)系最近菌種的模式菌株也不完全相同；戈登氏菌屬中的大部分菌種屬于人類的條件致病菌，而且多與肺部感染有關(guān)。該菌株從肺部感染患者分離，提示可能與呼吸道感染有關(guān)。
[0014]本發(fā)明提供一株臨床分離的放線菌樣菌種IFM10348，對(duì)該菌株進(jìn)行了生物學(xué)特性及16S rRNA基因等鑒定，為其研究提供了基礎(chǔ)，了解其生理和化學(xué)分類學(xué)特征，本發(fā)明的培養(yǎng)方法從而為加深對(duì)臨床病原放線菌的認(rèn)識(shí)，為將來(lái)更好地預(yù)防和治療相關(guān)疾病提供依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為腦心浸液瓊脂平板上IFM 10348的菌落；圖2為菌株IFM10348的革蘭染色結(jié)果(放大1000倍)，圖3為菌株IFM 10348的掃描電鏡照片(放大5000倍)，圖4為菌株 IFM 10348在16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上的位置，從圖4可知其與已知發(fā)現(xiàn)的戈登氏菌種之間存在著明顯的差異，屬于一株戈登氏新種。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0017]實(shí)施例
按照以下方法培養(yǎng)IFM10348放線菌，并進(jìn)行生物學(xué)特性:
`I菌種與試劑
(I)菌種臨床分離株:IFM10348 ;模式菌株 'G.hirsuta DSM 441401、G.malaquae MMIB WWCC-22T，來(lái)自日本千葉大學(xué)真菌研究所；藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株:金黃色葡萄球菌 ATCC25923,大腸埃希菌 ATCC25922。
[0018](2)染色液革蘭染色液,抗酸染色液。
[0019](3)培養(yǎng)基腦心浸液瓊脂(Difco? Brain Heart Infusion agar),日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社提供，批號(hào)8198572 ;水解酪蛋白瓊脂(MH瓊脂)，杭州微生物試劑有限公司提供，批號(hào)20100716-00。
[0020](4) 棒狀桿菌鑒定試劑盒(API Coryne) 德國(guó)梅里埃公司提供，批號(hào)864773301。內(nèi)有API Coryne試條、GP培養(yǎng)基、懸浮培養(yǎng)基、麥?zhǔn)瞎?、培養(yǎng)盒。
[0021](5)藥敏紙片杭州微生物試劑有限公司提供。妥布霉素，批號(hào)110221;卡那霉素，批號(hào)110310 ;左氧氟沙星，110210 ;環(huán)丙沙星，110223 ;復(fù)方新諾明，110126。
[0022](6)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑DNA提取試劑盒，日本NIPPON GENE公司提供的ISOPLANT II kit試劑盒。PCR反應(yīng)體系,英國(guó)GE Healthcare公司提供的Ready - To-GoPCR beads。PCR反應(yīng)引物，由美國(guó)英杰生命技術(shù)公司合成。
[0023](7) DNA Marker北京天根生化科技有限公司提供。
[0024]2培養(yǎng)與鑒定方法
(I)IFM10348的形態(tài)與培養(yǎng)特性
形態(tài)及染色性:將已分純的IFM10348以分區(qū)劃線法接種于腦心浸液瓊脂平板上，置于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)2-4d，肉眼觀察培養(yǎng)基上IFM10348的菌落形成及其菌落形態(tài)、大小、顏色、表面性狀、邊緣等特征。取培養(yǎng)物涂片后分別進(jìn)行革蘭染色和抗酸染色；
掃描電鏡觀察:用無(wú)菌吸管取融化的腦心浸液培養(yǎng)基，加I滴于無(wú)菌凹玻片的凹窩中。待其凝固后，以無(wú)菌操作法用接種針取IFM10348培養(yǎng)物，點(diǎn)種于凹窩的培養(yǎng)基中心，覆蓋無(wú)菌蓋玻片，置濕盒內(nèi)，同法接種多份，于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)。每日取出一塊蓋玻片，肉眼觀察培養(yǎng)物在蓋玻片上的生長(zhǎng)情況。將蓋玻片上的培養(yǎng)物用接種環(huán)加入到生理鹽水中，制作涂片后進(jìn)行革蘭染色，觀察其形態(tài)。待菌體生長(zhǎng)在蓋玻片上后，將蓋玻片及培養(yǎng)物送本院電鏡室拍攝掃描電鏡。經(jīng)固定、脫水及干燥后，直接在蓋玻片上噴金，用掃描電鏡觀察，拍照。
培養(yǎng)特性:將IFM10348接種于腦心浸液瓊脂平板上，分別置于5°C、15°C、20°C、25°C、40°C、45°C溫箱中需氧培養(yǎng)，肉眼觀察培養(yǎng)基上IFM10348的菌落形成及特征至8d。
[0025](2) IFM10348的生化反應(yīng)鑒定
碳源利用試驗(yàn):根據(jù)已知方法配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基:0.1% NH4NO3,0.1% KH2PO4, 0.05%MgSO4.7H20, 0.02% KCl, ρΗ7.2。加入0.5%底物；底物濾過(guò)除菌；將在腦心浸液瓊脂平板上37°C培養(yǎng)2d的IFM10348加入到無(wú)菌生理鹽水中制成菌懸液，用麥?zhǔn)瞎苷{(diào)整菌濃度為3個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬挥脽o(wú)菌吸管將菌懸液滴入準(zhǔn)備好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基試管內(nèi)，每管一滴；以不加底物的培養(yǎng)基作陰性對(duì)照；將所有試管置于37°C溫箱中靜置培養(yǎng)Iw后，將各試管內(nèi)的液體搖勻，觀察各試管內(nèi)液體的渾濁度?？梢岳孟鄳?yīng)碳源的試管內(nèi)液體較對(duì)照管明顯渾濁，即為陽(yáng)性。
