專利名稱：放線菌啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與編碼存在于鏈霉菌(StreptomycesCarbophilus)中P-450細(xì)胞色素的基因相關(guān)的一種新形式的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，包含該啟動(dòng)子的載體，該載體在蛋白質(zhì)尤其是P-450sca-2表達(dá)中的應(yīng)用，包含該載體的宿主細(xì)胞，包含這種細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，以及這種蛋白質(zhì)和表達(dá)系統(tǒng)的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用這種啟動(dòng)子進(jìn)行有用蛋白質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)明背景近年來基因工程領(lǐng)域的進(jìn)展已使在各種微生物中誘導(dǎo)并表達(dá)外來基因成為可能。發(fā)展的一個(gè)特別領(lǐng)域是關(guān)于大腸桿菌(E.Coli)作為宿主用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，該技術(shù)已投入工業(yè)進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用。更近幾年在酵母作為E.Coli工業(yè)替代物方面的研究已取得令人著目的進(jìn)展。
放線菌屬(特別是鏈霉菌屬)是抗生素生產(chǎn)中常用的原核微生物。應(yīng)用Hopwood等在八十年代開發(fā)的宿主一載體系統(tǒng)通常將異源DNA引入放線菌屬中[參考Hopwood，D.A.，等，(1987)，“Methods in Enzymology”，153；116-166，Academic Press，New York]。這項(xiàng)技術(shù)使得相當(dāng)多的研究和開發(fā)可以轉(zhuǎn)到放線菌屬的表達(dá)載體系統(tǒng)中。用于放線菌屬表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的例子是tipA，一種可被抗菌硫鏈絲菌肽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子[參考Murakami，T.，等，(1989)，J.Bacteriol，171，1459]。
用于治療高血脂的普伐他汀鈉具有能降低血清膽固醇的有用的藥學(xué)效果[參見Arai，等，(1988)，Ann.Rep.Sankyo Res.Lab.，40，1-38]。普伐他汀鈉最初由ML-236B鈉的微生物羥基化作用而生產(chǎn)，該ML-236B鈉由線性真菌柑青霉產(chǎn)生。該羥基化作用一般在放線菌Streptomyces Carbophilus存在下進(jìn)行。已證明引起羥基化作用活性的試劑是P-450sca類型的細(xì)胞色素(下文縮寫成“P-450sca”)[參考Serizawa，等，(1990)，Biochemicaet Biophy SicaActa，1084，35-40]。
Matsuoka等從鏈霉菌(StreptomycesCarbophilus)中純化了能催化ML-236B鈉在6位的羥基化作用的P-450sca細(xì)胞素。該P(yáng)-450 sca被表征為以三種形式存在，P-450sca-1，P-450sca.-2，和P-450sca-3[參見Matsuoka等，(1989)，Eur. J.Biochem，184，707-713和EP-A-0281245]，雖然還沒有證實(shí)這些是否代表同種型，或不同基因的產(chǎn)物。
Serizawa等從鏈霉菌中克隆并表達(dá)了編碼P-450sca-2的DNA[參見日本專利Kokai No.平6-70780和Watanabe，I等(1995)，Gene，163，81-85]。該DNA與P-450sca-2基因5’-非編碼區(qū)的1KbP部分一起被克隆到多拷貝質(zhì)粒PIJ702中，并用來轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌TK21(Streptomyces lividans TK21)。被轉(zhuǎn)化的變青鏈霉菌TK21比鏈霉菌(S.carbophilus)更快地將ML-236B轉(zhuǎn)變成普伐他汀鈉，從而證明1Kbp片段具有強(qiáng)啟動(dòng)子活性。沒有測(cè)定1Kbp5′-非編碼區(qū)序列。
同時(shí)也證實(shí)P-450sca的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄的底物誘導(dǎo)，即發(fā)現(xiàn)ML-236B和苯巴比妥將P-450的表達(dá)增強(qiáng)了30倍。這被RNA印跡所證明，RNA印跡發(fā)現(xiàn)在不存在ML-236B時(shí)無轉(zhuǎn)錄作用，但當(dāng)ML-236B鈉存在時(shí)發(fā)現(xiàn)三種轉(zhuǎn)錄物。底物存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)過六小時(shí)的時(shí)間增至最大速率。
編碼P-450sca-2的DNA長度為1233bp，而啟動(dòng)子區(qū)非常接近該長度，長度為l013bp，這使轉(zhuǎn)化作用比如果只有可讀框(ORF)被用于轉(zhuǎn)錄時(shí)相對(duì)更困難。然而減小這樣一個(gè)復(fù)合物的長度，底物誘導(dǎo)啟動(dòng)子則極可能使啟動(dòng)子變得無用。另外已成功地進(jìn)行了用包含ORF和1kbp區(qū)的載體對(duì)宿主的轉(zhuǎn)化，因此可以看出不需要縮短ORF或5′-非編碼區(qū)。
但時(shí)間延遲六個(gè)小時(shí)才能達(dá)到P-450的最大產(chǎn)生始終是一個(gè)問題，時(shí)滯是工業(yè)應(yīng)用的一個(gè)主要問題。發(fā)明目的因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在放線菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，其使蛋白質(zhì)在合適的表達(dá)系統(tǒng)中顯著地表達(dá)，而沒有必須由蛋白質(zhì)底物誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供在鏈霉菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，其使蛋白質(zhì)在合適的表達(dá)系統(tǒng)中顯著地表達(dá)，而不需要啟動(dòng)子底物誘導(dǎo)。
本發(fā)明進(jìn)一步目的是提供在放線菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，其使蛋白質(zhì)在合適的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行組成型表達(dá)，而不需要啟動(dòng)子底物誘導(dǎo)。
本發(fā)明進(jìn)一步目的是提供這種啟動(dòng)子全部或部分DNA序列；具有全部或部分這種啟動(dòng)子活性的DNA；包含這樣啟動(dòng)子的載體；被這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；用這樣的宿主細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的一個(gè)特別目的是提供一種通過使用宿主表達(dá)的重組P-450蛋白質(zhì)生產(chǎn)普伐他汀鈉的方法，其中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄由啟動(dòng)子調(diào)控。
