一種裸卵小鼠生產(chǎn)方法
【專利說(shuō)明】一種裸卵小鼠生產(chǎn)方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種裸卵小鼠生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0003]卵巢是卵子產(chǎn)生的發(fā)源地，卵子是自然界新生命誕生的重要生殖細(xì)胞。在自然狀態(tài)下，卵巢內(nèi)的卵子被周圍大量的卵丘細(xì)胞包裹，卵丘細(xì)胞對(duì)于卵子的成熟質(zhì)量和發(fā)育潛力發(fā)揮重要的影響。在現(xiàn)代社會(huì)中，伴隨著面對(duì)各種生存壓力的競(jìng)爭(zhēng)和人類體質(zhì)的下降，卵子周圍的卵丘細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和衰退，卵巢中形成大量裸卵，這也就是所熟知的早衰。在正常情況下，這些卵巢中的裸卵不能正常成熟，也不能同精子結(jié)合誕生出新的生命個(gè)體和后代。在現(xiàn)代不孕不育的人群和動(dòng)物個(gè)體中，這樣的群體占據(jù)較高的比例。因此，生殖健康日益成為人類所面臨的重要問(wèn)題。同時(shí)，在現(xiàn)代畜牧業(yè)中人類要求高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的畜產(chǎn)品，這些需要高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的家畜群體，優(yōu)秀家畜群體的培育尤為重要。機(jī)體體細(xì)胞能夠在體外誘導(dǎo)形成干細(xì)胞，干細(xì)胞等相關(guān)生物育種技術(shù)已迅速發(fā)展和成熟，干細(xì)胞在體外能夠誘導(dǎo)發(fā)育形成裸卵，因此，體細(xì)胞來(lái)源的裸卵能夠誕生出新個(gè)體將會(huì)為家畜育種現(xiàn)代化的發(fā)展提供重要平臺(tái)和保障。
[0004]小鼠作為研宄生殖發(fā)育的重要?jiǎng)游锬Ｐ?，如何使小鼠裸卵完全在體外培養(yǎng)條件下發(fā)育成熟，成熟的裸卵能夠進(jìn)行體外受精和誕生出正常新生的小鼠個(gè)體，是一個(gè)值得研宄的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種裸卵小鼠生產(chǎn)方法。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種裸卵小鼠生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
(O小鼠裸卵的體外發(fā)育
取小鼠卵巢，用注射器針頭刺破卵巢上卵泡，卵泡中卵母細(xì)胞釋放到卵母細(xì)胞操作液中；挑選裸卵體外洗滌后，放入含50 μΜ Forskolin的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中，裸卵在含50 μM Forskolin的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 h后，轉(zhuǎn)移至含2.5μΜ ΗΗ66285的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)體外培養(yǎng)16 h ；
(2)小鼠裸卵胚胎的體外發(fā)育
取經(jīng)過(guò)成熟培養(yǎng)排出第一極體的裸卵，在HTF受精液與獲能精子體外共同孵育培養(yǎng)6h，挑選排出第二極體或形成雌雄原核的受精卵，在G-1 PLUS培養(yǎng)液中培養(yǎng)，成熟裸卵體外受精發(fā)育至2-細(xì)胞階段時(shí)，移植發(fā)育至2-細(xì)胞階段的小鼠裸卵胚胎于代孕小鼠輸卵管中，飼養(yǎng)代孕小鼠于胚胎移植20天后獲得裸卵小鼠。
[0007]作為優(yōu)選，卵母細(xì)胞操作液為含HEPES和10% FBS的TCM199。
[0008]作為另一個(gè)優(yōu)選，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液為SAGE? In-Vitro Maturat1n Media。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:
在體外環(huán)境條件下，利用Forskolin和HH66285模擬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中自然發(fā)育模式進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，在沒(méi)有外源卵泡發(fā)育激素的作用下，F(xiàn)orskolin和HH66285聯(lián)合應(yīng)用能夠使小鼠裸卵完全在體外培養(yǎng)條件下發(fā)育成熟，成熟的裸卵能夠進(jìn)行體外受精和誕生出新的小鼠個(gè)體，小鼠裸卵誕生出新生小鼠的產(chǎn)仔率能夠達(dá)到11.11%，新生裸卵小鼠發(fā)育正常。
