專利名稱：山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法。
背景技術：
卵母細胞又稱為卵子，是一個新的生命個體發(fā)生發(fā)育的前提和基礎。隨著現(xiàn)代生命科學的發(fā)展，卵母細胞是家畜新品種培育、轉(zhuǎn)基因育種和品種改良等方面的重要的材料。對于人類生殖健康而言，卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)是試管嬰兒誕生的基礎。因此，卵母細胞的體外培養(yǎng)技術是現(xiàn)代生殖發(fā)育的核心技術。卵母細胞在體內(nèi)存在于卵巢上，出生后的動物卵巢上存在的卵母細胞停滯于生發(fā)泡(germinal vesicle, GV)期，不再增殖且數(shù)量有限，伴隨著年齡的增長，數(shù)量不斷減少，并最終枯竭，卵母細胞的體內(nèi)發(fā)生發(fā)育特點也就決定了卵子的稀有珍貴。在正常生長發(fā)育的情況下，卵母細胞外周包裹有大量的卵丘細胞，卵丘細胞在卵母細胞開始形成時就已顆粒細胞的形式存在，伴隨著卵母細胞的生長和發(fā)育，其數(shù)量逐步增多，并且在卵母細胞生長發(fā)育的過程中，分泌各種物質(zhì)，同卵母細胞進行物質(zhì)和信息的交換，從而調(diào)控卵母細胞的發(fā)生發(fā)育，因此，卵丘細胞在卵母細胞外圍的存在質(zhì)量將直接影響卵母細胞發(fā)育的狀態(tài)和結果。維甲酸(retinoic acid, RA)是體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物，主要影響骨的生長和促進上皮細胞增生、分化、角質(zhì)溶解等代謝作用，在臨床實踐中常用于治療尋常痤瘡、銀屑病、魚鱗病、扁平苔癬、毛發(fā)紅糠疹、毛囊角化病、鱗狀細胞癌及黑色素瘤等疾病。凋亡是細胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應答有序變化的死亡過程，細胞過度凋亡會引起機體組成的組織或器官退化。在卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)過程中，一定濃度的RA能夠抑制卵母細胞外周卵丘細胞的凋亡，將為卵丘細胞的體外發(fā)育調(diào)控奠定基礎，也為卵母細胞的高質(zhì)量生產(chǎn)提供平臺
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法。為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是:山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法，包括以下步驟:
(I)卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養(yǎng)
卵巢采集于屠宰場宰殺后的山羊，分離出2 8_卵泡中的卵丘卵母細胞復合物；挑取有3 5層致密卵丘包裹的卵母細胞用于成熟培養(yǎng)；挑取的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)操作液清洗后，置于成熟液中，培養(yǎng)時，將維甲酸(retinoic acid, RA)添加到成熟液中，50 80個卵丘卵母細胞復合物/孔，覆蓋礦物油，于飽和濕度下，38.5° C培養(yǎng)；所述操作液組分為TCMl99 + 5% FBS + 100 IU/ml青霉素+ 0.1 mg/ml鏈霉素；所述成熟液組分為TCM199+10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 IU/ml hCG + 0.1 mg/ml L-半胱氨酸 + 10ng/ml EGF ；(2)卵丘細胞凋亡相關基因表達檢測
成熟培養(yǎng)后的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)透明質(zhì)酸酶液滴中脫去卵丘細胞；收集卵丘細胞置于1.5ml離心管中，離心去上清后，提取卵丘細胞總RNA ;將總RNA反轉(zhuǎn)錄至cDNA ;經(jīng)熒光定量PCR分析凋亡相關基因表達水平；
(3)卵丘細胞凋亡末端標記檢測
成熟培養(yǎng)的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經(jīng)原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測；對于單個卵丘細胞凋亡的檢測，成熟培養(yǎng)的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)透明質(zhì)酸酶消化后，收集卵丘細胞；卵丘細胞離心洗滌后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經(jīng)原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測。作為優(yōu)選，步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為10 nM 1000 nM。作為進一步優(yōu)選，步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為10 nM。作為進一步優(yōu)選，步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為100 nM。作為進一步優(yōu)選，步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為1000 nM。本發(fā)明的有益效果是:
在山羊卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養(yǎng)過程中，添加維甲酸(retinoic acid,RA)能夠有效地抑制卵母細胞外周卵丘細胞的凋亡，進而促進山羊卵母細胞細胞核與細胞質(zhì)的成熟。本發(fā)明為通過抑制卵丘 細胞凋亡促進山羊卵母細胞發(fā)育能力提供了新的研究途徑。
具體實施例方式一、材料與方法
(I)山羊卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養(yǎng)
卵巢采集于屠宰場宰殺的山羊，利用精細鑷和手術刀片分離出2 8mm卵泡中的卵丘卵母細胞復合物；挑取有3 5層致密卵丘包裹的卵母細胞用于成熟培養(yǎng)；挑取的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)操作液(TCM199 + 5% FBS + 100 IU/ml青霉素+ 0.1 mg/ml鏈霉素)清洗后，置于成熟液(TCM199+ 10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 IU/ml hCG + 0.1 mg/mlL-半胱氨酸+ 10ng/ml EGF)中，培養(yǎng)時，將維甲酸(下簡稱RA)分次以10 nM, 100 nM和1000 nM添加到成熟液中，50 80個卵丘卵母細胞復合物/孔，覆蓋礦物油，于飽和濕度下，38.5° C 培養(yǎng)。(2)山羊卵丘細胞凋亡相關基因表達檢測
成熟培養(yǎng)后的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)500 μ I lmg/ml透明質(zhì)酸酶液滴中脫去卵丘；收集卵丘細胞置于1.5ml離心管中，離心去上清后，提取卵丘細胞總RNA ;將總RNA反轉(zhuǎn)錄至cDNA ;經(jīng)熒光定量PCR分析凋亡相關基因表達水平；15 μ I反應體系:0.9 μ I山羊特異性引物，7.5μ1 SYBR Green Supermix 1.5 μ I稀釋的cDNA及5.I μ I水；每個反應至少設3個生物學重復。(3)山羊卵丘細胞凋亡末端標記檢測
成熟培養(yǎng)的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經(jīng)原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測；對于單個卵丘細胞凋亡的檢測，成熟培養(yǎng)的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)透明質(zhì)酸酶消化后，收集卵丘細胞；卵丘細胞離心洗滌后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經(jīng)原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測。(4)統(tǒng)計與分析
所有結果均以平均值土標準差表示；使用SPSS軟件中的t-test對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。P〈0.05表不差異顯著。二、結果
(I)RA促進山羊卵母細胞的成熟
在山羊卵母細胞成熟培養(yǎng)液中，添加RA能夠顯著促進卵母細胞的成熟(p〈0.05)，分次添加10 nM或100 nM或1000 nM RA的山羊成熟培養(yǎng)液中卵母細胞的成熟率分別達到78.68%、76.83%和73.59%,顯著高于未添加RA的對照組65.33%。(2) RA減少山羊卵丘細胞的凋亡
經(jīng)原位末端轉(zhuǎn)移酶標記檢測顯示，未經(jīng)RA培養(yǎng)的卵丘卵母細胞復合物中，卵母細胞外周卵丘細胞呈現(xiàn)大量凋亡，經(jīng)過RA培養(yǎng)后，卵母細胞外周卵丘細胞呈現(xiàn)凋亡現(xiàn)象明顯減少；通過把卵母細胞外圍卵丘細胞消化收集檢測統(tǒng)計后顯示，在成熟培養(yǎng)期間添加RA處理后，分次添加10 nM或100 nM或1000 nM RA的山羊成熟培養(yǎng)液中卵丘細胞的凋亡率分別為5.98%,4.27%和5.26%,顯著低于未添加RA的對照組9.31%(ρ〈0.01)。(3 ) RA促進山羊卵丘細胞抗凋亡基因的表達
實時熒光定量PCR檢測顯示，相對于未添加RA的對照組，卵母細胞在成熟培養(yǎng)期間經(jīng)RA處理2(T22h后，凋亡基因Caspase-8表達水平顯著下調(diào)(10 nM, p<0.05 ；100 nM,p<0.05 ；1000 nM p〈0.01)?？沟蛲龌駼AX表達水平均顯著上調(diào)(10 nM, p<0.05 ；100nM, p<0.01 ；1000 nM p〈0.05)、抗凋亡基因CAT基因表達水平均顯著上調(diào)(10 ηΜ, ρ〈0.05 ;100 nM, p<0.01 ；1000 nM p〈0.01)，及抗凋亡基因BCL-2基因表達水平均顯著上調(diào)(10 nM,p〈0.01 ；100 nM, p〈0.01 ；1000 nM p〈0.05)。