本發(fā)明其它目的和優(yōu)點(diǎn)將在下文說明中變得顯而易見。發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)減小與編碼P-450sca-2的基因相關(guān)的5’-非編碼區(qū)的長度不僅出人意料地去除了ML-236B的底物增強(qiáng)作用，而且也提高了啟動(dòng)子的效用。
因此，一方面，本發(fā)明提供了具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的DNA，所述DNA對(duì)應(yīng)于部分而非全部鏈霉菌Streptonycescafbophilugs可讀框緊鄰的1kbp5’-非編碼區(qū)，所述可讀框編碼P-450細(xì)胞色素。
該DNA尤其優(yōu)選在至少一個(gè)鏈霉菌(Streptomyecscarbophilus)菌種中和/或在至少一個(gè)變青鏈霉菌(S.Lividans)菌株中具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性。附圖簡要說明

圖1是包含P-450sca-2基團(tuán)5’-非編碼區(qū)的428bp的質(zhì)粒pSCA1013-△(1013/428)的構(gòu)建方案；圖2是包含從P-450sca-2基團(tuán)的5’-非編碼區(qū)3’末端獲得的本發(fā)明的320，158，101和74bp啟動(dòng)子的質(zhì)粒[分別是pSCA10l3-△(1013/320)，pSCA10l3-△(1013/158)，pSCA1013-△(1013/101)和pSCA1013-△(1013/74)]的構(gòu)建方案；圖3是圖1中得到的質(zhì)粒pSCA1013-△(1013/428)的限制性酶切圖；圖4是包含部分P-450sca-2基因和1kpb5′啟動(dòng)子的質(zhì)粒pSCA101的限制性酶切圖；圖5是包含1kbp5’啟動(dòng)子和P-450sca-2ORF的質(zhì)粒pSCA205的構(gòu)建方案。本發(fā)明詳細(xì)說明本申請(qǐng)發(fā)明人已證實(shí)減小與鏈霉菌(S.carbophilus)P-450基因相關(guān)的5’-非編碼區(qū)，特別是與P-450sca-2基因相關(guān)的5’-非編碼區(qū)的大小對(duì)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的最大速率影響極小或沒有影響，大小的減小也能有利地消除底物誘導(dǎo)的需要。底物誘導(dǎo)的效應(yīng)是正效應(yīng)，因此期望去除該效應(yīng)以剩下僅啟動(dòng)基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。相反，縮短的啟動(dòng)子區(qū)作用明顯比與1kbp啟動(dòng)子相關(guān)的基礎(chǔ)水平更好。即使長度短至74bp，其與1kbp啟動(dòng)子相比仍具有有利的活性。
而且，減小長度的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄速率看來是必要的，這樣可立即獲得轉(zhuǎn)錄的高速率，而不是在暴露于ML-236B或另外合適的底物后不得不為產(chǎn)生表達(dá)的最大速率再等六小時(shí)的時(shí)間。這在工業(yè)上特別重要。
具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性并與P-450 ORF緊鄰的1kbp5’-非編碼區(qū)在這里也認(rèn)為是5’-啟動(dòng)子。特別地我們優(yōu)選與鏈霉菌(S.Carbophilus)的P-450 sca-2基因相關(guān)的啟動(dòng)子。
盡管5′-啟動(dòng)子被認(rèn)為長度是1kbp，這只是5′從ORF轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(tsr)延伸的區(qū)的大約的長度。tsr位于大約SEQ.ID.NO.1的384位，ATG起始密碼子緊接著428位。包含5′啟動(dòng)子的區(qū)域的末端是位于ORF上游1013bp的SacI位點(diǎn)。該區(qū)域的SacI位點(diǎn)是Watanabe等(上文)公開的，但他沒有測(cè)定5′啟動(dòng)子的長度。為了便于參考，在這里5′啟動(dòng)子被認(rèn)為是1kbp長度，而不是1013bp，因?yàn)檫@實(shí)際上是很正確的，不構(gòu)成本發(fā)明的必要特征，這在下文中將變得更明顯。在任何情況下，本發(fā)明啟動(dòng)子必須比5′啟動(dòng)子全長1013bp短。
與P-450sca-2基因相鄰的1kbp5′區(qū)不必需包含該基因的全部啟動(dòng)子區(qū)，但該區(qū)大小暗示其是包含的。事實(shí)上，根據(jù)我們已證明長度如74bp一樣短的區(qū)仍具有類似的或者比原1kbp5′啟動(dòng)子更好的活性，因此本發(fā)明啟動(dòng)子看來沒有占用完全定義的區(qū)。而且也有這種情況，即當(dāng)長度超過大約160bp，優(yōu)選300bp或更多時(shí)，本發(fā)明啟動(dòng)子具有顯著更好的啟動(dòng)子活性。
本發(fā)明DNA的啟動(dòng)子，這里也認(rèn)作是本發(fā)明啟動(dòng)子，相當(dāng)于1kbp5’啟動(dòng)子，前提是它們比5′啟動(dòng)子的1kbp長度更短。減短長度可以用任何合適的方法進(jìn)行，如用限制性內(nèi)切酶的方法去除一些部分，或者通過設(shè)計(jì)特異性的較短序列，或者從該序列的3′末端或5′末端進(jìn)行酶解作用，所述方法包括上述方法的結(jié)合。
應(yīng)該懂得為表現(xiàn)啟動(dòng)子活性，本發(fā)明啟動(dòng)子通常一般是雙鏈(ds)，雖然應(yīng)該理解本發(fā)明也設(shè)想任意一條組成本發(fā)明啟動(dòng)子的互補(bǔ)鏈。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明啟動(dòng)子的各部分或者最終被用來構(gòu)建本發(fā)明啟動(dòng)子的互補(bǔ)鏈中的一條或兩條的各部分。
我們特別發(fā)現(xiàn)5′酶解作用得到極好的結(jié)果，因此即使位于啟動(dòng)子序列3′末端的74bp部分也具有極高的活性。因此在一優(yōu)選實(shí)例中，本發(fā)明DNA相當(dāng)于被按5′→3′方面部分酶解的5′啟動(dòng)子。只要DNA仍具有所需的啟動(dòng)子活性，則不存在啟動(dòng)子DNA的最小長度。
盡管小于100bp長度的啟動(dòng)子可具有好的啟動(dòng)子活性，尤其是在3′末端，但在158和320bp之間的長度顯示出了活性的明顯提高。320bp片段具有比158bp片段大5倍左右的啟動(dòng)子活性。兩個(gè)片段都是1kbp5′啟動(dòng)子3′末端片段。啟動(dòng)子活性的這種差異對(duì)于本發(fā)明并不重要，因?yàn)?52bp(兩個(gè)長度上的差別)的長度對(duì)轉(zhuǎn)化或表達(dá)產(chǎn)生最小的影響。
如果本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員希望鑒定較大和較小活性之間發(fā)生轉(zhuǎn)變的啟動(dòng)子的精確長度，則所需方法完全簡單明了并且對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見的。但是鑒定這樣一長度沒有什么用途，因?yàn)樵谟?58bp和320bp作為啟動(dòng)子序列之間沒有實(shí)際的差別或優(yōu)點(diǎn)。
