卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎闹谱鞣椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及將卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?，屬于生物與新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]在卵泡中，顆粒細胞(granulosa cells)是圍繞在卵母細胞周圍的細胞，其具有一定的多能性。顆粒細胞有兩種:圍繞著卵母細胞的稱為卵丘細胞(cumulus cells),圍繞著腔的稱為壁顆粒細胞，這兩種細胞都已被高效率地用于動物克隆。盡管如此，顆粒細胞通常作為體外授精或畜牧產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物而被丟棄，未得到應(yīng)有的重視。
[0003]多能性干細胞(pluripotent stem cells)是指具有形成人和動物個體所有類型細胞的多向分化潛能、可以不斷自我更新的一類細胞。由于多能性干細胞的多向分化潛能和自我更新的特性，使其在細胞替代治療、基因治療、發(fā)育生物學(xué)研究、藥理及毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究中有著其獨特的作用和優(yōu)越性。
[0004]誘導(dǎo)多能性干細胞(induced pluripotent stem cells, iPS細胞)是通過在分化的體細胞中表達特定的幾個轉(zhuǎn)錄因子，以誘導(dǎo)體細胞的重編程而獲得的可以不斷自我更新(self-renewal)且具有多向分化潛能的細胞。由于iPS細胞既避免免疫排斥,又不涉及倫理道德問題，因此具有廣泛且重要的臨床應(yīng)用價值。到目前為止，iPS細胞幾乎可以由各種各樣的前體細胞獲得，而以卵巢顆粒細胞作為前體細胞，將其轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎麆t有它獨特的優(yōu)勢。首先，顆粒細胞的來源廣泛。在畜牧產(chǎn)業(yè)中，顆粒細胞可以在屠宰場中大量取得，同時顆粒細胞也是體外授精的副產(chǎn)物，那些在體外授精中被丟棄的顆粒細胞可以被收集起來進而獲得病人特異性的iPS細胞。第二，卵巢顆粒細胞作為前體細胞具有更高的誘導(dǎo)效率。在對小鼠和豬的卵巢顆粒細胞的研究中，我們發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細胞具有一定的多能性(“干性”)，而前體細胞的“干性”能夠推動重編程，表現(xiàn)在其更高的誘導(dǎo)效率以及需要更少的重編程因子。我們成功地將小鼠的卵巢顆粒細胞高效的轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎膶嶒炓沧C實了這一觀點。第三，由卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變而來的多能干細胞具有更高的安全性。傳統(tǒng)的誘導(dǎo)iPS細胞的手段是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體向成纖維細胞中導(dǎo)入0Ct4、SOX2、Klf4、C-MyC (也被稱為Yamanaka因子)4個重編程因子以誘導(dǎo)其重編程，但這種方法得到的iPS細胞存在安全性的問題，特別是這些因子潛在的致癌作用以及外源因子的整合。減少因子可以提高iPS細胞的安全性。以小鼠和豬為例，我們發(fā)現(xiàn)它們的卵巢顆粒細胞中均內(nèi)源性表達高水平的多能性基因。如果利用顆粒細胞中重編程因子的內(nèi)源性表達從而減少因子的導(dǎo)入或者采用小分子化合物對卵巢顆粒細胞進行轉(zhuǎn)變，對iPS細胞臨床應(yīng)用的安全性將是一個提高。我們在小鼠卵巢顆粒細胞的實驗中也證實了這一點。第四，將卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎膽?yīng)用前景非常廣泛。將卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎诮M織工程、再生醫(yī)學(xué)、獲得病人特異性的多能干細胞、腫瘤治療等人醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用，以及畜牧產(chǎn)業(yè)、轉(zhuǎn)基因動物等方面具有巨大的應(yīng)用潛能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是以卵巢顆粒細胞作為前體細胞，將其轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?br>[0006]在本發(fā)明中，首先分離卵巢顆粒細胞并使其貼壁，然后采用重編程因子對其進行誘導(dǎo)或者小分子化合物對其進行轉(zhuǎn)變。通過誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)變，挑取克隆培養(yǎng)與鑒定，鑒定的內(nèi)容包括多能性標(biāo)志的表達、內(nèi)源多能性基因激活、外源基因沉默、具有體內(nèi)(畸胎瘤形成)與體外(擬胚體分化)的分化能力等。