以上所述的本發(fā)明實施方式，并不構成對本發(fā)明保護范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的權利要求保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1.山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法，包括以下步驟: (1)卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養(yǎng) 卵巢采集于屠宰場宰殺后的山羊，分離出2 8mm卵泡中的卵丘卵母細胞復合物；挑取有3 5層致密卵丘包裹的卵母細胞用于成熟培養(yǎng)；挑取的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)操作液清洗后，置于成熟液中，培養(yǎng)時，將維甲酸添加到成熟液中，50 80個卵丘卵母細胞復合物/孔，覆蓋礦物油，于飽和濕度下，38.5° C培養(yǎng)；所述操作液組分為TCM199 + 5% FBS +100 IU/ml青霉素+ 0.1 mg/ml鏈霉素；所述成熟液組分為TCM199+ 10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 I U/ml hCG + 0.1 mg/ml L-半胱;氛酸 + 10ng/ml EGF ； (2)卵丘細胞凋亡相關基因表達檢測 成熟培養(yǎng)后的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)透明質(zhì)酸酶液滴中脫去卵丘細胞；收集卵丘細胞置于1.5mI離心管中，離心去上清后，提取卵丘細胞總RNA ;將總RNA反轉(zhuǎn)錄至cDNA ;經(jīng)熒光定量PCR分析凋亡相關基因表達水平； (3)卵丘細胞凋亡末端標記檢測 成熟培養(yǎng)的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經(jīng)原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測；對于單個卵丘細胞凋亡的檢測，成熟培養(yǎng)的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)透明質(zhì)酸酶消化后，收集卵丘細胞；卵丘細胞離心洗滌后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；經(jīng)原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術進行標記，Hoechst細胞核染液孵育；熒光顯微鏡下檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法，其特征在于:所述步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為10 nM 1000 nM。
3.根據(jù)權利要求1所述的山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法，其特征在于:所述步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為10 nM。
4.根據(jù)權利要求1所述的山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法，其特征在于:所述步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為100 nM。
5.根據(jù)權利要求1所述的山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法，其特征在于:所述步驟(I)中添加到成熟液中的維甲酸為1000 nM。
全文摘要
本發(fā)明公開了山羊卵丘細胞體外培養(yǎng)抗凋亡處理方法，包括以下步驟(1)卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養(yǎng)挑取的卵丘卵母細胞復合物經(jīng)操作液清洗后，置于成熟液中，培養(yǎng)時，將維甲酸添加到成熟液中，50～80個卵丘卵母細胞復合物/孔，覆蓋礦物油，于飽和濕度下，38.5°C培養(yǎng)；所述操作液組分為TCM199+5%FBS+100IU/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素；所述成熟液組分為TCM199+10%FBS+10IU/mlPMSG+5IU/mlhCG +0.1mg/mlL-半胱氨酸+10ng/mlEGF；(2)卵丘細胞凋亡相關基因表達檢測(3)卵丘細胞凋亡末端標記檢測。本發(fā)明在山羊卵丘卵母細胞復合物體外成熟培養(yǎng)過程中，添加維甲酸(RA)能夠有效地抑制卵母細胞外周卵丘細胞的凋亡，進而促進山羊卵母細胞細胞核與細胞質(zhì)的成熟。
文檔編號C12N5/075GK103215221SQ201310071009
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月6日 優(yōu)先權日2013年3月6日
發(fā)明者蒲勇, 曹鴻國, 章孝榮, 王張帆, 卞雅尼, 張運海, 劉亞, 李運生, 方富貴, 陶勇 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學