應(yīng)該明白通常優(yōu)選使用具有明顯高活性而不是較低活性的啟動(dòng)子，這樣可實(shí)現(xiàn)最大轉(zhuǎn)錄，但是也可能使用具有較高活性的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄速率是不期望地高，在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中耗盡了太多的宿主源。在這種情況下，則期望較小活性的啟動(dòng)子。
我們還證明存在一個(gè)為428bp和全部1kbp之間長度的啟動(dòng)子，其中失去了對(duì)底物誘導(dǎo)的依賴。盡管通過5′末端酶解獲得428bp特定長度，但完全有可能整個(gè)1kbp序列中任何428bp序列或相似序列均可同樣作為啟動(dòng)子。
如上所述，喪失對(duì)底物誘導(dǎo)的依賴是非常有利的。同時(shí)，發(fā)生這種情況的精確長度是不重要的。我們證實(shí)在底物誘導(dǎo)至少1小時(shí)后，428bp長度的啟動(dòng)子的活性相等于或者略高于5′啟動(dòng)子的全部活性。因此，小于原啟動(dòng)子一半長度的啟動(dòng)子運(yùn)作得至少和原啟動(dòng)子一樣好，而不需要底物誘導(dǎo)。這意謂著立即被促進(jìn)了其中表達(dá)速率是一個(gè)因素的任何過程。大于428bp的長度增加了操縱控制的難度，不利于使用者。此外，在某一點(diǎn)上，較長啟動(dòng)子又變得再次受底物誘導(dǎo)的支配，從而顯現(xiàn)不出任何由本發(fā)明較短啟動(dòng)子帶來的好處。
因此本發(fā)明DNA優(yōu)選這樣一個(gè)長度其證實(shí)啟動(dòng)子活性基本上相當(dāng)于或較大于5′啟動(dòng)子的320和/或428bp3′片段的啟動(dòng)子活性。具體地，我們優(yōu)選沒有長至受底物誘導(dǎo)支配的啟動(dòng)子的長度。
術(shù)語“底物誘導(dǎo)”是本領(lǐng)域公知的。實(shí)質(zhì)上，當(dāng)存在它們可作用的底物時(shí)，自然界通常只需要一些表達(dá)產(chǎn)物。在所述底物不存在時(shí)，生物體將通過表達(dá)產(chǎn)物而耗掉原料。因此在自然界形成了各種系統(tǒng)，而使得產(chǎn)物的表達(dá)只在底物存在下發(fā)生。
在P-450sca-2情況下，這通過底物如ML-236B的啟動(dòng)子位點(diǎn)作用誘導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄而達(dá)到。毫無疑問ML-236B是P-450sca細(xì)胞色素的天然底物。如果與可以誘導(dǎo)5′啟動(dòng)子的ML-236B不同，也可為其它底物，包括指定底物的那些。誘導(dǎo)5′啟動(dòng)子的適宜底物的另外的例子是上文所述的苯巴比妥。不管怎樣，5′啟動(dòng)子誘導(dǎo)物的準(zhǔn)確特性對(duì)于本發(fā)明并不重要，這里也將不再討論。
盡管本發(fā)明并不被理論約束，但出人意料地，似乎很可能是P-450sca-2細(xì)胞色素的底物的誘導(dǎo)以某種方式克服了轉(zhuǎn)錄上的一個(gè)阻礙。尤其是通過啟動(dòng)子5′末端的酶解的1kbp啟動(dòng)子區(qū)大小的減小，看來是用來去除這個(gè)阻礙。因?yàn)檫@個(gè)原因我們相信不存在一個(gè)重新開始底物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的特殊長度，在某一點(diǎn)后，啟動(dòng)子活性隨增長的長度而降低，因?yàn)橛稚闪宿D(zhuǎn)錄啟動(dòng)阻礙。底物誘導(dǎo)可能以直接與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)阻礙再生成正比的方式開始起作用，或者在一旦達(dá)到一定長度時(shí)才可能。在任何情況下，優(yōu)選由于增加長度超過500bp而未減小活性的啟動(dòng)子。換句話說，長度超過大約500bp，更尤其是超過428bp，且活性降低的啟動(dòng)子不是優(yōu)選的。
本發(fā)明DNA相當(dāng)于5′啟動(dòng)子的一部分或幾部分。術(shù)語“相當(dāng)”是指本發(fā)明DNA具有與5′啟動(dòng)子相似類型的啟動(dòng)子活性，這樣它可啟動(dòng)P-450sca細(xì)胞色素ORF的轉(zhuǎn)錄。這種啟動(dòng)發(fā)生的水平不是本發(fā)明的必要特征，本文說明了本發(fā)明啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性水平。如本文所述，應(yīng)該明白本發(fā)明啟動(dòng)子具有至少在某些方面比5′啟動(dòng)子更好的活性。
本發(fā)明啟動(dòng)子可以完全相當(dāng)于5′啟動(dòng)子的一部分或幾部分。在一簡單的實(shí)例中，5′啟動(dòng)子可被從5′末端消化，這樣所得本發(fā)明啟動(dòng)子具有與5′啟動(dòng)子剩下的3′部分相同的序列。如果5′啟動(dòng)子被從5′末端酶解，并且還通過內(nèi)切酶酶解和連接去除一部分，則所得本發(fā)明啟動(dòng)子完全相當(dāng)于5′啟動(dòng)子的有關(guān)的兩部分。在這兩個(gè)實(shí)施例中，所得啟動(dòng)子具有與5′啟動(dòng)子一部分或幾部分相同的序列。
本發(fā)明啟動(dòng)子一般具有一個(gè)或幾個(gè)與5′啟動(dòng)子序列相似或相同的序列。但是本發(fā)明啟動(dòng)子的核苷酸序列不需要完全相當(dāng)于5′啟動(dòng)子的核苷酸序列。盡管一般優(yōu)選的是本發(fā)明啟動(dòng)子與它們相關(guān)的5′啟動(dòng)子相關(guān)部分具有非常本質(zhì)的序列同源性，但這不是最重要的。只要求顯示必需的啟動(dòng)子活性。
本發(fā)明啟動(dòng)子可變化為從原始5′啟動(dòng)子而來，前提是所得啟動(dòng)子仍顯示出必需的啟動(dòng)子活性。通常，變化該序列并沒有獲得多大好處，并且不能保證改變堿基序列而不會(huì)破壞或減小啟動(dòng)子活性。但是，堿基序列的一定量修飾不可能具有明顯的效果，特別是當(dāng)它不被堿基序列需要用于編碼蛋白質(zhì)時(shí)。
堿基序列的修飾一般發(fā)生在轉(zhuǎn)化過程中，或者為了方便，例如引入一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。因此本發(fā)明通過例如缺失，倒位，插入或取代設(shè)計(jì)不同于與它們相關(guān)的5′啟動(dòng)子序列一部分或幾部分的啟動(dòng)子。自然發(fā)生的5′啟動(dòng)子序列的變化也可以發(fā)生在自然界。也設(shè)計(jì)了以這樣的變異體為基礎(chǔ)的本發(fā)明啟動(dòng)子。
序列中的其它不同和變化以及產(chǎn)生它們的方法對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見的，本發(fā)明設(shè)計(jì)了所有這些情況。以這種方式而不是以自然變異方式變化的本發(fā)明啟動(dòng)子在這里也認(rèn)為是突變體，這樣設(shè)計(jì)了突變體和變異體兩種。但是應(yīng)該明白，“相當(dāng)于緊鄰鏈霉菌(Streptomy CesCarbophilus)可讀框的1kbp 5′非編碼區(qū)的一部分但不是全部，所述可讀框編碼P-450細(xì)胞色素”的表述包括這些突變體和變體。
通常，在60℃ 6×SSC中，合適的突變體和變異體能與具有序列表中SEQ ID NO.1中的核苷酸序列1至428的DNA雜交。突變體和變異體與之雜交的DNA可能或沒有可能形成較長序列的一部分。