【具體實(shí)施方式】
[0010]一種裸卵小鼠生產(chǎn)方法，具體步驟如下:
(O小鼠裸卵的體外發(fā)育
取小鼠卵巢，用注射器針頭刺破卵巢上卵泡，卵泡中卵母細(xì)胞釋放到卵母細(xì)胞操作液中，卵母細(xì)胞操作液為含HEPES和10% FBS的TCM199 ;挑選裸卵體外洗滌后，放入含50 μ MForskolin的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液SAGE? In-Vitro Maturat1n Media中，裸卵在含50 μ MForskolin的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 h后，轉(zhuǎn)移至含2.5μΜ TO166285的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液SAGE? In-Vitro Maturat1n Media中繼續(xù)體外培養(yǎng)16 h ；
(2)小鼠裸卵胚胎的體外發(fā)育
取經(jīng)過(guò)成熟培養(yǎng)排出第一極體的裸卵，在HTF受精液與獲能精子體外共同孵育培養(yǎng)6h，挑選排出第二極體或形成雌雄原核的受精卵，在G-1 PLUS培養(yǎng)液中培養(yǎng)，成熟裸卵體外受精發(fā)育至2-細(xì)胞階段時(shí)，移植發(fā)育至2-細(xì)胞階段的小鼠裸卵胚胎于代孕小鼠輸卵管中，飼養(yǎng)代孕小鼠于胚胎移植20天后獲得裸卵小鼠。
[0011]以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種裸卵小鼠生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟: (O小鼠裸卵的體外發(fā)育 取小鼠卵巢，用注射器針頭刺破卵巢上卵泡，卵泡中卵母細(xì)胞釋放到卵母細(xì)胞操作液中；挑選裸卵體外洗滌后，放入含50 μΜ Forskolin的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中，裸卵在含50 μM Forskolin的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 h后，轉(zhuǎn)移至含2.5μΜ ΗΗ66285的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)體外培養(yǎng)16 h ； (2)小鼠裸卵胚胎的體外發(fā)育 取經(jīng)過(guò)成熟培養(yǎng)排出第一極體的裸卵，在HTF受精液與獲能精子體外共同孵育培養(yǎng)6h，挑選排出第二極體或形成雌雄原核的受精卵，在G-1 PLUS培養(yǎng)液中培養(yǎng)，成熟裸卵體外受精發(fā)育至2-細(xì)胞階段時(shí)，移植發(fā)育至2-細(xì)胞階段的小鼠裸卵胚胎于代孕小鼠輸卵管中，飼養(yǎng)代孕小鼠于胚胎移植20天后獲得裸卵小鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裸卵小鼠生產(chǎn)方法，其特征在于，所述卵母細(xì)胞操作液為含HEPES 和 10% FBS 的 TCM199。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裸卵小鼠生產(chǎn)方法，其特征在于，所述卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液為 SAGE? In-Vitro Maturat1n Media。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種裸卵小鼠生產(chǎn)方法，包括小鼠裸卵的體外發(fā)育和小鼠裸卵胚胎的體外發(fā)育兩大步驟。本發(fā)明在體外環(huán)境條件下，利用Forskolin和PD166285模擬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中自然發(fā)育模式進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，在沒(méi)有外源卵泡發(fā)育激素的作用下，F(xiàn)orskolin和PD166285聯(lián)合應(yīng)用能夠使小鼠裸卵完全在體外培養(yǎng)條件下發(fā)育成熟，成熟的裸卵能夠進(jìn)行體外受精和誕生出新的小鼠個(gè)體，小鼠裸卵誕生出新生小鼠的產(chǎn)仔率能夠達(dá)到11.11%，新生裸卵小鼠發(fā)育正常。
【IPC分類】A01K67-027, C12N5-073
【公開(kāi)號(hào)】CN104726397
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510113691
【發(fā)明人】張飛, 曹鴻國(guó), 牛夢(mèng)涵, 賈鏞, 章孝榮
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年3月16日