[0007]在本發(fā)明中，卵巢顆粒細胞可以高效率地轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?，顯著提高了多能干細胞的誘導(dǎo)效率、安全性與應(yīng)用性。
【附圖說明】
[0008]圖1為貼壁培養(yǎng)的小鼠的卵巢顆粒細胞。
[0009]圖2為由小鼠卵巢顆粒細胞誘導(dǎo)而來的多能干細胞(mGCiPS)的形態(tài)及其多能性標(biāo)志的免疫熒光檢測。檢測結(jié)果為陽性。
[0010]圖3為逆轉(zhuǎn)錄PCR對mGCiPS細胞中內(nèi)、外源基因表達的檢測。表明mGCiPS中內(nèi)源多能性基因激活，外源基因沉默。
[0011]圖4為mGCiPS體外分化形成的擬胚體以及免疫熒光對其三胚層標(biāo)志的檢測。檢測結(jié)果表明形成的擬胚體具有三胚層的分化產(chǎn)物。
[0012]圖5為注射入裸鼠皮下的mGCiPS細胞形成的畸胎瘤。
[0013]圖6為mGCiPS形成的畸胎瘤的切片的HE染色，其中含有三胚層的分化產(chǎn)物。
[0014]圖7為mGCiPS細胞形成的嵌合體小鼠。
[0015]圖8為貼壁培養(yǎng)的豬的卵巢顆粒細胞。
[0016]圖9為由豬卵巢顆粒細胞誘導(dǎo)而來的多能干細胞(pGCiPS)的形態(tài)。
[0017]圖10為由豬卵巢顆粒細胞誘導(dǎo)而來的iPS細胞(pGCiPS)的多能性標(biāo)志的免疫熒光檢測。檢測結(jié)果為陽性。
【具體實施方式】
[0018]將卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎姆椒梢詮V泛應(yīng)用于人、小鼠、豬等物種。我們的方法已經(jīng)成功應(yīng)用在了小鼠和豬上，同時，在小鼠和豬上的成功也驗證了我們的方法。
[0019]分離卵巢顆粒細胞，貼壁后通過重編程因子或小分子化合物將其轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄苄愿杉毎?。對得到的多能干細胞進行鑒定，包括內(nèi)源多能性基因的激活與外源基因的沉默、多能性標(biāo)志的表達、具有體內(nèi)分化(形成畸胎瘤)與體外分化(擬胚體分化)的能力，具有形成嵌合體以及生殖系轉(zhuǎn)移的能力等。獲得的多能干細胞可以廣泛應(yīng)用于人醫(yī)學(xué)臨床、轉(zhuǎn)基因應(yīng)用等方面。
【主權(quán)項】
1.卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?，其特征在?包括卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)和卵巢顆粒細胞向多能干細胞的轉(zhuǎn)變兩個步驟: (1)卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng):取卵巢，通過分離與貼壁獲得高純度的卵巢顆粒細胞。 (2)卵巢顆粒細胞向多能干細胞的轉(zhuǎn)變:采用重編程因子或小分子化合物等手段將卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?br>2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?，其特征在?前體細胞為卵巢顆粒細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?，其特征在?采用重編程因子或小分子化合物等手段將卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?br>【專利摘要】本發(fā)明是以卵巢顆粒細胞作為前體細胞，將其轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?。該發(fā)明是將卵巢顆粒細胞分離貼壁后，采用重編程因子或小分子化合物等手段將其轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎Ｔ谛∈蟮膶嵺`中，我們成功地將小鼠的卵巢顆粒細胞高效率地轉(zhuǎn)變成了真正的多能干細胞。在豬的實踐中，我們也高效率地獲得了較好的多能干細胞系。卵巢顆粒細胞具有來源廣泛、重編程效率高等特點，由之而來的多能干細胞具有更高的安全性，在人醫(yī)學(xué)臨床具有巨大的應(yīng)用潛能。本發(fā)明具有高效、經(jīng)濟、安全性好、應(yīng)用前景廣泛等優(yōu)點。
【IPC分類】C12N5-10
【公開號】CN104745532
【申請?zhí)枴緾N201310750746
【發(fā)明人】毛劍, 張倩, 葉孝穎, 劉鍇, 劉林
【申請人】南開大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年12月25日