正如已經(jīng)討論的，本發(fā)明啟動(dòng)子具有比1kbp5′啟動(dòng)子更高的活性。這不一定意味著受本發(fā)明啟動(dòng)子啟動(dòng)支配的ORF轉(zhuǎn)錄水平比底物誘導(dǎo)的1kbp5′啟動(dòng)子啟動(dòng)的水平高。相反經(jīng)常是這種的情況，本發(fā)明啟動(dòng)子進(jìn)行的組成型啟動(dòng)(constitutive promotion)作用是保證蛋白質(zhì)活性水平在一小時(shí)后仍然比例如底物誘導(dǎo)1小時(shí)后用5′啟動(dòng)子獲得的那些還高，這種結(jié)構(gòu)生產(chǎn)比慢合成要優(yōu)選得多，例如，其接著達(dá)到超過被需要或有用的水平。
盡管本發(fā)明DNA對(duì)于P-450sca細(xì)胞色素是有用的，但應(yīng)明白它們可以與在任何合適的原核宿主中表達(dá)的任何合適的序列結(jié)合使用。尤其是，本發(fā)明啟動(dòng)子可被用在合適的放線菌宿主，尤其是鏈霉菌中。本發(fā)明啟動(dòng)子相當(dāng)于來自鏈霉菌(S.Carbophilus)的啟動(dòng)子的一部分或幾部分，因此如果本發(fā)明啟動(dòng)子能啟動(dòng)P-450sca細(xì)胞色素ORF的轉(zhuǎn)錄，則證明其具有所需的啟動(dòng)子活性。
從上述討論也應(yīng)明白，當(dāng)被操作性地連接至適宜ORF中時(shí)，進(jìn)一步提供了本發(fā)明的啟動(dòng)子。還提供了載體，如包含本發(fā)明啟動(dòng)子的質(zhì)粒，尤其當(dāng)啟動(dòng)子操作性地與ORF相關(guān)時(shí)，和包含這些體的宿主。
載體不一定必須是表達(dá)載體。其它載體可以用來增殖本發(fā)明啟動(dòng)子，或用來提供易于得到的文庫。但是優(yōu)選表達(dá)載體，特別優(yōu)選包括本發(fā)明宿主和表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)。
在放線菌被用作宿主細(xì)胞用于異源DNA產(chǎn)物的表達(dá)時(shí)，一般優(yōu)選使用變青鏈霉菌。在P-450sca細(xì)胞色素，特別是P-450sca-2的情況下，變青鏈霉菌還表達(dá)必需的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來允許細(xì)胞色素參與ML-236B羥基化作用。然而任何其它合適的蛋白質(zhì)或表達(dá)產(chǎn)物也可以通過包含本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。
一般不優(yōu)選在原核生物如變青鏈霉菌中表達(dá)真核DNA，因?yàn)樵谡婧松镏凶匀话l(fā)生的一些翻譯后的過程不在原核生物中發(fā)生，例如糖基化作用。但這并不阻止真核產(chǎn)物在本發(fā)明系統(tǒng)中表達(dá)，前提是應(yīng)明白除非被提供必要條件，否則任何不在表達(dá)系統(tǒng)中自然發(fā)生的所需翻譯后修飾都將不發(fā)生。
本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)尤其有用于大量表達(dá)原核表達(dá)產(chǎn)物。如果多拷貝質(zhì)粒如pIJ702被用在表達(dá)系統(tǒng)中，則表達(dá)產(chǎn)物可以更大量生產(chǎn)。
本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)尤其特別有用于正常情況下只是在底物誘導(dǎo)之后表達(dá)的產(chǎn)物的表達(dá)。這種表達(dá)系統(tǒng)可以用在一些物質(zhì)如抗生素的生產(chǎn)過程中。例如當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物具有將底物轉(zhuǎn)化或終產(chǎn)物或轉(zhuǎn)化成較后期的中間產(chǎn)物甚至斷裂底物的活性時(shí)，這樣的方法是可能的。該方法可以包括，如果合適的話，將表達(dá)系統(tǒng)與生產(chǎn)將要被作用的底物的系統(tǒng)一起培養(yǎng)。
在本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物是底物正常誘導(dǎo)的情況下，與產(chǎn)生表達(dá)系統(tǒng)的底物的共同培養(yǎng)一般將受時(shí)滯支配，因此必需等待表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)足夠的表達(dá)產(chǎn)物。使用本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)，這將不再成為問題，因?yàn)楫a(chǎn)物是系統(tǒng)自動(dòng)合成的，不需要底物誘導(dǎo)，因此減小了時(shí)滯因素。
應(yīng)該明白本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)特別適用于P-450細(xì)胞色素，尤其是P-450sca細(xì)胞色素，更特別是P-450sca-2細(xì)胞色素的表達(dá)。如上所述，P-450sca-2由鏈霉菌(S.Car bophilus)表達(dá)。在普伐他汀鈉的生產(chǎn)中，將鏈霉菌(S.Carbophilus)與柑桔青霉有益地共培養(yǎng)。在該系統(tǒng)中，P-450sca-2用于將柑桔青霉表達(dá)的底物ML-236B羥基化，但只是在ML-236B誘導(dǎo)P-450sca-2轉(zhuǎn)錄的一段延遲后。使用本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)，在普伐他汀鈉的生產(chǎn)中不再需要一時(shí)滯期。這時(shí)普伐他汀鈉的工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)生了很大益處。
下面是本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例。
本發(fā)明優(yōu)選啟動(dòng)子與具有SEQ ID NO.1核苷酸序列1至428或1至320的DNA雜交。
優(yōu)選具有SEQ ID NO.1核苷酸序列1至428的啟動(dòng)子。也優(yōu)選具有SEQ ID NO.1核苷酸序列1至320的啟動(dòng)子。本發(fā)明進(jìn)一步提供這些啟動(dòng)子的突變體和變異體。
也提供了包括本發(fā)明啟動(dòng)子的重組DNA載體，特別地，這些載體進(jìn)一步包括在啟動(dòng)子調(diào)控下編碼所需多肽的DNA，其中載體能在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽。優(yōu)選多肽為細(xì)胞色素P-450sca-2。
本發(fā)明也提供了被這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是放線菌，特別是變青鏈霉菌。特別優(yōu)選的是變青鏈霉菌SANK62795(FERMBP-5299)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)如上所定義的所需多肽的方法，該方法包括在允許生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)如上定義的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來生產(chǎn)多肽，并回收多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)普伐他汀鈉的方法，包括在含有ML-236B鈉的培養(yǎng)基中，在允許產(chǎn)生細(xì)胞色素P-450sca-2，并允許ML-236B鈉在被轉(zhuǎn)化細(xì)胞中通過本文產(chǎn)生的細(xì)胞色素P-450sca-2的催化作用轉(zhuǎn)化成普伐他汀鈉的條件下，培養(yǎng)被編碼P-450sca-2的本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的變青鏈霉菌菌株TK21。然后從所述轉(zhuǎn)化物和/或所述培養(yǎng)基中回收普伐他汀鈉。被轉(zhuǎn)化菌株優(yōu)選為變青鏈霉菌SANK 62795(FERM BP-5299)。也優(yōu)選由與所述菌株共培養(yǎng)的柑桔青霉生產(chǎn)的ML-236B。