[0026]API細(xì)菌數(shù)值鑒定:根據(jù)棒狀桿菌鑒定試劑盒說(shuō)明書方法，將在腦心浸液瓊脂平板上37°C培養(yǎng)2d的IFM10348加入懸浮培養(yǎng)基中制成菌懸液，用麥?zhǔn)瞎苷{(diào)整菌濃度為6個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?；將配制好的菌懸液用移液器加入試條的前11個(gè)試驗(yàn)(NIT到GEL)管內(nèi)；將余下的菌懸液倒入API GP培養(yǎng)基中，混勻；將新制的菌懸液加入試條后9個(gè)試驗(yàn)(O到GLYG)管內(nèi)；在有下劃線的試驗(yàn)的杯中(URE和(^IjGLYG)加入礦物油，形成新月狀凸起；將試條置濕盒內(nèi)，于36°C ±2°C培養(yǎng)24h;培養(yǎng)之后分別加試劑，等待IOmin后根據(jù)說(shuō)明書上的結(jié)果判讀表判讀結(jié)果。
[0027](3)脂肪酸分析:將IFM10348接種于大量腦心浸液瓊脂平板上，于37°C培養(yǎng)2~3d后，將培養(yǎng)好的菌苔用接種環(huán)刮取后裝于離心管，加入5mL無(wú)菌蒸餾水，于3000r / min離心15 min，倒去上清液，菌體沉淀用蒸餾水洗滌3次，真空干燥。收集一個(gè)青瓶量的菌干粉送貴州師范大學(xué)分析測(cè)試中心采用氣相色譜分析法進(jìn)行脂肪酸分析。
[0028](4)藥物敏感性試驗(yàn)；以金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，根據(jù)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)CLSI M100-S20,對(duì)培養(yǎng)基及藥敏紙片進(jìn)行監(jiān)測(cè)；將在腦心浸液瓊脂平板上37°C培養(yǎng)2d的IFM10348加入到無(wú)菌生理鹽水中，制成菌懸液，用麥?zhǔn)瞎苷{(diào)整菌濃度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?；用無(wú)菌棉簽蘸取菌液在管壁上擠去多余菌液，涂布整個(gè)MH瓊脂平板表面，反復(fù)3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60°，保證涂布均勻； 將藥敏紙片貼于平板上，置于37°C溫箱中培養(yǎng)48h，取出測(cè)量抑菌圈；參考CLSI 執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判斷IFM10348對(duì)不同藥物的敏感性。
【權(quán)利要求】
1.一株臨床分離的放線菌樣菌種，其特征在于是2002年從日本的一名48歲男性肺炎患者的痰中分離到的，該菌株為IFM10348，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的菌株保藏號(hào):CCTCC N0:M2011245，于2011年7月10日保藏，保藏單位的地址為:中國(guó)湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心。
2.如權(quán)利要求1所述放線菌樣菌種的培養(yǎng)方法，其特征是:將分離得到純的放線菌樣菌株IFM10348以分區(qū)劃線法接種于腦心浸液瓊脂平板上，置于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)2~4d，觀察IFM10348菌落的形成及特征；之后取培養(yǎng)物涂片，分別進(jìn)行革蘭染色和抗酸染色；再將IFM10348點(diǎn)種于凹玻片凹窩的腦心浸液培養(yǎng)基內(nèi)，覆蓋蓋玻片，置濕盒內(nèi)，于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)；待菌體長(zhǎng)在蓋玻片上后，取出蓋玻片，經(jīng)固定、脫水、干燥后在蓋玻片上噴金，用掃描電鏡觀察、拍照；又將IFM10348接種于腦心浸液瓊脂平板上，分別置于5°C、15°C、20°C、25°C、4(TC、45°C需氧培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)現(xiàn)象；培養(yǎng)結(jié)果是:菌株IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)37°C需氧培養(yǎng)2d后，肉眼可見形成直徑1.5~3mm的淡黃色、邊緣不整齊的粗糙菌落；革蘭染色陽(yáng)性，抗酸染色陰性；掃描電鏡觀察到菌體為桿狀或短棒狀，未發(fā)現(xiàn)鞭毛；IFM10348在腦 心浸液瓊脂平板上經(jīng)5°C、45°C需氧培養(yǎng)8d均未見生長(zhǎng)。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103525716SQ201310087202
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月19日
【發(fā)明者】康穎倩 申請(qǐng)人:康穎倩