5′啟動(dòng)子與任何已知的來自放線菌或任何其它來源的啟動(dòng)子是不同源的。一般對(duì)于其它啟動(dòng)子，本發(fā)明啟動(dòng)子導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)或多肽的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的開始。這是蛋白質(zhì)或多肽(這些名詞在本文可以互換)的細(xì)胞內(nèi)生物合成的第一部分。因此本發(fā)明啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，這一功能被稱為轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性。5′啟動(dòng)子，以及具有SEQ ID.NO.1的428，320，158.101和74bP的序列的啟動(dòng)子均具有這種活性。
應(yīng)該明白本發(fā)明啟動(dòng)子可以具有一個(gè)或多個(gè)在上游和/或下游串聯(lián)連接的另外的堿基對(duì)。這些另外的序列最好被限制，因?yàn)榛玖康牡孜镎T導(dǎo)將不會(huì)被再引入，還因?yàn)橛杏昧康膯?dòng)子活性應(yīng)該被保留。
本發(fā)明啟動(dòng)子調(diào)控下的多肽可以如上文所述。應(yīng)該明白它們可以具有任何氨基酸序列，如，例如天然，變異體或聚合物形式的新的或已知蛋白質(zhì)；兩種或多種不同蛋白質(zhì)的融合形式；或新設(shè)計(jì)的多肽。如上所述，優(yōu)選的多肽是細(xì)胞色素P-450sca-2。
關(guān)于載體，應(yīng)該明白要被轉(zhuǎn)化的載體應(yīng)該是在合適的宿主細(xì)胞中能自我復(fù)制的載體。因此，該載體應(yīng)該包含自我復(fù)制序列或復(fù)制子。在為放線菌情況下，優(yōu)選載體是pIJ702。
關(guān)于宿主，除適合于被選擇的載體外沒有特別限定。通常，可以使用任何宿主細(xì)胞，如野生收集的，或者可通過購買或轉(zhuǎn)讓得到的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是放線菌，優(yōu)選放線菌(StreptomycesCarbophilus)或變青鏈霉菌，更優(yōu)選變青鏈霉菌菌株TK21。
在如上所述的制備普伐他汀鈉的方法中，包括在ML-236B鈉存在下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的變青鏈霉菌菌株，用已知方法回收所得普伐他汀鈉。
在一簡單的實(shí)例中，本發(fā)明啟動(dòng)子可以通過利用Watana be等[Gene，(1995)，163，81-85]的方法克隆來自鏈霉菌(Streptomyces Carbophilus)的DNA而獲得。優(yōu)選的本發(fā)明啟動(dòng)子能從其中克隆的鏈霉菌Streptomycescarbophilus菌株是鏈霉菌Sereptomycescarbophilus SANK 62585 (FERM BP-1145)。
在本發(fā)明實(shí)例中，可用例如PUC18(由Takara ShuzoLtd.，Japan獲得)作為克隆載體，從鏈霉菌(Streptomyces Carbophilus)的整個(gè)基因組DNA制備基因組文庫。應(yīng)該明白這些文庫和載體構(gòu)成本發(fā)明的一部分。然后可以例如預(yù)測(cè)的P-450sca-2 N-末端氨基酸順序?yàn)榛A(chǔ)合成寡核苷酸探針。然后該核苷酸探針可被用來識(shí)別來自編碼至少一部分P-450sca的文庫的克隆。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)N-末端由ORF 5′末端編碼，因此很可能用該方法識(shí)別的任何克隆也將具有明顯量的5′未翻譯和非編碼區(qū)，5′啟動(dòng)子就位于該區(qū)。使用該文庫和寡核苷酸探針的合適的篩選方法是菌落雜交方法[參見Maniatis，T等，(1982)，“Molecular Cloning-ALaboratory Manual”，Cold SpringHarbor Laboratory，New York-本文涉及的不能通過任何特定參考書獲得的任何方法將被一般性地描述在“Molecalar Cloning-A LaboratoryManual”中。
即使被該方法或任何其它方法識(shí)別的克隆只包含本發(fā)明啟動(dòng)子的一部分，仍可以獲得全克隆。標(biāo)記探針可以從只包含一部分所需DNA的克隆制備。然后該標(biāo)記探針可被用作進(jìn)一步篩選基因組文庫的模板，以識(shí)別和分離包含至少與所需的一樣多的5′啟動(dòng)子的克隆。
應(yīng)該明白本發(fā)明設(shè)計(jì)分離了包含整個(gè)或只有部分5′啟動(dòng)子的克隆。為了獲得本發(fā)明啟動(dòng)子，如果得到了整個(gè)序列，那么這可通過例如亞克隆而被進(jìn)一步加工。如果得到部分序列，則也可以象對(duì)整個(gè)序列一樣對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步加工，或者在序列沒有任何實(shí)質(zhì)性變化時(shí)，其可足以作為本發(fā)明啟動(dòng)子。
應(yīng)該進(jìn)一步明白，上面建議的克隆和制備本發(fā)明啟動(dòng)子的方法不是可以使用的唯一方法，其它合適的方法對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見的?？梢愿淖?nèi)魏尾襟E，或者甚至整個(gè)方法。例如可以使用由5′啟動(dòng)子3′末端制備的探針而不是使用相當(dāng)于P-450sca-2N-末端序列的探針。載體沒有特別限定，可以使用任何合適的克隆載體，如其它商業(yè)上可得到的載體，包括pBR322。
根據(jù)本發(fā)明，還應(yīng)該明白可以使用SEQ.ID NO.1給出的信息，化學(xué)合成本發(fā)明啟動(dòng)子。如果本發(fā)明啟動(dòng)子是要化學(xué)合成的話，則可以通過例如亞磷酸三酯的方法進(jìn)行[參考Hunkapillar，M等，(1984)，Nature，310，105-111]。也可使用半合成方法，例如使用克隆技術(shù)和使用本文給出信息的基因工程方法的結(jié)合。這種半合成的適宜的方法是本領(lǐng)域公知的。
回到原來說明的通過篩選文庫獲得本發(fā)明啟動(dòng)子的方法，啟動(dòng)子DNA能用本領(lǐng)域熟練人員公知的方法從含有所需序列的克隆中得到[參考Maniatis T等，(1982)，上文]。例如，例如通過使用一種或幾種限制性酶可以分離質(zhì)粒DNA部分，并從可質(zhì)粒DNA中分離啟動(dòng)子。
用作5′啟動(dòng)子來源的優(yōu)選菌株是變青鏈霉菌SANK62795。根據(jù)微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，該菌株于1995年11月21日保藏于National Institute of Bioscienceand Human Technology Agency ofIndustrial Science and Technology，保藏登記號(hào)為FERM BP-5299。變青鏈霉菌SANK62795是包含重組DNA載體pSCA1013-△(1013/428)的放線菌，所述載體反過來包含具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的DNA，并且由序列表中SEQID NO.1的核苷酸序列1至428與編碼細(xì)胞色素P-450sca-2的DNA一同組成。所述質(zhì)粒能在放線菌細(xì)胞中通過428bp啟動(dòng)子的活性生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
在所附序列表中，SEQ.ID.NO.1的來源是登記號(hào)為FERMBP-1145的鏈霉素(S.Carbophilus)SANK62585。這是本發(fā)明較短的啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)的1kbp 5′啟動(dòng)子的初始來源，并根據(jù)微生物保藏的布達(dá)佩斯條約于1985年9月5日保藏在Fermentation Research InstituteAgency of Industrial Science andTechnology。
變青鏈霉菌62795和鏈霉菌(S.Carbophilus)62585分別是變青鏈霉菌和鏈霉菌(S.Carbophilus)的典型例子，可以按照Hopwood，D.A.等，(1985)，“GeneticManipulation of StfeptomycesALaboratory Manual”，The John InnesFoundation，Norwich，UK中說明的方法培養(yǎng)，該文獻(xiàn)也描述了這些菌株的典型的物理屬性。這兩菌株由于抗硫鏈絲菌肽而被選擇。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，通過培養(yǎng)變青鏈霉菌SANK62795，接著從細(xì)胞中回收PSCA1013-△(1013/428)，并用限制性酶酶解質(zhì)粒來分離具有序列表中SEQ.ID.NO.1核苷酸序列1至428的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
如果需要，可以通過例如Maxam-Gilbert化學(xué)修飾方法[參考Maxam，A.M.，和Gilbert，W.(1980)，Methods in Enzymology，65，499-599]或者使用M13噬菌體的雙脫氧鏈終止方法[參考Messing，J.，和Vieira，J.，(1982)，Gene，19，269-276]測(cè)定任何克隆的DNA的核苷酸順序。
如果想要確定一個(gè)特定的DNA序列是否與包含序列表SEQ IDNO1的核苷酸序列1-428的全部或部分的DNA雜交，則可以按下述方法測(cè)定。
具體地，必需首先將要測(cè)試的DNA在瓊脂糖凝膠上電泳，然后將其印跡在硝酸纖維素或尼龍膜，接著通過熱處理或紫外照射將吸附的DNA固定在膜上。然后使用探針。該探針具有SEQ.ID.NO.1核苷酸序列1至428的所期望的長度，并用例如放射性元素如32P，生物素，洋地黃毒苷或酶標(biāo)記，而且一般根據(jù)隨機(jī)引物方法[參考Feinberg，A.P.等，(1983)]，Anal.Biochem.，132，6-13]或切口平移方法[參考Maniatis T，等，(1982)，上文]制備。
將硝基纖維素或尼龍膜浸在含有探針的雜交溶液中，然后在合適的預(yù)定溫度下，如60℃ ，保溫。保溫后沖洗膜，并用適于所用標(biāo)記的方法檢測(cè)探針。
雜交溶液通常含有SSC(檸檬酸鈉水溶液，含有0.15M氯化鈉和15mM檸檬酸鈉去離子水溶液的1×SSC)。雜交溶液中SSC的濃度優(yōu)選4-8×SSC，更優(yōu)選6×SSC。保溫溫度優(yōu)選30至70℃，更優(yōu)選60℃。
與具有序列表SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列1至428的全部或部分雜交的DNA可以用公開的方法從各種基因組文庫中克隆。應(yīng)該明白本發(fā)明多數(shù)啟支子與具有428序列而不是320或其它更短序列的DNA雜交，但選擇用于雜交實(shí)驗(yàn)的序列的長度可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員利用本文所給的信息容易地選擇。
如上所述，本方法得到的DNA可以用本領(lǐng)域公知的方法人為修飾，如通過例如位點(diǎn)特異性突變[參考Mark，D.F，等(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5662-5666]在所需位點(diǎn)取代，缺失或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸。應(yīng)該明白本發(fā)明延伸到這種DNA，前提是其具有需的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性。
為了證明按上述方法獲得的DNA具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性，構(gòu)建包含與ORF串聯(lián)連接的DNA的載體并在合適宿主中表達(dá)。首先(i)構(gòu)建重組DNA載體，其中編碼合適蛋白質(zhì)的DNA被操作性地與推斷啟動(dòng)子DNA連接，并插入到合適的載體如放線菌質(zhì)粒pIJ702中[參考Katz，E，等，(1983)，J.Gen.Microbiol.，129，2703-2714]，然后，(ii)將允許載體穩(wěn)定復(fù)制的合適宿主細(xì)胞，如在由pIJ702構(gòu)建的載體情況下為變青鏈霉菌，用載體轉(zhuǎn)化，然后確定由編碼DNA編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
在上述技術(shù)中，當(dāng)轉(zhuǎn)化物是例如鏈霉菌時(shí)，可以根據(jù)Hopwood等[參考Hopwood，D.A.，等，(1985)，“GeneticManipulation of StreptomycesALaboratory Manual”，The John InnesFoundation，Norwich，UK]的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。應(yīng)該明白，用來測(cè)定啟動(dòng)子活性的基因在轉(zhuǎn)化之前，一般不應(yīng)在宿主中存在或表達(dá)。
轉(zhuǎn)錄的水平可以通過例如RNA印跡法容易地被確定。在RNA印跡法或RNA雜交中[參考Maniatis，T，等，上文］，轉(zhuǎn)化后將宿主細(xì)胞培養(yǎng)。然后從細(xì)胞中提取并純化RNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電脈，然后將RNA印跡到例如硝基纖維素或尼龍膜上。探針(DNA，RNA或合成的寡核苷酸)可以用放射同位素，如32P，生物素，洋地黃毒苷或用特異性檢測(cè)蛋白質(zhì)基因的酶標(biāo)記。然后通過雜交，用該探針檢測(cè)從該基團(tuán)轉(zhuǎn)錄的mRNA。
轉(zhuǎn)錄水平也可用RNA-PCR[Polymerase ChainReaction，參考Innis，M.A.等，(1990)，“PCR PROTOCOLS”，Academic Press，NewYork]容易地測(cè)定。首先用類似于RNA雜交的方法制備RNA。然后用逆轉(zhuǎn)錄酶從作為模板的mRNA合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄可以使用趨于非特異性的寡(dT)，或具有與編碼表達(dá)蛋白質(zhì)的基因的一部分同源的序列的寡核苷酸作為模板。使用該c DNA為模板，可以通過使用兩個(gè)寡核苷酸引物來進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。這些引物與ORF反鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，并且與它們互補(bǔ)的位點(diǎn)在基因中具有不同的位置，因此由PCR產(chǎn)生的鏈能夠相互雜交。反應(yīng)進(jìn)行至給定時(shí)間后，將所得ds DNA進(jìn)行電泳并在硝基纖維素膜上檢測(cè)，例如，以存在或不存在期望長度的電泳帶為基礎(chǔ)，測(cè)定所需DNA的轉(zhuǎn)錄水平。
通過測(cè)定產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的生理活性可以確定產(chǎn)物表達(dá)的水平。因此例如可以制備重組DNA載體，其中將編碼具有指定活性的蛋白質(zhì)，例如酶的DNA如通過連接操作性地連到推斷啟動(dòng)子的3’-末端。與推斷啟動(dòng)子相連的ORF的表達(dá)水平可接著用宜于產(chǎn)物表達(dá)的方式來測(cè)定。
在這種質(zhì)粒編碼細(xì)胞色素P450 sca-2，并且質(zhì)粒與變青鏈霉菌相容的情況下，那么可將質(zhì)粒引入不產(chǎn)生P-450 sca-2的變青鏈霉菌菌株中，接著在ML-236B鈉存在下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體。產(chǎn)生的普伐他汀鈉的量是由推斷啟動(dòng)子啟動(dòng)的P-450 sca-2表達(dá)水平表征。
應(yīng)該理解表達(dá)產(chǎn)物的分析方法可特異性地設(shè)計(jì)來適合相關(guān)的產(chǎn)物。例如推斷啟動(dòng)子可被操作性地連接到抗藥基因上，如乙酰氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因[c.f.Gorman，C.M.，et al.，(1982)，MOL.Cell.Biol.，2，1044-1051]，或熒光素酶基因[c.f.dewet. J.R.，etal.，(1987)，Mol. Cell.Biol.，7，725-737]，這些基因可通過本領(lǐng)域熟知的方法測(cè)定。還可采用借助于表達(dá)產(chǎn)物的活性的其它分析表達(dá)的方法。
測(cè)定表達(dá)的另一方法是例如通過使用適宜的抗體來識(shí)別產(chǎn)物，再次制備包含操作性連接到ORF上的推斷啟動(dòng)子的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到適宜的宿主中，并在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)。
將培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的勻漿暴露在抗體中，測(cè)定抗原-抗體復(fù)合物的量。適宜的測(cè)定技術(shù)包括放射免疫分析法[C.f.Berson，R.s.，etal，(1973)，“Methods in Investigativeand Diagnostic Endocrinology”，Vol.2A，2B，North-Holl and Publishing Co.，Amsterdam]，酶免疫測(cè)定法[C.f.Engvall，E.，(1980)，Method in Enzymology，70(A)，419-439]，Western印漬[c.f.Harlow，E.，et al.，(1988)，“Antibodies -ALaboratory Manual”，P.471，ColdSpring Harbor Laboratory，New York]和免疫沉淀[C.f.Ressler，S.W.，et al.，(1981)，“Methods in Enzymology”，73(B)，442-459]，它取決于希望如何來測(cè)定相互作用和抗體或抗原是否以任一方標(biāo)記。在任何情況下，應(yīng)該理解現(xiàn)在討論的這些方法并不是包羅無遺的，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來講，其它方法也將是顯而易見的。
還應(yīng)該理解，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來講，本發(fā)明推斷或?qū)嶋H啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的許多其它測(cè)定方法都是易于獲得和顯而易見的，本發(fā)明包括所有這些方法。例如，需表達(dá)的蛋白質(zhì)具有除活性或抗原性外的特征特性，還可用通過這樣一種特性的測(cè)定方法直接或間接測(cè)定，例如活性。
一旦已確定將要用作本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA具有啟動(dòng)子的必需活性，那么它可被采用來構(gòu)建任何適宜的所需蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。任何適宜的宿主可被用于此目的，該宿主可與用來確定DNA是否確實(shí)具有啟動(dòng)子活性的宿主相同或不同。蛋白質(zhì)不局限于它的序列，可具有任何氨基酸序列。如上所述，該序列可選自，但不局限于新的或已知蛋白質(zhì)(或肽)的天然，變體或聚合物形式；兩種或多種不同蛋白質(zhì)(或肽)的融合形式；或新設(shè)計(jì)的多肽。如前面提到的，細(xì)胞色素P-450sca-2是優(yōu)選的表達(dá)產(chǎn)物，適宜載體為pSCA1013-△(1013/428)，該載體從變青鏈霉菌(Streptomyces Lividans)SANK 62795(FERM BP-5299)中分離。
應(yīng)該理解術(shù)語“表達(dá)產(chǎn)物”，“蛋白質(zhì)”和“多肽”通?？梢曰Q，在本文被以這種意義使用。在某些情況下，從原始DNA轉(zhuǎn)譯而來的多肽不是最終產(chǎn)物，只是最終產(chǎn)物的中間形式，需要轉(zhuǎn)譯后修飾來獲得所需產(chǎn)物。在P-450sca-2的情況下，需要將鐵結(jié)合到蛋白質(zhì)中的血紅素環(huán)中以產(chǎn)生最終的表達(dá)產(chǎn)物。因此，雖然在本文中同義地使用術(shù)語“表達(dá)產(chǎn)物”，“蛋白質(zhì)”和“多肽”，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到在相應(yīng)的上下文中的這些術(shù)語之間的差別。
除放線菌外，本發(fā)明啟動(dòng)子的適宜宿主的實(shí)例包括原核生物，如大腸桿菌和枯草桿菌。
在非放線菌菌株被用作宿主，或選擇的放線菌菌株不適合于載體類型時(shí)，應(yīng)該理解為載體應(yīng)包括適于討論菌株的復(fù)制子，例如起源于與宿主相容的種類的復(fù)制子。需要包含適宜于宿主的復(fù)制起點(diǎn)和調(diào)節(jié)序列的質(zhì)粒載體。在本發(fā)明的啟動(dòng)子不能在特殊宿主中工作，甚至在存在其它適宜控制序列的情況下，也不能容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員修飾而使其工作的情況下，那么這種情況可能具有被限定的用途。例如，這種情況可能在倍增啟動(dòng)子中有用。應(yīng)該理解，在這種修飾和/或適宜的控制序列易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得和/或識(shí)別時(shí)，這種情況則被本發(fā)明所包括。
雖然除指定宿主中的表達(dá)所需的那些外本發(fā)明的表達(dá)載體，不需要任何其它特性，但應(yīng)該理解固定的選擇標(biāo)準(zhǔn)能是有用的。這些標(biāo)準(zhǔn)包括質(zhì)粒借此將特性如表達(dá)和轉(zhuǎn)化的選擇性授予宿主，從而使表型被修飾的那些。
適宜的使用放線菌的轉(zhuǎn)化方法包括使用溶菌酶使放線菌培養(yǎng)物形成原生質(zhì)球。為了將載體引入宿主細(xì)胞，接著加入含有重組DNA載體和聚乙二醇的緩沖溶液，例如通過Thompson或Hopwood的方法[C．f．Thompson，C．J.，et al.，(1982)，J．Bactefiol.，151，668-677或Hopwood，D.A.，et al.，(1985)，“GeneticManipulation of StreptomycesALaboratory Manual”，The John InnesFoundation，Norwich]?？沽蜴溄z菌肽基團(tuán)通常作為轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記[C.F.Hopwood，D.A.，et al.，(1987)，“Methods in Enzymology”153，116，Academic Press，New York]，但本發(fā)明不限于此。
如果為了在控制本發(fā)明啟動(dòng)子的條件下表達(dá)產(chǎn)物而需要轉(zhuǎn)化大腸桿菌，那么通常適宜的方法是將相關(guān)的重組DNA載體加入到感受態(tài)細(xì)胞中。通常在鹽，如氯化鈣，氯化鎂和氯化銣存在的情況下制備感受態(tài)細(xì)胞[C.F.Hanahan，D.，(1983)，J.Mol.Biol.166557-580]。另一種方法包括電穿孔，它包括將高壓脈沖用于包含宿主E.Coli和表達(dá)載體的懸浮液中，從而致使載體摻入到細(xì)胞中[C.f.ElectroporationDower，W.J.，et al.，(1988)，Nucleic Acid Res.，16，6127和Calvin，N.M.et al.，(1988)，J.Bacteriol.，170，2796]。
適宜的選擇性標(biāo)記，即在宿主上授予特定表型的那些，包括抗藥標(biāo)記基團(tuán)，如授予抗青霉素或四環(huán)素抗性的那些標(biāo)記。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來講，許多都是顯而易見的，本發(fā)明作為提供特定實(shí)施例的所有其它情況不因此而被限制。
在枯草桿菌被打算作為宿主細(xì)胞的情況下，適宜的方法是使用溶菌酶讓宿主細(xì)胞成為原生質(zhì)體。接著含有重組DNA載體如聚乙二醇的緩沖溶液加入到原生質(zhì)體中，再通過電穿孔(上文)將載體摻入宿主細(xì)胞中[C.f.Cheng.S.，et al.，(1979)，Mol. Gen. Genet.，168，111]。在一優(yōu)選實(shí)例中，一種抗藥標(biāo)記，和抗氯霉素的標(biāo)記被用作轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的選擇性標(biāo)記，但應(yīng)明白也可以使用很多其它的選擇性標(biāo)記。
與宿主無關(guān)，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法使用由培養(yǎng)物通過細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外或兩種情況而產(chǎn)生的所需多肽培養(yǎng)所需轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基可適當(dāng)?shù)剡x自通常用于相關(guān)宿主細(xì)胞的各種類型的培養(yǎng)基。一般來說，對(duì)于特定宿主正常情況下可接受的那些培養(yǎng)條件也可用于所需多肽的表達(dá)，例如由多肽的性質(zhì)所要求的任何修飾而決定。
例如典型的放線菌的營養(yǎng)包括用作碳源的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、淀粉漿、糖漿、豆油。作為氮源、豆粉、小麥胚、肉膏、胨、玉米浸泡液、干酵母和硫酸銨是適宜的。除上面外，無機(jī)鹽如氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈣或磷酸鈣以及如果需要也可以適宜地結(jié)合使用用于促進(jìn)微生物生長或促使所需多肽產(chǎn)生的添加劑。
而且，普遍適宜于討論宿主的培養(yǎng)方法也適用于轉(zhuǎn)化微生物，包括適合于工業(yè)化生產(chǎn)的如液體培養(yǎng)的深層培養(yǎng)方法。
除非本文另外一般性的相反說明或特指，我們優(yōu)選的培養(yǎng)條件包括20-37℃之間的溫度，優(yōu)選26-28°之間。
在控制本發(fā)明啟動(dòng)子的條件下，表達(dá)產(chǎn)物通常在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，偶爾在兩種情況下產(chǎn)生?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法，尤其是根據(jù)多肽物理或化學(xué)性質(zhì)的那些方法分離，純化和回收產(chǎn)物。在外表達(dá)多肽的情況下，可通過離心培養(yǎng)基，例如除去細(xì)胞，從產(chǎn)生的上清液分離，純化和回收多肽。
為了分離和純化積累在細(xì)胞內(nèi)的多肽，首先將細(xì)胞懸浮于含有蛋白酶抑制劑的溶液中，接著用如本領(lǐng)域技術(shù)人員共知的方法，例如超聲勻漿器來勻漿。
雖然一般不需要解釋本發(fā)明，但應(yīng)該理解所需蛋白質(zhì)的分離，純化和收集的具體方法的實(shí)例包括蛋白質(zhì)沉淀，超濾，分子篩層析(凝膠過濾)，吸附層析、離子交換層析、親和層析、各種適宜類型的液相色譜，包括高效液相色譜(HPLC)，透析以及它們的結(jié)合方法。
在任何情況下，應(yīng)該理解利用本發(fā)明可容易地在工業(yè)規(guī)模上，高產(chǎn)量，高純度地制備所需化合物。
還應(yīng)該理解，可通過使用未純化或部分純化的制備樣品分析本發(fā)明轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽的活性。P-450sca-2可以上述方式從變青鏈霉菌獲得，并直接用在例如普伐他汀鈉的產(chǎn)生中。必需的電子運(yùn)輸系統(tǒng)存在于變青鏈霉菌細(xì)胞中，因此相對(duì)直接獲得催化ML-236B鈉的6位上的羥基化作用的轉(zhuǎn)化宿主微生物。
在本發(fā)明的具體例中，啟動(dòng)子一般用來幫助細(xì)胞色素的表達(dá)，但這還可用于產(chǎn)生例如普伐他汀鈉。通過該方法產(chǎn)生的任何普伐他汀鈉可接著通過Serizawa，et al.，的方法回收[C.f.Serizawa，N.，et al.，(1983)，J.Antibiotics，36，608].變青鏈霉菌SANK 62795(FERM BP-5299)可以這種方式使用。
現(xiàn)將參考下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，實(shí)施例只是說明，而不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行約束。沒有特定說明的任何方法，制劑，溶液等等均可在“Molecular Cloning-A LaboratoryHandbook”(上文)中找到。所有溶液均為含水的，除非另有說明。
在下面實(shí)施例中，我們證實(shí)了使用本發(fā)明的啟動(dòng)子可在宿主微生物中產(chǎn)生所需多肽。實(shí)施例1
分離P-450 sca-2啟動(dòng)子和構(gòu)建表達(dá)的細(xì)胞色素P-450sca-2的質(zhì)粒載體(1-1)構(gòu)建質(zhì)粒pSCA101和pSCA108通過克隆包含P-450sca-2基因和啟動(dòng)子的區(qū)的不同片段構(gòu)建質(zhì)粒pSCA101和pSCAl08，這些片段用根據(jù)Watanabe和他的同事描述的方法從Stfeptomyces cafbophilus的基團(tuán)因組DNA衍生而來[C.f.Watanabe，I.，et al.，(1995)，Gene，163，81-85和日本專利
發(fā)明者渡邊一郎, 芹澤伸記 申請(qǐng)人:三共株式會(huì)社